全 文 ： 生物技术通报
# 技术与方法# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 2期
毛细管电泳在基因研究中的应用*
方梅1 胡波1 侯媛媛1 肖丹2
( 1四川大学药学院,成都 610041; 2四川抗菌素工业研究所,成都 610051)
摘 要: 讨论用于基因研究的各种方法, 并指出毛细管电泳技术的优点。评述毛细管电泳( CE)用于基因分
析的原理,详细介绍毛细管电泳在基因研究中的应用新进展。展望 CE 及其在基因研究的应用前景。
关键词: 毛细管凝胶电泳 基因分析 毛细管电泳阵列 芯片毛细管电泳
The Application of Capillary Electrophoresis to Gene Analysis
Fang M ei
1 Hu Bo1 H ou Yuanyuan1 Xiao Dan 2
( 1 Phar maceut ic al c ol l ege of S ichuan Univ er si t y , Ch engdu 610041;
2 S ichuan indu str ial inst itut e of A nt ibiot ic s , Chengdu 610051)
Abstract: Several methods used for g ene researches w ere discussed and the advantages of capillary elect ropho-
resis techniqe w ere pointed out. T he pr iciple of t he CE application to gene analysis and the new development in 21th
century were review ed. The futur e trends w re discussed.
Key words: Capillary g el electr opho resis Gene analysis Capillary arra y electropho resis Chip electr opho re-
sis
1 引言
作为一种高效能的分析方法的毛细管电泳
( CE)
[ 1]用于基因研究是一热点。人们关注身体健
康并不断地与各种疾病作斗争。如新药物的筛选就
是其中一例。根据疾病机理, 选择特定生物分子作
为靶标进行筛选,一般有两种模式:一种是直接检测
化合物对受体、酶、离子通道、抗体的作用;一种是检
测化合物作用于细胞后基因(表达)的变化。毛细管
电泳是它们的强有力工具。作为药靶, 蛋白(亦称基
因表达产物)也许是最直接和最佳的靶分子[ 2] 对蛋
白质组学的研究还处于起步阶段,而对基因的研究
甚多。在目前, 对基因的研究尚须强化和完善。
CE 用于基因分析的文章散见于 Anal. Chem . ,
The Analyst [ 2a] , Elect ropho resis, Chem Pharm
Bull ( T okyo ) Genet Med, Clin Chem, Genomics,
Clin Chim Acta, Genome Res, Biotechno l. 等期刊。
已研究的内容涉及到 DNA 的序列分析,用 DNA 标
准品法分析 PCR 产物的纯度, CE 的 DNA 片段多
态性分析用于法庭的个体鉴定。选择对照体系, 采
用 CE 进行基因表达研究等[ 3~ 9]。就毛细管电泳在
基因分析中的应用作评述[ 10~ 12] 。
2 基因研究原理
人的 DNA(脱氧核糖核酸)总和就是人类基因
组,它分布于 24对大小不同、形状各异、各有特点的
棒状染色体上。一个染色体是由一个 DNA 分子组
成。24条染色体中有 22条为常染色体, 两条为性
染色体, 即 X染色体与 Y 染色体。核酸分子是由许
多个核苷酸通过磷酸二酯键聚合而成的高分子。一
个核苷酸是由一分子五碳糖、磷酸、含氮有机碱(碱
基)缩合而成。碱基主要有: 腺嘌呤 ( A )、鸟嘌呤
( G)、胞嘧啶( C)、胸腺嘧啶( T )。DNA 的两条核苷
酸链靠彼此碱基之间形成的氢键而结合在一起。A
