全 文 ：第24卷 第5期
2012年5月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 24, No. 5
May, 2012
文章编号：1004-0374(2012)05-0404-07
单域抗体研究进展
潘　欣*，潘伯驹，蔡家麟，李　晗，王　颖，蓝乐夫，廖万清
(第二军医大学微生物学教研室，上海 200433)
摘　要：近年来用基因工程方法从软骨鱼和骆驼科动物中克隆到的单域抗体 (single-domain antibody, sdAb)
具有无轻链、单一重链可变区保留了完整的抗原结合活性的特征。这类单域抗体具有分子小、稳定性高、
体内组织渗透性好、可溶性好、易表达、抗原识别表位独特的特性，已引起生物技术研究与诊断治疗应用
领域的广泛关注，取得了快速发展。综述了这类单域抗体发展历史、分子类别、结构特征、理化特征、分
子演化及应用前景。
关键词：单域抗体；重链抗体；免疫球蛋白新抗原受体；骆驼科动物；软骨鱼
中图分类号：R392.11 文献标志码：A
Research progress in single-domain antibody
PAN Xin*, PAN Bo-Ju, CAI Jia-Lin, LI Han, WANG Ying, LAN Le-Fu, LIAO Wan-Qing
(Department of Microbiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
Abstract: Single-domain antibodies (sdAbs) with fully functional antigen-binding fragment are recently cloned
from the single variable domains of homodimeric lacking of light chains within cartilaginous fish and camelids by
genetic engineering approaches. The advantageous features of sdAbs include their small dimension, high apparent
stability, good tissue penetration in vivo, improved solubility, high expression, and the singularity of recognizing
epitopes. The field of the sdAbs technology has rapidly progressed during the most recent years, mainly because of
the interest in its using in biotechnological research and diagnostic and therapeutic applications. This minireview
offers an overview of the developmental history, molecular classifications, structure characteristics, physics and
chemistry properties, molecular evolution and application prospects of this kind of sdAbs.
Key words: single-domain antibody (sdAb); heavy-chain antibodies (HCAb); Ig new antigen receptor (IgNAR);
camelid; cartilaginous fish
收稿日期：2012-02-08； 修回日期：2012-03-16
基金项目：国家自然科学基金项目(30972633)
*通信作者：E-mail: xinpanpx@163.com; Tel: 021-
