全 文 ：第23卷 第3期
2011年3月
Vol. 23, No. 3
Mar., 2011
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2011)03-0317-05
收稿日期：2010-08-02； 修回日期：2010-09-27
基金项目：山东省农业良种工程项目(鲁科农字[2008]167
号)；国家农业科技成果转化资金项目(2008GB2C600175)；
中央财政林业科技推广示范跨区域重点推广示范项目
([2009]TK046号)
*通讯作者：E-mail: lqhou@163.com; Tel: 0531-
88557748
分子标记及其在核桃遗传多样性研究中的应用
高玉娜1，赵登超2,3，侯立群2,3*
（1 山东师范大学生命科学学院，济南 250014； 2 山东省林业科学研究院，济南 250014；
3 山东省林木遗传改良重点实验室，济南250014）
摘　要：核桃是我国重要的坚果和木本油料树种之一，具有重要的学术研究和经济价值。现代分子标记技
术的迅速发展为核桃的种质鉴定、遗传育种、遗传多样性分析、亲缘鉴定等提供了崭新途径。本文主要介
绍RFLP、RAPD、AFLP及SSR等几种分子标记技术的主要原理、特点以及在核桃遗传多样性方面的研究进
展，分析了分子标记在核桃遗传多样性研究中的主要问题，并对其发展提出了展望。
关键词：核桃；遗传多样性；分子标记
中图分类号：Q346+.5; Q949.735　　文献标识码：A
The prospects of molecular markers in the genetic diversity
research on walnut(Juglans regia L.)
GAO Yu-Na1, ZHAO Deng-Chao2,3, HOU Li-Qun2,3*
(1 College of Life Science, Shandong Normal University, Jinan 250014, China; 2 Shandong Academy
of Forestry, Jinan 250014, China; 3 Shandong Provincial Key Laboratory of
Forest Tree Genetic Improvement, Jinan 250014, China)
Abstract: As one of the important nuts and woody oil species in China, walnuts are of important academic and
economic value. The development of molecular marker technique has launched a new era in Juglans germplasm
identification, genetic breeding, genetic diversity and genetic analysis. This paper describes the principles and
characteristics of several techniques of molecular markers (RFLP, AFLP, RAPD, SSR, etc.) that are frequently used
in walnut research. The applications of molecular markers in the walnut germplasm studies were summarized and
the principle issues lied in walnut research as well as future research expectations were also discussed in this paper.
Key words: walnut(Juglans regia L.); genetic diversity; molecular markers
核桃 (Juglans regia L.)在我国有着悠久的栽培
历史和广泛的分布，2008年中国统计年鉴结果表
明，2007年我国核桃产量为62.99万吨，我国核桃主
产大省为云南、四川、新疆、河北、陕西等省份。
核桃又称胡桃，属于核桃科核桃属(Juglans)植物，
是世界上著名的四大坚果(核桃、扁桃、板栗、腰
果)之一，是我国重要的坚果和木本油料树种，具
有很高的经济价值[1,2]。核桃属植物为单性花、雌雄
同株异熟植物。在自然条件下，其遗传后代均系杂
合体，且遗传基础复杂，在长期进化中，由于复等
位基因的形成，在实生繁殖条件下，其植物学形态
特征表现出颇大的种内多样性，因此核桃具有丰富
的种质资源以及遗传多样性。
遗传多样性即基因多样性，体现在分子、细胞
和个体三个水平上，是生命进化和物种分化的基
∙ 技术与应用 ∙