只能与 T 相配对, G与 C 相配对, 上述碱基之间配
对原则,称为碱基互补。其中配对的 A ) T , G ) C
称为碱基对。一个基因一种蛋白, 即 DNA 分子中
一段核苷酸链,如果决定一个/单位0的遗传信息,就
收稿日期: 2005-11-26
* 基金项目:国家自然科学基金项目,批准号: 20475038
作者简介:方梅,女,副教授
被称为一个基因。DNA 按碱基互补原则被转录为
单链的信息 RNA, 后者按照三联密码子,作为合成
蛋白的指令。/人类基因组计划0 ( human genome
pro ject) 的核心是测定基因组的全部 DNA 序列。
人是高级动物, 人类基因组的碱基个数高达
3 000M b(当然, 从大麦看, 其基因组的碱基个数高
达 120 000Mb) ,不同人的基因组存在差异(即单核
苷酸多态性) ,且每个基因有两个拷贝的组合, 故人
存在大的遗传多态性。比如, 有的人患有遗传性疾
病,像肌营养不良症(这些可通过产前 DNA 诊断)
另外,由于外界环境变化,使基因突变而表现出蛋白
质的变化, 这样的研究也是有意义的。如大肠癌患
者的 p53基因就存在突变。又比如对于农产品, 若
发现优良的变异农产品, 可通过基因鉴定,然后实行
基因重组而得到改良的目标新品种。患肝炎的病人
可检测到其被肝炎病毒传染的基因。
从具体的组织细胞中提取 mRNA 进行基因研
究,更具有现实意义。生物体从受精卵开始, 经过细
胞分裂、分化,发育成不同类型的细胞, 个体经历生
长、发育、成熟、死亡的过程。受精卵细胞最初是进
行分裂和繁殖, 然后它又分化成体内执行各种生理
功能的细胞 (如胃分泌胃酸)。这一新陈代谢的过
程,受控于基因表达,分化的细胞内仍然还有一套完
整基因组,但表达的基因种类和数量以及相对丰度
都有差别。DNA 转录为 mRNA, 转录水平的调控
是大多数基因表达调控的关键所在。基因表达研究
可包罗通过基因对生物体进行时、空、位置研究。目
前肿瘤被认为是基因的过度表达, 癌细胞迅速繁殖。
3 CE及其应用于基因分析的原理
对于基因的研究可使用芯片技术[ 13] 及凝胶平
板电泳。伴随核酸化学合成技术(如随机合成长度
达 16个碱基的寡核苷酸混合液)的发展, 前者利用
杂交过程,有可对同类样品同时分析或不同类样品
同时筛选的优点(集成度高达 10万点/ cm2 芯片, 全
长 cDNA 文库构建) , 但其使用的荧光检测有对类
似物选择性不佳的弱点。后者能先将核酸片段分
离,然后荧光检测, 测定更具准确性,但它用于同时
分析的基因样品数量有限。
相比之下, CE 是一种具有高分离效率, 快速的
分析技术。理论上讲, 核酸大分子用 CE 分离具有
高效率。将样品间隔一定时间不断进样, 一次运行
分析,可提高样品的批次处理量,毛细管电泳列亦有
如此功效。CE 是一种样品用量很低的方法(芯片
毛细管电泳用量更低) , 聚合酶链反应( PCR)技术
(它又称无细胞克隆系统或特异性 DNA 序列体外
定向酶促扩增法。寡核苷酸引物与模板的杂交决定
了 DNA复制合成的起点, 而新合成的单链也可做
下一轮反应的模板,经多次循环, 可使 DNA 或 mR-
NA 的数目按 2n 次指数大增。) , 配合以对 PCR引
物进行荧光标记可实现对极微量 mRNA 选择性准
确测定。
与板凝胶电泳相比较,毛细管电泳具有的优越
性是:毛细管具有优异的传热性能,可以施加更高的
电场强度。毛细管电泳 ( capillary elect rophor esis)
是以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道, 根据
样品各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分
离目的的一类液相分离技术。
毛细管电泳有多种分离模式, 即毛细管区带电
泳 ( CZE ) , 胶 束毛 细管区 带电 泳 ( MECC o r
MEKC) ,毛细管凝胶电泳( CGE) , 毛细管无胶筛分
电泳,毛细管等电聚焦电泳( CIEF)和毛细管等速聚
焦(浓缩)电泳( CITF)等方法。
对于核酸线性分子分析, 因每个核苷酸残基上
有磷酸基团, pH > 7时,其电荷大于其它碱基上的
