全 文 ：第24卷 第5期
2012年5月
Vol. 24, No. 5
May, 2012
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2012)05-0399-05
植物转基因中同源共抑制的机制及其解决措施
孔莹莹，蒋　丽，韩　凝，边红武，朱睦元，王君晖*
(浙江大学生命科学学院遗传学研究所，浙江 310058)
摘　要：外源基因在不同的植物转基因株系间会呈现很大的表达差异，甚至出现同源共抑制现象，即转基
因在其自身不表达的同时也造成与其同源的内源基因的沉默。转基因沉默和同源共抑制主要包括转录水平
沉默 (transcriptional gene silencing, TGS)和转录后水平沉默 (post-transcriptional gene silencing, PTGS)。高度
转录的外源基因所产生的紊乱 RNA触发了 RNA干涉的机器，是造成转基因沉默和同源共抑制的主要原因。
目前，介绍同源共抑制机理的综述很多，但是介绍其克服方法的综述却很少。为了减少转基因株系差异，
得到稳定表达的转基因株系，研究者提出了一系列消除转基因沉默和同源共抑制的措施，包括筛选单拷贝
株系、利用 PTGS突变体材料、利用病毒的 RNA干涉抑制因子、利用植物的紊乱 RNA清除蛋白以及构建
新型的转基因载体等。对上述方法进行综述，并比较其优劣。
关键词：同源共抑制；转录水平基因沉默；转录后水平基因沉默；RNA干涉抑制
中图分类号：Q943.2；Q786 文献标志码：A
Mechanisms and solutions of homologous co-suppression in plant transgenesis
KONG Ying-Ying, JIANG Li, HAN Ning, BIAN Hong-Wu, ZHU Mu-Yuan, WANG Jun-Hui*
(Institute of Genetics, College of Life Sciences, Zhejiang University, Zhejiang 310058, China)
Abstract: Pronounced variability of transgene expression and transgene silencing are commonly observed among
independent plant lines transformed with the same construct. Transgenes can also cause the silencing of endogenous
plant genes if they are sufficiently homologous, a phenomenon known as homologous co-suppression. Homologous
co-suppression occurs transcriptionally and post-transcriptionally but predominantly post-transcriptionally. A major
reason for transgene silencing and homologous co-suppression is that aberrant RNA produced by highly transcribed
transgenes triggers the RNA interfering machinery of plant cells. At present, there are many reviews about the
mechanism of homologous co-suppression, but rarely toward the method to eliminate it. In order to obtain stable
level of transgene expression, researchers have proposed a series of measures to eliminate homologous co-
suppression, including screening single-copy transformants, using PTGS mutants as a transformation background,
using viral suppressors of RNA silencing, using plant proteins against aberrant RNA, and construction of new
transgenic vectors, etc. We addressed and compared these methods here.
Key words: homologous co-suppression; transcriptional gene silencing; post-transcriptional gene silencing;