81870998
1　单域抗体的研究背景
Köhler 和 Milstein于 1975年提出的小鼠杂交
瘤技术为抗体技术向治疗性单克隆抗体 (monoclonal
antibody, MAb)的发展铺平了道路 [1]。由于功能性
MAb可以特异地找寻并杀伤表面被覆肿瘤相关抗
原的细胞，而对正常细胞仅有旁观者效应，成为临
床抗肿瘤药物研发的热点。但鼠源性MAb在其找
到肿瘤靶标时，已被识别为非人抗原，产生人抗鼠
抗体，引起从轻微过敏到严重过敏性休克等不良免
疫反应，严重限制了治疗性MAb的长期使用。若
仅保留鼠源性抗体中结合抗原的轻重链可变区片
段，而重链和 κ轻链的恒定区均用人源性 IgG1替换，
可使MAb人源化，即成为人鼠嵌合抗体。这种人
源化MAb可以在 65%的人群中发生免疫逃逸，实
现对肿瘤细胞的杀伤作用 [2]。截至 2005年，共有
206种抗肿瘤特异性 MAb进入临床试验，其中 9
种获得了美国食品与药物管理局的批准。MAb尤
其在抗血癌领域取得了很大成功 [3]。
由于大多数MAb不同批次之间变异较大，生
潘　欣，等：单域抗体研究进展第5期 405
产费用高、需时长，这种大型分子渗透进实体瘤、
透过血脑屏障时常常受阻；在或高或低的 pH环境
下不稳定，也不能口服，因此限制了其在诊断和治
疗领域的应用。为改善抗体的功能性 (如稳定性、
亲和性、特异性和大小 )、药代动力学属性，并获
得有活性的高产量抗体，一些学术团体改变研发策
略，采用标准的分子生物学操作技术，利用成对的
抗体可变区的抗原识别或结合亲和性，将 N-端结
合抗原的多结构域蛋白抗体最小化，如每条链仅含
1个恒定区的抗原结合片段 (antigen binding fragment,
Fab)，或仅含可变区不含恒定区的可变结构域片段
(variable domain fragment, Fv)[4]。
Fv又称为单链抗体 (single-chain variable fragment,
scFv)，最早由 Huston等 [5]于 1988年利用基因工程
技术制备，即在 DNA水平上将抗体分子的重链可
变区 (heavy-chain variable domain, VH) cDNA 3端与
轻链可变区 (light-chain variable domain, VL) cDNA 5
端之间用一段适当的寡核苷酸，一般为 (Gly4Ser)3
密码子，拼接起来，使之在适当的体系中表达成为
一条单一的肽链。scFv减少了抗体的鼠源成份，其
相对分子质量仅为原抗体的 1/6，约为 28 kDa，不
需糖修饰，却能较好地保持抗原的结合位点。由于
没有 Fc片段，不能与细胞的 Fc受体结合，故容易
穿过血管壁或组织屏障，而且在体内的半寿期短
(0.5~21 h)，周转快，与抗原形成的复合物更易被清
除，很适合用作中和抗体来阻断病毒或其他胞内毒
性损伤的病理过程 [6]。scFv的细菌表达系统由于包
涵体、重链可变区折叠占位影响轻链可变区折叠等
问题，导致产量低、活性弱，应用受到一定限制 [7]。
其真核表达系统、噬菌体展示系统和植物表达系统
使用基因工程、高通量热稳定性筛选等方式，获得
了一批在肿瘤定位、活体诊断成像、心血管疾病预
警与治疗、细菌毒素检测、避孕药物与不育诊断等
领域有潜在临床应用前景的产品 [8-12]。然而由于异
源表达系统产生的 scFv功能、产量尚不理想，成
为发展临床治疗性目的产品的一大障碍。
为进一步小化 Fv片段，制备基于单一结构域
的识别单元，早在 1964年 Utsumi和 Karush[13]就发
现抗体的重链在没有轻链伴护时也能结合抗原。
1989年，Ward等 [14]从免疫小鼠的重链可变区细菌
表达文库中分离到有结合活性的单一重链可变区结
构域，并称之为单域抗体 (single domain antibodys,
dAbs)。但这种抗体的亲和性约为 Fab的 0.4%，应
用前景并不乐观。
适应性免疫系统的核心成分是抗原受体，主要
包括免疫球蛋白 (immunoglobulin, Ig)和 T细胞受体
(T cell receptor, TCR)。在高等脊椎动物中，Ig分子