生命科学 第23卷318
础[3]。核桃遗传多样性的研究主要包括宏观与微观
两方面：宏观主要是通过遗传力、选择系数、孤雌
生殖以及对品质性状进行统计分析；微观方面主要
是通过分子标记技术对核桃种质遗传作图，提供核
桃种质资源和遗传育种理论依据。现代分子标记技
术的发展在分子水平对核桃遗传多样性的研究分析
对于核桃的遗传育种和种质鉴定具有重要意义。
1　分子标记的种类
自从20世纪60年代分子标记迅速发展以来，极
大地加深了人们对生物遗传规律的认识。如今，
DNA分子标记已被广泛用于种质资源研究、遗传图
谱构建、遗传多样性分析、基因定位、亲缘分析、
遗传育种、基因克隆等方面。目前，分子标记已经
发展了十几种，根据其特点，主要分为基于分子杂
交的分子标记技术，如限制性片段长度多态性
(restriction fragment length polymorphism，RFLP)；
基于PCR技术的分子标记，如随机扩增DNA多态性
(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、
D N A扩增指纹 ( D A F )、扩增片段长度多态性
(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、
简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)、简单
重复间区(ISSR)、序列特异扩增区域(SCAR)、DNA
单链构象多态性 ( s i ng l e s t r and con fo rma t ion
polymorphism, SSCP)等；基于DNA芯片技术的分子
标记技术，如单核苷酸多态性 (single nucleotide
polymorphism, SNP)。
2　常用分子标记及其在核桃遗传多样性上的
应用
近年来DNA分子标记技术越来越多地被应用
于核桃种质资源及遗传研究，其中主要有：
RFLP、RAPD、SSR、ISSR、AFLP、ITS等。与传
统的统计分析相比，DNA分子标记不受环境、发育
时期、组织类别的影响，能从基因组水平上提供完
整的遗传信息。以下主要介绍其中几种核桃属研究
中最常用的标记技术。
2.1　RFLP及其在核桃遗传多样性分析中的应用
2.1.1　RFLP原理及特点
限制性片段长度多态性(RFLP)作为遗传工具是
由Grozdicker于1974年创立，Botesin于1980年再次
提出，是最早应用的分子标记技术[4]。RFLP是基于
分子杂交技术的分子标记技术。其基本原理是根据
不同品种基因组DNA的限制性内切酶酶切位点的碱
基发生突变，或插入或缺失或置换，从而导致酶切
片段大小发生改变，再通过与特异探针杂交检测出
这种改变，从而可比较不同品种间DNA水平差异
(即多态性)[5]。
该标记的等位基因在遗传上具有共显性的特
点，可以区分纯合子和杂合子[6]。标记位点数量不
受限制，实验结果稳定可靠。不足主要表现在：成
本较高，需要的DNA样品量较大；克隆可表现基因
组DNA多态性的探针较为困难，且同位素探针容易
对环境造成污染；实验需要的仪器设备较多，操作
比较繁琐，检测周期长，检测效率低。
2.1.2　RFLP在核桃遗传多样性分析的应用
1994年Fjiellstrom等[7]用RFLP标记分析了48份
核桃品种的遗传变异关系，遗传距离分析结果表
明，加州种质与来自法国、中欧和伊朗的核桃种质
亲缘关系较近，而与来自尼泊尔、中国、韩国和日
本的核桃种质基因型相似程度较低。
2.2　RAPD及其在核桃遗传多样性分析的应用
2.2.1　RAPD原理及特点
随机扩增DNA多态性(RAPD)是由Williams 等
为克服RFLP技术上的缺点于1990年建立起来的分
子技术[8]。RAPD技术建立在PCR技术基础上，它利
用一系列不同的碱基顺序随机排列的寡聚核苷酸单
链(通常为10聚体)为引物，对所研究基因组DNA进
行PCR扩增、琼脂糖电泳分离、EB染色，来检测扩
增产物DNA片段多态性，这些扩增DNA片段多态
性反映了基因组相应区域的DNA多态性。
与RFLP相比，RAPD技术简单易操作，检测速
度快；DNA用量少，不需要DNA同位素探针；不
依赖于种属特异性和基因组结构，不需要特定引
物；成本低[3]。不足之处在于RAPD标记一般情况
下是显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子；不能分
开长度相同但碱基序列不同的DNA片段；受诸多因
素影响，实验结果的稳定性和重复性差，容易产生
假阳性带。
2.2.2　RAPD在核桃遗传多样性分析的应用
Nicese等[9]利用RAPD技术对19个核桃品种进行
聚类分析，获得了与传统分类一致的结果，表明
RAPD标记能准确反映系谱关系，为核桃遗传育种
奠定了基础。吴燕民和李嘉瑞[10]利用随机扩增多态
性DNA方法对麻核桃、核桃楸、核桃、奇异核桃和
核桃×核桃楸的人工杂种进行了基因组多态性分