电荷,分子量大小不同的 DNA 有恒定的电荷/质量
比,对此, 不能用 CZE 分析之。分析 DNA 大多使
用毛细管凝胶电泳( CGE )模型。CGE 所用的凝胶
制备方式总体可分为两大类, 化学胶和物理胶。化
学胶是指交联的凝胶或化学键合到管壁上的交联凝
胶。物理胶则指粘度较高的高分子溶液, 包括/无胶
筛分0所用的聚合物溶液。前者有用聚丙烯酰胺
( PA)、葡聚糖、琼脂糖、烷基纤维素等的报道。用化
学胶分离大的寡核苷酸可得到最高的分离度和柱效
(几千万塔板数/ m) , 但制备困难,使用时容易产生
空泡而导致分离失败。后者简单地用改变聚合物溶
液浓度的办法来达到调节 DNA 的分离(平板凝胶
电泳就无法用此法)。聚合物溶液以粘度不要太高
为宜。关于 CE分离 DNA 的聚合物溶液的评述可
参见 [ 14] 。没有任何单个模型能完全计算 DNA 淌
度(分子尺寸)和实验参数(场强、凝胶浓度等)间的
612006年第 2期 方梅等: 毛细管电泳在基因研究中的应用
关系。常用的两种模型为 Ogston理论和 Reptat ion
模型。寡核苷酸是大分子, 与高分子聚合物有亲和
相互作用,但它与小分子作添加剂的毛细管电泳有
不同。高分子聚合物溶液能使寡核苷酸分离。对于
具点突变的单链 DNA 来讲, 一个碱基的改变就会
引起整个链构象(核苷酸的二级结构)较大的变化,
从而使毛细管电泳可在非变性的条件下分离它们
( CE-SSCP, single-str and conformat ion polymor-
phism analysisby capillary elect rophoresis)。而对
于分子大小相同的 dsDNA, CGE 将之分离较为困
难,但加入嵌入染料溴化乙锭( EB)之后, 由于其与
dsDNA碱基特异的结合作用, CZE 也能将 dsDNA
分离。在一定变性剂浓度的凝胶上电泳时, 当正常
的双链 DNA 分子和发生突变的 dsDNA 分子之间
即使只有一个碱基对的差异时, 也会在不同时间发
生部分解链,导致电泳迁移率下降,从而被分离成两
条带。除上述使用变性剂,利用核苷酸链的杂交(碱
基配对)原理分离外, 利用可控制变温的装置, 也能
用毛细管电泳分离 dsDNA, 反映出温度的影响 [ 15]。
另一办法是把正常的基因和突变基因的混合物经加
热变性后再复性进行电泳,将得到 4个分离峰(如果
用AB代表野生型基因, A/ B/代表突变型基因的纯
合型,那么 AB/和 A/ B 就是异源双链基因型)。这
样可判断是否有碱基突变基因(对照于正常基因)存
在。
DNA 的序列分析要用到毛细管电泳方法。采
取的战略是比长测序[ 15]。切点的识别涉及到四阵
列毛细管电泳(需要保障: 电泳迁移时间高的重复
性) , (一次分离)四通道荧光检测(需要保障: 各核苷
酸残基的电泳迁移时间彼此差大)。阵列毛细管电
泳系统可分为两大类,一类采用扫描光学检测器, 另
一类采用 CCD(激光诱导荧光电荷耦合器件)检测
器。扫描检测系统与商品板凝胶 DNA 测序中所使
用的扫描检测相类似,均面临光学扫描的根本限制。
因检测器须连续应答每支毛细管信号, 巡回检测效
率低。阵列毛细管电泳配备 CCD检测器,由于对所
有毛细管同时检测,从根本上消除了巡回扫描检测
带来的障碍。芯片阵列毛细管电泳,更有利于大批
量样品分析(如人类基因组大规模 DNA 测序)。试
剂消耗少,测序费用低,测序速度高。此起源于1992
年,有人首次用微电子刻蚀技术, 在玻片( chip)上研
制出芯片毛细管电泳( integ rated chip-based capi-l
lary electr ophor esis)装置, 分离混合荧光物质。此
微型化技术将试样制备、进样、分离和检测等系统组
合在 2~ 3cm 玻片上, 实现了现代分析化学向微型
化、集成化、一体化和自动化发展趋势。
在 CE 检测方面, 分析 DNA 可用紫外检测, 对
200bp的 DNA 片断的最小检测浓度为 0. 5mg/ L。
但对于生物样品中和在许多其它成分共存的痕量物
质测定时,或对于特殊分析(如 DNA 序列测定)时
就使用激光诱导荧光检测器( L IF)。LIF 一般用于
DNA 分析,可达 zmol范围。除了 488nm 的氩离子