suppression of RNA silencing
收稿日期：2012-02-22； 修回日期：2012-03-12
基金项目：国家自然科学基金项目(31170211)
*通信作者：E-mail: junhuiwang@zju.edu.cn; Tel: 0571-
88206495
当前，转基因技术已经成为研究基因功能、生
理调控和遗传改良的一种常规方法。在转基因技术
应用过程中，株系差异是困扰研究者的一个重要问
题 [1-5]。特别是在反向遗传学研究中，有些基因的
表型有可能很小，非常容易被株系差异所混淆和掩
盖 [4-5]。造成株系差异的主要因素有两个，一是位
置效应 (position effect)，二是转基因沉默 (transgene
silencing) [1-5]。所谓位置效应就是外源基因通常是
随机整合到宿主染色体中，受到不同的染色质结构
∙ 评述与综述 ∙
生命科学 第24卷400
和表达调控元件的影响 [4-5]。为了克服植物转基因
中的位置效应，研究者采用了基质附着区 (matrix
attachment region, MAR)和绝缘子 (insulator)等元
件。本实验室在拟南芥中引入果蝇 gypsy绝缘子及
其结合蛋白 Su(Hw)，使外源基因高效而精确地表
达，消除了位置效应，确保了启动子的特异性 [4]。
所谓转基因沉默就是外源基因被宿主细胞的 RNA
干扰 (RNA interfering, RNAi)机制所识别，造成转
基因的表达下调或关闭，同时也会产生同源共抑制
(homologous co-suppression)现象，即转基因在其自
身不表达的同时也造成与其同源的内源基因的沉
默。转基因沉默和同源共抑制比位置效应更容易
引起转基因的株系差异 [1-4]。
本综述主要介绍植物转基因中克服转基因沉默
和同源共抑制的方法，以促进外源基因高效稳定表
达，减少株系差异，方便反向遗传学的研究。目前，
国内报道同源共抑制机理以及利用 RNAi研究基因
功能的综述很多 [6-9]，但如何克服转基因沉默和同
源共抑制的综述却很少。
1　植物转基因中的同源共抑制现象及其机理
1.1　同源共抑制现象
同源共抑制现象最早是由 Jorgensen等 [10]发现
的。他们尝试把由强启动子控制的查尔酮合成酶基
因导入矮牵牛以加深花的紫色，结果不但颜色未加
深，许多花呈现杂色甚至白色。此后，研究者发现
同源共抑制现象在植物转基因中非常普遍。表达编
码区会发生同源共抑制现象，有意思的是，表达内
含子区也会发生同源共抑制现象 [11-14]，说明 RNA
干涉和同源共抑制的起始在未成熟 mRNA阶段就
开始了。Yang等 [15]在表达拟南芥 AtLrgB基因时也
发现了一个有意思的现象，表达其 N端结构域不会
引起同源共抑制，而表达其 C端结构域却能引起同
源共抑制。
1.2　同源共抑制机理
转基因沉默和同源共抑制主要包括转录水平
基因沉默 (TGS)和转录后水平基因沉默 (PTGS)，
两者都依赖于 siRNA (small interfering RNA)。siRNA
产生的基本过程如下：转基因造成的紊乱 RNA
(aberrant RNA,主要是没有 5′帽子或 3′ poly A尾巴
的 RNA)触发 RNA依赖的 RNA聚合酶 (RNAdepen-
dent RNA polymerase, RdRP)的活性，形成双链 RNA
(double strands RNA, dsRNA)；dsRNA被 DICER(在
拟南芥中称 Dicer like, DCL)切割，产生 21~25 nt
的 siRNA。另外，如果转基因是反向重复插入宿主
染色体，也会诱发 siRNA的产生。
在拟南芥的 TGS中，siRNA与 ARGONAUTE
蛋白中的 AGO4结合，形成转录沉默复合体 (RNA-
induced transcriptional silencing complex, RITS)，促
进并维持启动子序列的甲基化、组蛋白修饰和异染
色质的形成，造成转基因和同源基因在转录水平的
沉默 [16-18]。朱健康实验室在 TGS的机理研究中取
得了重大进展。他们发现，在环核仁区，RNA聚
合酶 V负责产生骨架 RNA(scaffold RNA)；在核质
区，RNA聚合酶 II负责产生骨架 RNA；AGO4所
结合的 DNA 甲基转移酶 DRM2负责催化转基因
和同源基因的 DNA甲基化 [16-17]。植物转基因中的
常用启动子是 35S CaMV启动子，与其相关的 siRNA
和 DNA甲基化在 TGS中起重要作用 [19-20]。一些
TGS，比如 MET1、DDM1、HOG1 和 RPA2 等蛋
白介导的 TGS，并不依赖 siRNA。Shen等 [21]研究
发现，CUE1蛋白 (质体磷酸烯醇式丙酮酸转运体 )
也与 TGS有关。
在拟南芥的 PTGS中，siRNA与 ARGONAUTE
蛋白中的 AGO1结合，形成转录后沉默复合体
(RNA-induced silencing complex, RISC)，其中的 siRNA
负责识别 mRNA中的靶序列，其他蛋白因子负责
mRNA的降解。2006年，Brodersen和 Voinnet[22]认为，