通常被认为是由两条轻链 (light chain, L)和两条
重链 (heavy chain, H)组成的蛋白四聚体 (H2L2)
[15]。
1993 年，在哺乳类骆驼科动物 (Camelidae) 的体
液免疫系统中发现其免疫球蛋白 IgG 有两类结
构：一类是 IgG1，为重链和轻链的异型四聚体
(heterotetramer)，相对分子质量约 150 kDa；另一类
是在血清 IgG中占 50%左右的，相对分子质量约
92 kDa的 IgG2和约 90 kDa的 IgG3，均为重链的
同型二聚体 (homo-dimeric heavy-chain)。这种天然
缺失轻链的抗体，又被称为重链抗体 (heavy-chain
antibodies, HCAb)，存在于亚洲的西亚骆驼 (Camelus
bactrianus)、非洲的单峰驼 (Camelus dromedarius)
和南美洲的大羊驼 (Lama glama)、原驼 (Lama guanicoe)、
羊驼 (Vicugna pacos)和小羊驼 (Vicugna vicugna)等
种类的偶蹄目 (Artiodactyla)胼足亚目 (Tylopoda)
骆驼科 (Camelidae)动物中，但在偶蹄目的猪形亚
目和反刍亚目动物的血清中未查见 HCAb[18-19]。不
同种类的骆驼科动物其 HCAb单体的相对分子质量
不尽相同，约为 43~47 kDa[16]，比 IgG1的重链单
体小约 10 kDa。重链二聚体并不是骆驼在疾病条
件下意外产生的 [17]。1995年以后，又相继在护士
鲨 (Ginglymostoma cirratum)、斑纹须鲨 (Orectolobus
maculatus)、银鲛、鳐等软骨鱼中发现了无轻链或
其他蛋白分子伴随的类似于 HCAb的新的或护士鲨
抗原受体 (new or nurse shark antigen receptor, NAR)。
由于 NAR分子与 Ig亚型在跨膜和分泌方式等几个
功能特征方面近似，因此也称为免疫球蛋白新抗原
受体 (Ig new antigen receptor, IgNAR)[20]。
通过基因工程技术可以获得保留抗原结合活性
的 HCAb或 IgNAR的重链可变区，也称为单域抗
体 (single-domain antibody, sdAb)。Ablynx、Domantis
和 Genmab等一些生物制药技术公司为实现重组小
分子抗体易筛选、易生产的目标 [21]，称之为纳米抗
体 (nanobody, Nb)、域抗体 (domain antibody, dAb)
或单抗体 (unibody)，并加大投入，促使这类候选小
型化抗体加速进入临床前研发阶段，为药物研发与
治疗创造便利 [22]。
2　单域抗体的特性
2.1　单域抗体的类别
用基因工程方法获得的 sdAb主要有三类，第
生命科学 第24卷406
一类是从骆驼科动物 HCAb获得的重链可变区，为
单一的折叠单元，保留了完整的抗原结合活性，是
最小的天然抗体片段 [23]。HCAb中的这种由重链可
变区结合抗原的单一结构域构成的抗体称为单域重
链抗体 (variable domain of the heavy-chain of heavy-
chain antibody, VHH)，直径约 2.5 nm，长约 4 nm，
相对分子质量约 15 kDa[24]。第二类是从鲨鱼等软骨
鱼 IgNAR获得的重链可变区，用 VNAR表示。第三
类是从人源或鼠源单克隆抗体获得的重链或轻链可
变区，它们虽保留了抗原结合特异性，但因亲和性
和可溶性大为下降，发展前景堪忧。
2.2　骆驼科动物HCAb形成的分子基础
通常抗原受体每条肽链的基因都是通过可变片
段 (variable region, V)、多样性片段 (diversity, D)、
连接片段 (joining region, J)和恒定片段 (constant
region, C)连接起来进行表达。H2L2的轻链与重链
的第一恒定区 (first constant domain, CH1)和重链可
变区 (VH)结合。在羊驼中，产生四聚体和二聚体
两种结构类型 IgG H链的所有遗传学元件都定位于