LIF 已实现商用外,最近还出现了商用 625nm 的半
导体 LIF ,此时生物样品中基质的荧光背景大大减
弱。用荧光摄像显微镜可监测到单个 DNA 分子在
电场作用下通过凝胶进行筛分的情景[ 16]。亦有报
道:将单聚及二聚染料( T OTO, YOYO )用于 DNA
分析,研究了荧光染料和 DNA 分子结合及其 对分
离的影响。有时过量的荧光染料须预除去。
CGE所用缓冲液的 pH 多在 7~ 8, DNA 带负
电荷。固用 CE对 DNA 进行分析需将电极极性反
转。核苷酸大分子由于疏水作用易吸附于毛细管
壁,故涂层和未涂层毛细管对 DNA 分离的影响也
有研究报道。非永久性涂层毛细管的使用有简便、
寿命长的优点。在进样方面,用 CE分析小分子时,
电动进样有进样歧视现象, 但对 DNA 片断各组分
则无歧视现象。一般说来,电动进样比气压进样能
产生更高柱效的峰。对于化学凝胶柱只能使用电动
进样。
4 CE用于基因研究新进展
Ki, S. P .等[ 17]用毛细管电泳测定核苷酸: 取干
燥的野生冬虫夏草或当归或人工栽培冬虫夏草的菌
丝体样品 1g, 在索氏萃取器中用无水乙醇萃取 6h,
将萃取液蒸干, 残渣用 25mlH 2O 溶解。用毛细管
电泳分别分离并检测了上述三种样品中的三种核
苷:腺苷( I)、鸟苷( Ò)和尿嘧啶 ( š)进行, 运行条
件:熔融石英柱( 57cm @ 75um , 有效长度 50cm) ,电
压为 20KV, 0. 2mM 硼酸/ 0. 5mMNaOH 缓冲液,
pH= 8. 5, 254nm 处检测。Ñ Ò Ó三种核苷标液的
线性范围分别为 4~ 580, 3~ 480, 3~ 480ug / m l。保
62 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 2期
留时间和峰面积的 RSD分别为 0. 97~ 1. 6 和 4~
7. 7%。并对结果进行讨论。另外, Qurishi, R.
等[ 18]建立了一种简单快速的通过毛细管区带电泳
分析核苷酸的方法。此方法采用中性毛细管和反电
压极性模式, 对核苷酸有良好的分辨率,并在 5m in
内快速分析。采用样品电动进样 ( 6kV 的电压,
30s) , 254nm 处测定吸光度值, 缓冲液 pH = 7. 4。
此方法对 AT P, U DP 和 UT P 的检测范围是 0. 14~
0. 28Lm。此方法被用于考察和药理学研究的商业
的核苷酸纯度。此外, 此分析方法还被应用于研究
细胞链中核苷酸的代谢, 如线神经细胞瘤,神经胶质
瘤杂交细胞( NG108-15) ,这是由于以上细胞含有嘌
呤和嘧啶敏感的核苷酸受体, A TP, UDP 和 UT P
要与它们结合。该方法还可使用于监测磷酸激酶的
酶研究,该酶要转变三磷酸核苷酸为二磷酸核苷酸。
单细胞成分分析是对生物体的微区分析, 对生
物学的研究有重要意义。Zabzdy r, J. L 等[ 19] 报道了
单细胞激光诱导荧光的毛细管电泳用于监测单细胞
中基因表达, 使用反转录-酶链聚合反应 ( RT-
PCR) , 增大被测基因的量。使用一项羟丙基纤维素
作筛分基质的技术被用于 CE 对大小DNA的分离,
具体用于单个淋巴节细胞(前列腺癌细胞)中B-肌纤
蛋白基因的表达(B-actin expression)的测定。扩增
的 DNA 上标记的溴菲啶红荧光被用于检测, 带着
高灵敏度。使用冷冻 ) 解冻法溶解单细胞, 检测的
信噪比为 77+ 27( n= 2)。使用稀的十二烷基硫酸
钠( SDS)的化学方法溶解细胞, 信噪比仅为 26+ 2
( n= 2) , 这可能是由于 SDS使 PCR酶分解,带入干
扰信号。此法灵敏度高, 一个初始的限量检查(并不
被认为是最优化的条件下)计算是:检测 133个启动
大分子(原始未扩增的 B-act in mRNA)。等[ Mon-i
to ring dif ferent ial synthesis of RNA in indiv idual
cells by CE. Han, f. ; L illard, S. J. / Anal. Bio-
chem. , 1 M ar 2002, 302( 1) , 136-143. ]运用毛细管