PTGS发生在细胞质中；而 2011年，Hoffer等 [23]
研究表明，PTGS也可以发生在细胞核中。表达菜
豆 FAD2-1 (脂肪酸去饱和酶基因 )的内含子，发现
其能有效驱动 FAD2-1 基因的沉默，说明核内的未
成熟 mRNA可能是 PTGS的作用对象。他们在细
胞核中找到了相应的 siRNA，以及参与核内 siRNA
形成的 RdRP6和 DCL4。
关于单拷贝正链转基因为什么会引发转基因沉
默和同源共抑制，目前有两个模型：一个称为临界
模型，认为细胞对每种 mRNA所能承受的最高浓
度不一样，超过最高浓度就会诱发转基因沉默和同
源共抑制 [24]；另一个称为紊乱 RNA模式，认为外
源基因过高的转录速度容易产生紊乱的 RNA，它
们能触发 RdRP的活性 [25]。
2　克服植物转基因沉默和同源共抑制的方法
2.1　利用单拷贝株系
Butaye等 [1]研究表明，与单拷贝株系相比，
多拷贝株系更容易发生转基因沉默和同源共抑制现
象。因此，为了得到稳定表达的株系，应该选择单
孔莹莹，等：植物转基因中同源共抑制的机制及其解决措施第5期 401
拷贝株系。De Paepe等 [3]利用 CRE/loxP重组系统，
发展了一种把多拷贝复杂株系转换成单拷贝株系的
方法。他们的研究表明，受体细胞类型也与转基因
株系的平均拷贝数有关。
2.2　利用PTGS突变体
利用 PTGS突变体作为转基因背景材料是克服
转基因沉默和同源共抑制的一种有效方法。RNA
依赖的 RNA聚合酶 SGS2/SDE1/RDR6以及一个未
知功能蛋白 SGS3都与 PTGS有关。用 sgs2 sgs3突
变体为转基因的背景材料，可以得到稳定且高效表
达的转基因株系：以野生型为背景时，35S启动子
驱动的 gusA报告基因仅在 20%的转化体中有效表
达；而以 sgs2和 sgs3为背景时，报告基因在 100%
的转化体中都高水平表达 [1-2]。以 PTGS突变体为
背景材料进行转基因只适用于大量稳定表达某个蛋
白，不适用于反向遗传学中的表型和功能分析，因
为 PTGS途径受到破坏后，植株的一些生化功能和
生理表型已经受到影响，干扰了待研究基因的功能
和表型分析 [4]。
2.3　利用病毒的RNA干涉抑制因子
在高等植物中，RNA干涉在抑制病毒侵染中
发挥重要的作用，而病毒为了抵抗 RNA干涉在进
化中获得了病毒性 RNA干涉抑制因子 (viral supp-
ressors of RNA silencing, VSRs)[26-30]。VSRs能通过
与细胞内 RNA干涉途径的重要组分发生作用而有
效地抑制 RNA干涉过程。目前，已有大量的 VSRs
被鉴定。P14和 P38蛋白能抑制 DCL2/3/4对 dsRNA
的识别和随后的剪切；P19、P21、HC-Pro和 P0等
蛋白能阻止 RISC复合体的组装 [29-30]；P1蛋白含有
甘氨酸 /色氨酸 (glycine/trypophan, GW/WG)重复
基序，能结合 AGO蛋白 [30]；V2和 2b蛋白能抑制
RdRP，阻止 RNA干涉的扩大 [29-30]。
在转基因的同时表达 VSRs能有效促进转基因
的稳定表达 [27,29]；但是，由于 DCL、AGO和 RdRP
等都是植物正常发育所需的蛋白，VSRs对这些蛋
白的抑制会干扰植物的正常生长，影响生理功能和
表型分析，因此，这条途径主要适于大量稳定表达
某个蛋白，不适用于反向遗传学中的性状分析。表
达 VSRs的植株本身就已经有非常明显的表型 [26,30]。
2.4　利用植物清除紊乱RNA的蛋白
研究表明，没有 5′帽子的紊乱 RNA主要通过
XRN这一类核酸外切酶 (5′到 3′方向 )清除，主要
包括 XRN4、XRN2、XRN3； 另外一个核苷酸酶 /
磷酸酶 FRY1也在这个过程中起作用 [31-33]。没有 3′
尾巴的紊乱 RNA主要通过 EXOSOME(3′到 5′方向
的核酸外切酶复合体 )进行清除，在该复合体中，
有一种 RNA解旋酶 HEN2起重要作用 [34]。XRN4、
XRN2、XRN3、FRY1、HEN2等基因突变，会引起
紊乱 RNA的累积，促进转基因沉默和同源共抑制
的强化 [31-33]。因此，表达这些蛋白质可以减轻转基
因沉默和同源共抑制，但这方面的研究还有待进一
步开展。
2.5　利用新型转基因载体
2.5.1　两份终止子和新型终止子
研究表明，转录时 3′通读 (read-through)会产
生没有 poly A尾巴的紊乱 RNA，它们累积在细胞
核中，会成为 RdRP的模板，从而引发转基因沉默
和同源共抑制。研究者尝试用两份终止子去抑制 3′
通读。在转入含有两份终止子的 GUS基因株系中，
GUS活性平均增加了 3~4倍；同时，mRNA的 3′
通读降低，与 GUS相关的 siRNA的累积减少 [25]。
另外，植物的天然终止子具有可变的多聚腺苷酸化
位点，而且 3′通读的比例很低，应该开发出来，为
植物基因工程所用 [35]。最近，Zhou等 [36]发现，一
种 DNA解旋酶MOM1能阻止异常转录本的通读。
2.5.2　内含子
在一般的植物转基因中，外源基因总是尽量简
化，去除了天然的 5′-UTR(非翻译区 )、3′-UTR和