高玉娜，等：分子标记及其在核桃遗传多样性研究中的应用第3期 319
析，研究了麻核桃的起源以及分类地位，结果表明
在胡桃属分类中，麻核桃应归为核桃楸组，这与传
统分类学结果一致。陈良华等[11]运用RAPD技术对
核桃与铁核桃进行研究，初步认定标记D6-250可能是
核桃与铁核桃之间的特异性分子标记。徐郑等[12]运
用RAPD技术对原产川西高原和秦巴山区的74个核
桃材料进行基因组DNA多态性分析，86.1%的随机
引物表现为多态性，研究表明川西高原核桃具有丰
富的遗传多样性。张虎平等[13]利用构建的早实核桃
和晚实核桃近等基因池DNA筛选了180个10-mer随
机引物，获得1个稳定的RAPD标记OPG15759，结果
表明该标记与核桃早实性相关，对核桃的分子标记
辅助育种有重要意义。
2.3　AFLP及其在核桃遗传多样性分析的应用
2.3.1　AFLP原理及特点
扩增片段长度多态性(AFLP)是1993年由荷兰
Keygene公司的科学家Zabeau和Vos发明的一种DNA
分子标记新技术[14]。它是在PCR技术和RFLP标记技
术的基础上产生的，通过限制性内切酶片段的不同
长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。
其原理是用限制性内切酶双酶切基因组DNA形成分
子量大小不等的限制性片段，在这些DNA片段的两
端连接上特定的接头，形成一个带接头的特异片
段，和PCR引物3末端识别后经PCR扩增，最后利
用高分辨率的凝胶电泳将这些特异的多态性限制性
片段鉴定出来。
AFLP是RFLP和PCR结合的产物，既具有RFLP
的可靠性，又有PCR的方便性，实验结果稳定可
靠，重复性好；AFLP不但具备其他分子标记所具
备的优点还有DNA用量少、快速高效、灵敏度高的
特点。不足之处是该技术操作时间长，步骤复杂；
DNA纯度要求高而且成本比较高。
2.3.2　AFLP在核桃遗传多样性分析的应用
陈静[15]在建立适合核桃的AFLP银染技术体系
的基础上，构建了58份核桃供试材料的指纹图谱，
并结合各材料间的遗传距离对其遗传多样性进行分
析，揭示了材料间遗传背景的相似性及复杂性。陈
良华等[16]利用AFLP分子标记技术对四川省3个野生
核桃种群和1个野生铁核桃种群共46个材料进行遗
传多样性分析，结果表明铁核桃遗传多样性水平略
高于核桃群体，群体内遗传多样性大于群体间。
Kafkas等[17]利用8对引物对土耳其21个基因型的核
桃进行AFLP及SAMPL(selective amplification of
microsatellite polymorphic loci )分析，获得230个条
带，其中50.4%具有多态性；对于区分亲缘关系非
常近的基因型，SAMPL比AFLP更有效。Bayazit等[18]
对土耳其核桃22个品种进行AFLP标记分析，5对引
物分析表明这些适于低温的核桃品种有很小的遗传
差异。姜继元[19]用AFLP标记对甘肃地方核桃种质
资源遗传多样性进行分析，构建了69份核桃材料的
指纹图谱，分析了其遗传多样性，为核桃品种鉴
定、亲缘关系分析、高密度遗传图谱构建等奠定了
基础。金强等[20]用AFLP技术对新疆122份核桃种质
材料进行了遗传多样性和亲缘关系的分析，聚类结
果很好地将栽培种质和古老种质分开，表明新疆不
同地区的核桃种质间存在明显的遗传多样性。
2.4　SSR及其在核桃遗传多样性分析的应用
2.4.1　SSR 原理及特点
简单重复序列(SSR)又叫微卫星，是由Moore等
于1991年创立的一种分子标记技术[21]。微卫星DNA
是指含少数几个碱基对的短串联重复DNA序列，由
1~7个核苷酸串联重复而成，广泛分布于基因组
中，其串联重复程度在不同材料间存在多态性，因
此可作为分子标记。由于微卫星两侧序列是单拷贝
序列，因此可根据两侧序列设计一对特异引物，通
过PCR和电泳可检测串联重复的长度多态性[5]。
SSR数量丰富，在许多种属的植物中都存在且
均匀分布在整个植物的基因组中；为共显性标记，
可鉴别出纯合子和杂合子；兼具PCR优点，所需
DNA样品量少，且对DNA质量要求不高；重复性
好，结果稳定可靠；操作相对比较简单。不足之处
在于对于开发新的SSR标记需要投入大量人力物
力，有一定难度且费用较高[22]。
2.4.2　SSR在核桃遗传多样性分析的应用
王滑等[22]利用SSR标记对我国核桃8个天然居
群进行了遗传多样性分析，结果表明云南丽江铁
核桃居群遗传多样性最高且8个居群两两间的遗传
距离与其地理距离有显著的相关性。郝艳宾等[23]
利用从黑核桃中开发出的9对SSR引物对我国核桃
组种质资源进行了分析，结果表明铁核桃与西藏
核桃的亲缘关系较近，认为铁核桃和西藏核桃作
为核桃种下的一个生态类型可能更为合适。杨本
芸等[24]应用SSR技术用筛选出10对引物对21个核
桃品种和1个枫杨品种的基因组DNA进行遗传多
样性研究，发现依据SSR特征谱带可直接鉴别出
供试品种。
生命科学 第23卷320