电泳对单细胞中的 RNA 差异合成进行监控: 毛细
管电泳被应用于测定单个仓鼠卵细胞中的 RNA。
细胞被注入毛细管, 被稀释的表面活性剂溶解,其中
的 RNA 组分被毛细管电泳分离, 并用激光诱导荧
光进行检测。作者建立了细胞培养、同步化分析和
RNA 鉴定的方法学, 并进行了讨论。此方法可被运
用到细胞增殖循环的不同时期。
McInto sh, S. L . 等 [ 20] 首次发展了在毛细管电
泳分析中使用频域荧光寿命飞行多道检测分析
DNA 限制性片段。片段被标记以单体的嵌入染料,
而可被氩离子激光器的 488nm 或 514nm 线激发,
寿命在 0. 5~ 0. 25ns之间。我们可以利用多通道寿
命检测,在 CE 的一次运行中对一 DNA限制性片段
水解液和一 DNA 体积梯度片段液进行分析( DNA
片段短于 700bp)。不同的凝胶缓冲系统,包括一种
改性的聚丙烯酰胺凝胶和几种 Tris-硼酸盐-ED-
TA/羟乙基纤维素( T BE/ HEC)凝胶,经过考察, 对
于电泳分离和寿命检测最好的效果是包含 1%高分
子量( 90 000~ 105 000) HEC 和 0. 3%低分子量( 24
000~ 27 000) HEC的 TBE缓冲液。He, H . 等[ 21]建
立了多通道方法用于 DNA 序列测定中标记 DNA
片段的检测:在一次的毛细管电泳分离中,用飞行变
频区荧光寿命检测来识别被标记的 4种末端碱基。
评估两个 4碱基标记体系, 一个建立于激发 488nm
处,一个建立于 514nm 处。488nm 检测方法证明能
有效地进行四极衰减荧光检测。无论从测序反应的
混合物的的三维的荧光寿命-波长-时间谱图(取其
荧光寿命-时间)还是通过三维荧光寿命-波长-时间
谱图(取其荧光寿命-波长图)识别出每种碱基。后
面一种方法更准确(对检测 2种碱基有超过 99%的
准确度,对检测 3种碱基有 98. 5% 的准确度, 对同
时检测 4 种碱基并不适用 ) , 而且可测序更长的
DNA 链。第一种方法碱基长度范围在 41~ 220的
DNA 片段测序的准确度达到 96%。Endo, Y.
等[ 2 2]报道了经过优化的毛细管阵列电泳可在从高
到低逐步改变电场强度的情况下提高对标记末端
DNA 的 DNA 测序法的测序准确度和阅读长度。
因为通过改变电场强度,会发现新的峰,分离的选择
性提高。使用建立在芯片上分析单核苷酸多态性的
实验条件,当加入丙三醇和 MES,聚合酶链反应所
得单链 DNA 的电泳分离效果加强了。
Odin, E.等[ 23] 发展了一项直接和自动的聚合酶
链反应后的检测系统,此方法可同时对人体 9种癌
症相关基因进行相对的基因表达水平测定(将直肠
瘤与正常粘膜比较)。从人直肠瘤或正常粘膜取活
体,将之快速冷冻,制备全 RNA(包含了 mRNA )的
632006年第 2期 方梅等: 毛细管电泳在基因研究中的应用
基因并转录成互补核糖核酸( cDNA) , 再通过它们
的引物对分别用聚合酶链反应放大成研究基因表达
所需用量的基因。共有 4 种荧光染料使用, 标记在
上游引物。PCR 的产物混合并加入由同一种荧光
剂染色的 Gene Scan- 500 ( Perkin-E lmer) 标准品
(其碎片碱基数在 35~ 500个之间) ,将样品注入毛
细管中进行凝胶电泳分离测定。由于研究物是与标
准品在一次的电泳运行中,避免了若二次电泳运行,
迁移时间重现性差带来的对照法识别基因的困难。
由于采用了多色荧光染色标记得以实现。电泳-荧
光技术保障了基因研究的准确性大增。病人的B-肌
纤蛋白也随样作为参照基因测定,计算癌症相关基
因表达丰度。作者发现自动毛细管凝胶电泳及多色
检测方法对聚合酶链反应放大 DNA 的分离和定量
有高速和高重现性的优点。V alenzuela, M. T 等 [ 24]
报道了毛细管电泳用于 DNA 辐射伤害的检测, 脱
噬作用和坏死。细胞凋亡是一种自然的细胞死亡现
象,同时它也通过不同的基因表达(如基因过度表
达)直接调控肿瘤发生。这种现象常用于研究癌细
胞的辐射和化学敏感性治疗癌症。细胞凋亡与细胞
坏死不同, 后者常是细胞受外伤的结果。但二者有
一定的相同、联系,如毒素可导致细胞坏死或者细胞