内含子等非编码区。没有内含子被认为是导致转基
因沉默和同源共抑制的可能原因。Christie等 [37]将
含有内含子的外源基因和没有内含子的外源基因进
行了比较，结果发现，在没有内含子的转基因株系
中，siRNA积累量远远超过含有内含子的转基因株
系，基因沉默现象前者是后者的 4倍；内含子对基
因沉默的抑制作用依赖帽子结合蛋白 ABH1；未成
熟 mRNA 的剪接可能阻止了 RdRP 的进攻。但是，
Vermeersch等 [14]的研究则表明，含有内含子的外
源基因只是延迟而不是阻止内源基因的沉默，RdRP
作用于未成熟 mRNA而不是成熟的 mRNA。
2.5.3　3′-UTR
为了消除植物转基因中的基因沉默和同源共抑
制现象，本实验室也设计了几种实验方案。结果发
现，在外源基因中加入一个内含子能减少 30%的
同源共抑制，而加入 5′-UTR并不能阻止同源共抑
制的发生。另外，在植物转基因载体中加入果蝇
bicoid (bcd)基因的 3′-UTR，同时表达该 UTR的结
合蛋白 Staufen，结果显示，该体系能非常有效地消
除转基因沉默和同源共抑制现象。
生命科学 第24卷402
3　结论与展望
转基因沉默和同源共抑制是植物转基因中的重
要障碍，讨论其机理的综述很多，介绍其克服措施
的综述却很少。本文介绍了克服转基因沉默和同源
共抑制的一些方法，并比较了它们的优劣。利用
PTGS突变体材料和病毒的 RNA干涉抑制因子，能
促进外源基因的高效表达，但并不适用于反向遗传
学中的表型分析和性状观察。在转基因载体中加入
内含子，一方面比较麻烦；另一方面还有争议，越
来越多的研究表明，转基因沉默和同源共抑制可以
发生在未成熟 mRNA阶段。强化植物的紊乱 RNA
清除体系是一个重要的研究方向，因为它是从源头
消除造成转基因沉默和同源共抑制的因素；在转基
因载体中加入新型终止子和 3′-UTR也是克服转基
因沉默和同源共抑制的有效方法。随着科技的发展，
人们对转基因沉默和同源共抑制的分子机理的认识
会更加深入，一些更为有效且不影响植物正常生长
发育的解决方法也会发展起来，从而使转基因技术
更好地为人类服务。
[参　考　文　献]
[1] Butaye KM, Goderis IJ, Wouters PF, et al. Stable high-
level transgene expression in using gene silencing mutants
and matrix attachment regions. Plant J, 2004, 39(3): 440-9
[2] De Bolle MF, Butaye KM, Goderis IJ, et al. The influence
of matrix attachment regions on transgene expression in
Arabidopsis thaliana wild type and gene silencing
mutants. Plant Mol Biol, 2007, 63(4): 533-43
[3] De Paepe A, De Buck S, Hoorelbeke K, et al. High
frequency of single-copy T-DNA transformants produced
by floral dip in CRE-expressing Arabidopsis plants. Plant
J, 2009, 59(4): 517-27
[4] She W, Lin W, Zhu Y, et al. The gypsy insulator of
Drosophila melanogaster, together with its binding protein
suppressor of hairy-wing, facilitate high and precise
expression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Genetics,
2010, 185(4): 1141-50
[5] Singer SD, Liu Z, Cox KD. Minimizing the unpredicta-
bility of transgene expression in plants: the role of genetic
insulators. Plant Cell Rep, 2012, 31(1):13-25
[6] 吴迪, 朱延明. 转基因植物中外源基因沉默机制及防止
对策. 生物技术通讯, 2002, 13(3): 228-32
[7] 王鹏, 赵旵军, 朱国萍. 植物RNA沉默的分子机制研究
进展. 生命科学, 2008, 20(5): 784-89
[8] 曾晓珊, 戴良英, 刘雄伦, 等. dsRNA介导植物基因沉默
及其应用. 生命科学, 2009, 19(2): 132-8
[9] 张炜, 叶克穷. RNA沉默的结构生物学研究进展. 生命
科学, 2010, 22(7): 608-15