4号染色体上，在典型的 Vn-Dn-Jn-Cn基因组织装配
中，发生 VH与 VHH基因和 CH与 CHH基因混合排
列 [25]。而 HCAb由于在 H链 CH1外显子∕内含子
交接部位存在一个终止密码和一个移码突变，阻止
了功能性 CH1的翻译；CH1外显子 3侧的 GT二核
苷酸基序转换成了 AT基序，使拼接共识信号 (splice
consensus signal)缺失，造成 3端裂解失活，CH1外
显子不能与铰链区外显子拼接，最终导致重链可变
区与铰链区之间的 CH1缺失
[26]。因此，骆驼科动物
的 HCAb是由单一的可变区、一个铰链区和两个恒
定区 (CH2和 CH3)组成
[27]。
通常 Ig的 VH由 4个框架区 (framework region,
FR；负责蛋白质架构和折叠 )和 3个抗原结合环或
互补决定区 (complementarity-determining region, CDR；
负责与抗原相互作用，高度异变 )组成 [28]。骆驼
科动物 VHH 的 FR2 中的带电荷∕极性亲水氨基
酸残基取代了 VH中的疏水氨基酸残基 (即 VH中的
L11被 S取代，V37被 F或 Y取代，G44被 E或 Q
取代，L45被 R或 C取代，W47被 G或 F或 S或
L取代 )[29-30]。这种取代部分消除了VHH的凝集趋势。
传统抗体 VH中 FR2的 44~47位的氨基酸残基可与
内质网的 BiP蛋白结合，BiP蛋白是一种伴护分子，
主要帮助新合成多肽链折叠并防止其凝集；传统抗
体从内质网分泌出来之前，BiP蛋白被 L链取代，
完成抗体装配过程。而在 HCAb的 VHH中，该部
位的氨基酸被取代，不能被 BiP识别，HCAb可以
迅速从细胞中分泌到循环系统 [31]。
由于 CH1缺失和亲水性取代使重链和轻链之间
不能形成疏水相互作用，无法配对二聚体化，因此
HCAb仅有唯一的抗原结合结构域 VHH，结构紧凑。
2.3　骆驼科动物VHH的类型
根据 FR1和 FR3线性间隔的核苷酸或氨基酸
序列同源性，传统的 VH可以分成Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ共 3
个族 (clan)，3个族还可再细分为若干家系 (family)，
Ⅰ族包括人的 VH1、VH5和 VH7家系，小鼠的 J558
和 Vgam3.8(VH9) 家系；Ⅱ族包括 VH Ⅱ亚族 ( 人
VH2，小鼠 3609)和 VHⅣ亚族 (人 VH4和 VH6，小
鼠 Q52、36-60、VH12)；Ⅲ族包括人的 VH3家系，
小鼠 7183、T15、J606、X24、VH10、VH11和 VH13
[32]。
从未免疫、独立抗原或联合抗原免疫的骆驼科
动物的外周血、淋巴结、脾获得的 VHH属于Ⅲ族
家系 3(简写为 VH3)，数据库中目前已有 1 152条序
列，至少可以再细分为 VHH1~4四个亚家系
[33]。
通常，高变区主链经常呈现的构象称为规范结构
(canonical structure)[34]，VHH 中 CDR1 与 CDR2 的
主链规范结构与传统的明显不同；而且，不同的
VHH亚家系有不同的 CDR1和 CDR2规范结构。
VHH1和 VHH2的 CDR3长度较短，没有超过传统
VH 的 CDR3平均长度，但仍然保持高度的可溶性、
稳定性和结合抗原的功能性；只有 VHH3和 VHH4
的 CDR3较长 [33]，氨基酸残基数达到 16~24个，远
远超过传统 VH 的 7~9个氨基酸残基的数量，形成
的指状凸环能嵌入抗原分子沟槽或裂隙内，增大与
抗原相互作用的面积 [35]。VHH各亚家系中 FR1和
FR3的氨基酸序列彼此同源，且均与人或小鼠 VH
Ⅲ族的家系 3同源 [36]。一些研究小组利用这些结构
特性将人或小鼠家系 3的VH结构骆驼化 (camelize)，
即仅将人或小鼠 FR2的关键疏水氨基酸残基骆驼
化，构建人或小鼠的抗原结合 dAb噬菌体文库，筛
选到的骆驼化单域重链抗体可溶性好，凝集性显著
降低 [37]。
用从感染的小鼠获得的树突状细胞 (dendritic