凋亡,毛细管电泳是一种优良的技术,就可以对此分
型。通过毛细管凝胶电泳( CGE )可以快速有效地
分离限制 DNA 片段等用之区分细胞凋亡产生退变
DNA 还是细胞由于离子化辐射产生随机 DNA 碎
片。
Ronai, Z. 等[ 25] 显示了毛细管凝胶电泳运用于
快速、高分离 DNA 片段和微量制备 DNA 片段(用
于进一步处理)毛细管凝胶电泳柱, 柱温为 25 e ,
DNA 样品用电动进样( 6Kv, 10~ 60s) ,采用 254nm
处紫外检测或者激光诱导荧光检测,采用阳极端检
测。
Huang, M . F . 等 [ 26]将不同浓度的聚合溶液分
别置于聚乙烯管瓶中, 通过逐步注入毛细管来采入
具有浓度梯度的聚合溶液。样品采用电动进样
( 1KV, 5s)入毛细管( 40cm @ 75Lm, i. d. ; 30cm 到检
测器) , 分离使用含 0. 1 ~ 2Lg / ml 的溴乙菲锭和
1. 5% ~ 2. 5%台阶梯度变化的聚氧乙烯和 89mM
三硼酸/ 2mMEDT A 的运行缓冲液, 应用 15KV 的
运行电压,激光诱导荧光检测。分离 DNA 标记Õ
和 DNA标记Ö 的时间小于 18min。迁移时间 RSD
小于 2%。Issaq, H . J. 等[ 27] 考查了使用 HPLC 和
CE分离长度为 21~ 587bp 的 DNA 片段时各自所
需的实验温度。结果表明: 温度在 H PLC 分离
DNA 片段中起到了重要作用。HPLC 法分离的最
适温度为 40~ 50 e , 而对 CE 法, 尽管随着温度从
25 e 上升到 50 e , 迁移时间变短、柱效能和分辨率
降低,但是并没有明显改变 CE 的分离。CE 法分离
的最适温度为 25 e 。另外, HPLC 分离 DNA 片段
的最适温度会随着片段大小而不同。Liu, T . B.
等[ 2 8]报道了由二种聚氧丁烯 ) 聚氧乙烯 ) 聚氧丁
烯共聚物的混合物形成一种新的分离介质。此高聚
物介质的优点在于:易调整粘度;依靠调整聚合体的
浓度,有不同的分离机制而可提高 CE 分离度;操作
简单。用毛细管电泳分离 dsDNA 的具体实验条件
是:样品电动进样( 300V/ cm , 10s) ,熔融石英毛细管
( 12 cm @ 75~ 98Lm i. d. ,有效长度 10cm ) ,用包含
聚合物、溴乙菲锭, 89mMT ris/ 89mM 硼酸/ 2mM-
EDT A 作为运行缓冲液, 电场强度为 200V/ cm, 对
100个碱基对的 DNA 的分析, 可达单碱基分离。
Song, L. 等[ 29] 发展了使用不同化学组成的聚合物
混合物作为毛细管电泳用于 DNA 测序的运行基
质。这种聚合物混合物可能组合各自的优点。分子
量为 2 200 000的聚丙烯酰胺( PAM , 2. 5%, w/ v)被
分别混合以浓度为 0. 2% , 0. 5%, 和 1%聚( N, N-二
甲基丙烯酰胺) ( PDMA) (分子量分别对应为 8 000,
470 000, 2 100 000)。不同于是相同物质聚合物(只
是分子量不同)构成的混合聚合物溶液,使用不相同
成分聚合物的混合液作为分离介质, 存在不利于
DNA 测序分离的问题。当在 PDMA浓度和分子量
高时, 其在 DNA 测序中的有效性降低 (尤其是
DNA 碱基数目高时)。然而,使用低分子量( 8 000)
和低浓度 ( 0. 2% w / v ) 的 PDMA 与 2 200 000 的
PAM( 2. 5%, w/ v, )混合, 则 DNA 测序的有效性
高。混合聚合物也给分离介质提供了动态涂层, 不
需使用化学涂敷步骤, 此实验的每米有效理论酶共
价键合到了其上的硅胶颗粒制成的固相 DNA 限制
性水解反应器。这种反应器可以对微量塔板数已超
过 1 000 000。
64 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 2期
Xue G 等[ 30] 将 PCR反应器、CZE 与 CGE 三者
在线连接, 使用三电极系统切换, 使 PCR 产物在
CZE 步纯化, CGE 步分离 DNA。Davidson, Y. Y.