[10] Jorgensen R, Napoli CC, Lemieux C. Introduction of a
chimeric chalcone synthase gene into petunia results in re-
versible co-suppression of homologous genes in trans.
Plant Cell, 1990, 2(4): 279-89
[11] Ma C, Mitra A. Intrinsic direct repeats generate consistent
posttranscriptional gene silencing in tobacco. Plant J,
2002, 31(1): 37-49
[12] Mroczka A, Roberts PD, Fillatti JJ, et al. An intron sense
suppression construct targeting soybean FAD2-1 requires
a double-stranded RNA-producing inverted repeat T-DNA
insert. Plant Physiol, 2010, 153(2): 882-91
[13] Nizampatnam NR, Kumar VD. Intron hairpin and transi-
tive RNAi mediated silencing of orfH522 transcripts re-
stores male fertility in transgenic male sterile tobacco
plants expressing orfH522. Plant Mol Biol, 2011, 76(6):
557-73
[14] Vermeersch L, Winne ND, Depicker A. Introns reduce
transitivity proportionally to their length suggesting that
silencing spreads along the pre-mRNA. Plant J, 2010,
64(3): 392-401
[15] Yang YJ, Jin HY, Chen Y, et al. A chloroplast envelope
membrane protein containing a putative LrgB domain re-
lated to the control of bacterial death and lysis is required
for chloroplast development in Arabidopsis thaliana. New
Phytol, 2012, 193(1): 81-95
[16] Gao Z, Li HL, Daxinger L, et al. An RNA polymerase II
and AGO4-associated protein acts in RNA-directed DNA
methylation. Nature, 2010, 465(7294): 106-9
[17] Zhang H, Zhu JK. RNA-directed DNA methylation. Curr
Opin Plant Biol, 2011, 14(2): 142-7
[18] Simon SA, Meyers BC. Smal RNA-mediated epigenetic
modification in plants. Curr Opin Plant Biol, 2011, 14(2):
148-55
[19] Yamasaki S, Oda M, Koizumi N, et al. De novo DNA
methylation of the 35S enhance revealed by high-
resolution methylation analysis of an entire T-DNA
segment in transgenic gentian. Plant Biotechnol, 2010,
28(2): 223-30
[20] Mlotshwa S, Pruss GJ, Gao Z, et al. Transcriptional
silencing induced by Arabidopsis T-DNA mutants is
associatedwith 35S promoter siRNAs and requires genes
involved in siRNA-mediated chromatin silencing. Plant J,
2010, 64(4): 699-704
[21] Shen J, Ren X, Cao R, et al. Transcriptional gene silencing
mediated by a plastid inner envelope phosphoenol-
pyruvate/phosphate translocator CUE1 in Arabidopsis.