2.5　ISSR及其在核桃遗传多样性分析的应用
1994年Zietkiewicz等[25]对SSR技术进行了发
展，建立了简单重复间区(ISSR)或以微卫星为引物
的 PCR 技术，即加锚微卫星寡核苷酸技术。采用
17~22个碱基的重复锚定引物扩增重复序列之间的
片段，ISSR标记使用比RAPD引物更长的引物，操
作简单，重复性好，多态性丰富。
郝艳宾等[26]运用Woeste等开发的30对黑核桃微
卫星引物扩增核桃属26个样品，证实黑核桃微卫星
在近缘种扩增位点等位基因数、期望杂合度和多态
性信息含量等方面比在黑核桃中有显著的下降趋
势，但仍有较高的多态水平，可以用于近缘种遗传
多样性研究、品种指纹分析以及核桃属种间关系研
究。Potter等[27]利用ISSR标记对48个核桃品种遗传
关系进行分析并用Neighbor-joining方法绘制了树状
遗传关系图，指出ISSR在分析种间的遗传关系上比
SSR标记更有优势。
2.6　其他分子标记在核桃遗传上的应用
朱艳等[28]利用生物信息学方法，通过对核桃
EST中SSR信息进行分析以及引物多态性的检测表
明，利用核桃EST序列开发EST-SSR标记是可行
的。王滑等 [ 2 9 ]对核桃与铁核桃的5个居群采用
ITS(internal transcribed spacers)序列多态性分析及
SSR分子标记技术，从分子水平上讨论了两个种的
亲缘关系，结果显示种间居群遗传距离与种内遗传
距离相近，种间差异不明显，这一结果说明两个种
应为不同的地理生态型。
马明等 [30]以核桃早实优系“绿园”和晚实优系
“绿丰”及其F1杂交后代为试材，结果表明SRAP
(sequence-related amplified polymorphism)标记的引
物设计和实验操作过程简单，扩增谱带清晰，结果
稳定，是一种吸收了 RFLP、RAPD、SSR和AFLP
标记的优点，而又克服了它们的一些缺点的一种新
型DNA分子标记，证明了SRAP标记完全可以应用
于核桃的遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图
谱的构建。
3　问题与展望
核桃遗传研究的传统方法主要是统计分析，范
志远和方文亮[31]对首次选用云南薄壳核桃与北方新
疆核桃早实优株杂交F1代坚果对早实性、丰产性
能、果实性状等7个主要性状的遗传分析表明：杂
种F1代坚果的主要性状广泛复杂分离，为多基因控
制，呈数量性状遗传。张雨等[32]对南北核桃杂交
F1代坚果品质、出仁率、核仁重等8个主要性状进
行了遗传分析，研究表明与范志远等的研究具有
相同的遗传趋势和特点。Sharma等[33] 对Himachal
Pradesh地区16个不同地理种源的核桃坚果特性的多
样性进行了研究，结果表明地理种源5和8的坚果特
性多样性指数最高，相同地区的核桃聚类模式显示
了多个聚类群的分布在地理环境与遗传多样性之间
表现出不平行性。但是传统遗传学研究方法容易受
到环境、发育时期、组织类别等的影响，对于育
种、新品种的选育等造成较大的困难，新品种的选
育等则需要较长的时间才能完成。
与传统遗传学方法相比，现在广泛应用的分子
标记技术不受环境、发育时期、组织类别的影响，
能从基因水平上提供完整的遗传信息，具有稳定、
效率高等特点。在过去的研究中，对于核桃属植物
分子水平的研究取得了很大的进展，但是仍存在一
些不足。以往研究中偏重于应用RAPD技术，RAPD
技术稳定性和重复性较差，近几年已经很少使用这
种技术，开始较多地使用AFLP、SSR以及新的分子
标记技术等。分子水平研究不够深入，分子生物学
及其他相关边缘学科的迅速发展，可以相互渗透结
合以开发出更多分析快、成本低、信息量更大的分
子标记。核桃等果树为多年生木本植物，个体大，
性周期长，建立遗传群体较为困难，影响分子标记
在果树遗传研究上的应用。与主要农作物和模式生
物相比，核桃属分子标记的研究起步较晚，基础
差，当前的研究过于局限于现有品种，没有建立起
健全的技术体系，今后可以利用分子标记手段，加
强现有栽培种、古老种质及野生种的研究和利用。
近年来，随着分子生物学的快速发展，分子标
记技术越来越广泛应用于生产实践中。考虑到成
本、操作技术等，分子标记仍需要进一步开发，以
得到成本低、操作方便、分析更快的标记技术。利
用分子技术建立核桃属核心种质资源，并将分子技
术与传统技术结合起来，获得有优良性状如抗病、
抗寒、高产的新品种，推进产业化、商业化发展，
从而提高产地人民生活水平。对于中国核桃发展面
临的品种化水平低、生产管理水平低、加工技术水
平低等问题，需要建立起健全的技术体系，将现有
的分子标记技术较好的结合起来以发挥更大的作用。
在核桃的遗传研究上，随着信息化的发展及DNA数
据库的完善，分子标记技术将发挥越来越大的作用。
高玉娜，等：分子标记及其在核桃遗传多样性研究中的应用第3期 321
[参　考　文　献]
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