等[ 31]发展了一种用将脊髓限制性的 DNA 水解和分
离,且只需使用很少的试剂。通过戊二醛偶联,限定
酶 HaeÓ、Pst Ñ和 Hind Ó成功地固定到了多孔硅
胶颗粒中。考察这些固定化对酶活性的影响。含有
靶 DNA, X174RF DNA 噬菌体和 SV-40病毒 DNA
的水解时间分别为 120min和 240min。水解物用毛
细管电泳-激光诱导荧光离线测定。用固定时间法,
研究选择最优的完全消化的实验条件。对于使用
HaeÓ和 HindÓ作为酶, 溶液的和固定化的产生的
消化物具有相似的成分组成。Pst Ñ固定化后没有
活性。固定化限定酶也可以再次使用, 但是需要较
长的反应时间。这可能是由于限定酶部分变性。亦
可将分子量过滤膜附着在固定有酶的硅胶上而构成
微针型消化器, 对 DNA 水解并分离。相对于前一
种方法,此方法在反应产物的提取和酶的再利用方
面更为方便。Shihabi, Z. K. 等 [ 32]报道了在未处理
的毛细管中毛细管电泳方法对双链 DNA 的分析。
一个 100Lg/ m l ( Beckman ) 的 FX174 Hae Ó双链
DNA 样品消化液用作标准溶液(含 11个片段,覆盖
71~ 353个碱基对)。将消化液注入未涂敷的毛细
管( 25cm @ 75Lm, i. d. , 有效长度 17. 5 cm) ,低压动
力进样 99s,加入量为毛细管柱体积的 25% (采用在
柱浓缩) , 施加反向电压, 电场强度为 200V/ cm , 电
泳运行溶液为 50mM 的 N-2-羟乙基哌啶-Nc-2-乙磺
酸( HEPEs) / 65mM 硼酸缓冲液,并含 5%羟丙基甲
基纤维素和 1mg/ L 的溴乙菲锭, pH = 8. 1。在
254nm 处检测。上述两性离子缓冲液阻止了 DNA
在毛细管壁的吸附, 电渗流亦降低了。用商品的
LSi-l FC 毛细管对照,分离效果相同。
Yang, B. H .等 [ 33]测定了癌泰得( Cant ide)。癌
泰得是一个抑制端区酶催化亚单位 hTERT 的 20
聚反义硫磷酸寡核苷酸药。它有较好的抗肿瘤活
性。采用同时加入内标物质的方法,运用毛细管凝
胶电泳对 Cantide进行测定, 使迁移时间重现性变
好。Cant ide和磷硫酰内标物质在固相 DNA 合成
器中合成并通过制备型强阴离子交换色谱纯化。所
用内标物质的碱基组成百分率和 Cant ide是基本相
同的。只是增长了 4个碱基片段。Cant ide 通过毛
细管电泳仪和 ssDNA 分离试剂盒进行检测。毛细
管柱的尺寸是 31cm @ 100Lm i. d. , 有效长度为
20cm。样品采用电动进样, 电压为 10kv, 进样时间
为 1秒。柱温为 40 e ,样品保存温度为 30 e , 检测
波长为 254nm 缓冲液为 7mo l/ L 的尿素-三硼酸液
混合物( pH = 8. 5)。Cantide回归曲线的线性范围
是 12. 5~ 800mg / L ,相关系数为 0. 99997。检测限
是 0. 220mg/ L。Cant ide的日内和日间检测相对标
准偏差分别为 0. 449~ 1. 89%和 1. 01~ 1. 48%。平
均回收率测得为 96. 95% ( RSD 为 6. 88% )。测定
方法的评价和 CGE 的性能表明, 该方法可用于
Cant ide 降解的药代动力学研究的定量分析,所得结
果是准确和可重复的。
U eda, M. 等[ 34] 建立了 u-CE(微制作毛细管电