Plant Physiol, 2009, 150(4): 1990-6
[22] Brodersen P, Voinnet O. The diversity of RNA silencing
pathways in plants. Trends Genet, 2006, 22(5): 268-80
[23] Hoffer P, Ivashuta S, Pontes O, et al. Posttranscriptional
gene silencing in nuclei. Proc Natl Acad Sci USA, 2011,
108(1): 409-14
[24] Schubert D, Lechtenberg B, Forsbach A, et al. Silencing in
Arabidopsis T-DNA transformants: the predominant role
of a gene-specific RNA sensing mechanism versus
position effects. Plant Cell, 2004, 16(10): 2561-72
[25] Luo Z, Chen Z. Improperly terminated, unpolyadenylated
mRNA of sense transgenes is targeted by RDR6-mediated
RNA silencing in Arabidopsis. Plant Cell, 2007, 19(3):
孔莹莹，等：植物转基因中同源共抑制的机制及其解决措施第5期 403
943-58
[26] Voinnet O. Induction and suppression of RNA silencing:
insights from viral infections. Nat Rev Genet, 2005, 6(3):
206-20
[27] Voinnet O. Use, tolerance and avoidance of amplified
RNA silencing by plants. Trends Plant Sci, 2008, 13(7):
317-28
[28] Muller AE. Gene silencing in plants: tansgenes as targets
and effectors[M]// Kempken F, Jung C. Genetic modifica-
tion of plants: Biotechnology in agriculture and forestry.
Berlin Heidelberg: Springer-Verlag, 2010: 79-101
[29] Yi X, Lu R. RNAi suppression and its application[M]//
Erdmann VA, Barciszewski J. RNA technologies and their
applications. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag, 2010:
59-92
[30] Burgyan J, Havelda Z. Viral suppressors of RNA silenc-
ing. Trends Plant Sci, 2011, 16(5): 265-72
[31] Gazzani S, Lawrenson T, Woodward C, et al. A link be-
tween mRNA turnover and RNA interference in Arabidop-
sis. Science, 2004, 306(5698): 1046-8
[32] Gy I, Gasciolli V, Lauressergues D, et al. Arabidopsis
FIERY1, XRN2, and XRN3 are endogenous RNA silenc-
ing suppressors. Plant Cell, 2007, 19(11): 3451-61
[33] Rymarquis LA, Souret FF, Green PJ. Evidence that XRN4,
an Arabidopsis homolog of exoribonuclease XRN1, pref-
erentially impacts transcripts with certain sequences or in
particular functional categories. RNA, 2011, 17(3): 501-11
[34] Linder P, Owttrim GW. Plant RNA helicases: linking aber-
ant and silencing RNA. Trends Plant Sci, 2009, 14(6):
344-52
[35] Xing A, Moon BP, Mills KM, et al. Revealing frequent al-
ternative polyadenylation and widespread low-level tran-
scription read-through of novel plant transcription termi-
nators. Plant Biotechnol J, 2010, 8(7): 772-82
[36] Zhou Y, Zhang J, Lin H, et al. MORPHEUS’ MOLECULE1
is required to prevent aberrant RNA transcriptional read-
through in Arabidopsis. Plant Physiol, 2010, 154(3): 1272-
80
[37] Christie M, Croft LJ, Carroll BJ. Intron splicing suppress-
es RNA silencing in Arabidopsis. Plant J, 2011, 68(1):
159-67