cell, DC)免疫骆驼科动物，可以获得属于Ⅱ族 VH4
家系的 HCAb。这种 HCAb又称美洲驼 VH4，与人
Ig VH4氨基酸残基序列相似性很高，其 CDR1和
CDR2抗原结合环近似于人 VH4的规范环结构。
CDR3环长变化较大，7~22个氨基酸残基不等。虽
然美洲驼 VH4在 HCAb池中出现的频率较低，但维
持其可溶性、稳定性和特异性抗原识别单元的序列
潘　欣，等：单域抗体研究进展第5期 407
与人 VH相似性更高，比属 VH3的 HCAb更适合于
人源化以进一步缩小免疫原性 [38]。
2.4　IgNAR与VNAR的结构特征
IgNAR蛋白是一种二聚体，每条链由 1个可
变区 (VNAR)和 5个恒定区 (CNAR)构成。没有 L链或
其他任何蛋白伴随此二聚体。电镜显示 IgNAR的
V区不同于传统的 Ig和 TCR，不形成二聚体，而
是相当独立的柔性区。利用基因工程技术可将
IgNAR的抗原结合柔性可变区表达成独立的可溶性
蛋白，称为鲨鱼单域抗体 (shark sdAb)，用 VNAR表
示 [39]。VNAR根据二硫键和软骨鱼的发育时段分为Ⅰ、
Ⅱ和Ⅲ共 3种类型，Ⅰ型仅存于护士鲨，Ⅲ型主要
存在于鲨鱼胚胎中，是抗原驱动的免疫反应成熟之
前抵抗病原体的第一道防线 [40]。3种类型均含有 4
个保守的框架区和 2个互补决定区，CDR1很短，
多样性有限；CDR3较长，约 5~23个氨基酸残基，
多样性高；缺少传统的 CDR2，相关位置被分子中
部的短 β-转角替代，该位于 FR2-CDR2内的环状
区域名为超变区 2(hypervariable region 2, HV2)[41]；
在 HV2 和 CDR3 之间还有一个名为超变区 4
(hypervariable region 4, HV4)的环状结构，与 T细
胞受体的 HV4同源。HV2和 HV4可能参与抗原结
合 [42]。
2.5　患者体内的重链二聚体
多年前已在中东和地中海的 400多例人类疾病
如重链病 (heavy chain disease, HCD)患者的 BUR蛋
白和多发性骨髓瘤患者的本斯 -琼斯蛋白 (Bence-
Jones protein，也称凝溶蛋白或本周蛋白 )中发现，
这些蛋白都为缺失 CH1、VH不与 VL结合的重链二
聚体，VH的相对分子质量为 Fab的 1/4，是 scFv的
一半 [43]。这类重链二聚体的 FR2关键氨基酸残基
没有发生亲水突变，易形成淀粉样沉积或胞内结晶，
没有抗原结合功能，没有研发潜力 [44-45]。
3　获取VHH的途径
通常可采用标准的免疫程序 (完全和不完全弗
氏佐剂先后与 50 μg~1 mg免疫原混合分 3~4次免
疫动物 )免疫单只骆驼科动物，获得滴度较好的特
异性单域重链抗体。一般可以从 1 mL免疫血清中
收获大约 0.1 mg多克隆 HCAb [46]。HCAb具有易表
达、可溶性好、稳定性强等优点，其结合亲和性接
近传统抗体，可低至 100 pmol/L[47]。利用金黄色葡
萄球菌 V8 蛋白酶可以将 HCAb从可变区和 CH2之
间的短铰链区切开，通过葡萄球菌 A蛋白层析吸附
Fc段，收集流出的重链可变区，即 VHH。VHH抗
原结合范围很广，既可以结合半抗原小分子，也可
以结合大蛋白；因其可以深入到酶的活性部位，还
能抑制酶的活性 [37]。
重组 VHH可以通过两轮聚合酶链式反应 (poly-
merase chain reaction, PCR)避开传统 VH基因的干
扰，将特异性 VHH基因克隆到细菌表达体系中，
通过与特异性抗原结合的特性从表达文库中筛选出
需要的 VHH。通常第一轮 PCR扩增的是从 VH基因
的起始密码到 CH2之间的所有 γ- 亚型。由于
HCAb缺失 CH1外显子，其 γ-亚型约 350个核苷
酸残基，可以通过琼脂糖凝胶电泳分离出来。第二
轮 PCR从分离产物中扩增 FR1到 FR4之间的区段，
扩增产物连接到噬菌体展示载体上，构建成拥有
106~107个独立克隆的 VHH文库，并从中筛选出几
个与抗原结合的 VHH。从免疫到获得 VHH通常至
少需要 3个月 [37]。从非免疫动物构建的文库中筛选
到的 VHH通常仅占免疫所得的 10%，这种非免疫