泳)来快速分离低聚核苷酸和三重复 DNA 片段。
u-CE 是一种基于微型的全分析系统以及芯片型实
验室的概念的装置。在将来,我们计划集成所有的
人类疾病(如三重复 DNA 疾病)的 DNA 诊断和基
因治疗这些方法于一个芯片上。
毛细管电色谱( CEC)是一种刚刚出现的具有微
毛细管 HPLC 和毛细管电泳特征的新技术。毛细
管电色谱( CEC)分离技术的特点是具有高速度和高
效的电驱动系统, 而载样量和选择性同于高效毛细
管液相色谱柱。Ding, J. M . 等[ 35] 用毛细管电色谱-
质谱联用技术分离和鉴定用试管反应衍生的聚芳香
烃 DNA 加合物。它表明, 通过对水溶性流动相中
的有机混合物进行合适的选择, 如构成三元的或四
元的流动相,相对于 HPLC, 用 CEC 恒溶剂地分离
复杂的 DNA 加合物混合物, 有更好的选择性和更
快的速度。此外,用台阶梯度洗脱, 分析速度加快。
CEC易于与 MS偶联, 这使得混合物中每个被分开
的成分可以在线地定性。通过柱上聚焦, 提高 CEC
的样品柱载样量。
Smith, J. P.等 [ 36] 评述了对基于利用毛细管电
泳技术的用于 DNA 自动测序的设备。目前由美国
国内四家公司进行销售的七种毛细管电泳仪,其特
点已被列在一个表中。现代化的自动毛细管电泳设
备每天可以对多个 500 000碱基的 DNA进行测序。
本文还就 DNA 分离、检测、分离所用基质、毛细管
652006年第 2期 方梅等: 毛细管电泳在基因研究中的应用
柱、毛细管电泳 DNA 测序仪未来的多用途方面作
了讨论。Ren, J. 等 [ 37] 评述了高通量 CGE-SSCP。
突变检测在遗传学、医学研究和临床诊断遗传性疾
病和特殊癌症方面有着重要的作用。平板凝胶电泳
的单链 DNA 构型多态性分析是突变检测中最常用
的方法之一。近来, 在这方面的研究中,自动化毛细
管电泳系统代替了平板凝胶电泳。CE- SSCP 可用
于突变检测、法庭基因分型、DNA测序、基因表达测
定。在样品处理方面, dsDNA 常用热处理法解链成
正义、反义的两 ssDNA,然后用冰浴退火, 防止二者
复性。CE 用荧光检测, 甚至可对 DNA 的 PCR 产
物或 DNA的酶消化液无须纯化。CE用紫外检测,
对 DNA 的 PCR产物直接电进样灵敏度不够, 须作
脱盐预处理。温度是影响分离的因素, 须选择,因为
温度要影响到单链的碱基的相互作用, 二级构象。
除 pH8. 3,低 pH 值的运行缓冲液可用于 CGE-SS-
CP, 因为它要影响 DNA 上的多磷酸以及碱基的解
离,影响构象。Heller, C 等[ 38] 评述了毛细管电泳用
于分离单链 DNA 和线性的双链 DNA。分别讨论
了在毛细管凝胶电泳中和毛细管聚合物溶液电泳中
DNA 的运动机理,并指出主要影响毛细管电泳用于
分离单链 DNA 和线性的双链 DNA 的分离效能(按
照组分的峰间隔和峰展宽)的因素。
5 展望
毛细管电泳作为一种高分离的检测技术, 是基
因研究的有力工具。分离条件的最佳化和毛细管电
泳阵列技术的完善,将使得大批量的样品 (如在临
床)检测成为现实。芯片毛细管电泳及其在基因分
析中的应用, 各种用于提高 CE 分析信号的灵敏度
的方法,值得大力研究。毛细管电泳分离-检测的数
据有待结合化学计量学(如聚类分析)的方法进行处
理[ 39]。
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