文库一般不受研究小组的推崇 [28]。但也有研究小组
从构建的非免疫人源 Fab噬菌体展示文库中筛选出
能与 HIV病毒包膜糖蛋白 gp140结合的 sdAb，其
核酸序列在轻链起始处缺失了一个核苷酸而形成移
码突变产生了一个终止密码子，这种天然的人源
sdAb不需要骆驼化就表现出非常好的可溶性、稳
定性和抗原结合活性 [48]。
VHH在大肠埃希菌中摇瓶培养的表达水平通常
为 10 mg/L；而用酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
摇瓶培养可以达到 100 mg/L以上，10 L补料分批
发酵可以达到 1 g/L以上，15 m3发酵可以达到 1 kg
以上 [27]，适合于大规模生产。酿酒酵母是一种公认
不产生任何毒素的安全真核微生物，在生长过程中
不分泌太多同源蛋白，而高效表达的外源蛋白是生
长介质中的主要成分，这样可以简化下游的处理过
程；另外，酵母含有内质网和高尔基体等类似于哺
乳动物细胞系统的分泌细胞器，可以有效地形成分
子内二硫键，产生糖基化的外源蛋白 [49]。酵母内质
网中的 Kar2p与伴护分子 BiP同源，Kar2p与 VHH
J片段的相互作用与VHH在酵母中的产量密切相关，
将筛选到的高产 J基因植入到其他需高表达的 VHH
中，就可能提高所需 VHH的产率
[50]。然而，用酵
母表达的VHH可能因N-端糖基化而影响抗原结合，
而且酵母中的高浓度甘露低聚糖会使免疫原性升
高；与网状内皮细胞上甘露糖受体的结合也会降低
其在血清中的半寿期 [26]。因此，酵母表达系统目前
生命科学 第24卷408
主要用于制备杀微生物剂。
4　VHH的理化特征
从免疫单峰骆驼构建的噬菌体展示文库中
筛选得到的人癌胚抗原 (carcinoembryonic antigen,
CEA)单域重链抗体对CEA的结合亲和性为 0.34~55
nmol/L，不逊于小鼠或人抗 -CEA单链抗体对 CEA
的结合亲和性 (分别为 2.5 nmol/L或 7.7 nmol/L)。
VHH熔解温度为 63~78 ℃，远远超过人 VH或 scFv
的熔解温度 (分别为 56.6 ℃或 57 ℃ )[51]。VHH展开
自由能为 21~57 kJ/mol，与人VH3的 40~53 kJ/mol相似。
VHH可溶性非常好，在普通缓冲液中可轻易浓
缩到 10 mg/mL而不出现积聚，由于其具有可逆重
折叠性质，在高温 (80~92 ℃ )和高浓度变性剂作用
下仍保持抗原结合活性。这些特性使 VHH在层析
或无菌处理时的短暂变性或在污染或有机溶剂等
不良环境中仍能出色地长期维持生物学活性 [37]。因
此，VHH可以加入洗发水中预防头皮屑
[52]，野外
部署生物传感器，监测严酷条件下的微生物病原体
和毒素 [53]。
5　演化地位
系统发育分析认为大约 3.5亿年前软骨鱼类免
疫系统的 T细胞受体就存在单域 V(也称为 NAR-
TCR)，约 2.2亿年前所有板鳃亚纲的物种中均出现
了 IgNAR。IgNAR起源于一个古老的、不确定的
演化事件，其祖先是 TCR还是 Ig，还是有一个共
同的抗原受体祖先，目前尚不明确。
编码 HCAb的 γ基因衍生于编码传统抗体的 γ
基因。大约6 000万~8 000万年前胼足亚目 (Tylopoda)
从其他哺乳类动物中分离出来，约 2 500万年前该
基因出现并产生分歧，约 1 100万年前骆驼属和羊
驼属物种形成，HCAb的出现是这些物种相对近期
发生的事件 [19]。
HCAb和 IgNAR的演化驱动力目前还令人费
解，或许高盐或高尿素环境是免疫系统选择分叉的
驱动力之一。
6　VHH的应用前景与存在的问题
由于骆驼科动物比软骨鱼类更容易饲养和免
疫，因而更易被研究人员选择使用。VHH比 scFv
结构更简单，易与受体结合、可以识别嵌入配体沟
槽或夹在两个亚基之间的隐藏抗原表位 [54]，而且相
对分子质量更小，免疫原性低、积聚沉淀趋势低、
生物分散性好，具有易表达、可溶性好、稳定性强，
在极端 pH、高浓度变性剂或高温等不利理化环境
条件下稳定，保质期长，可以口服或呼吸道给药等
突出优点，在探索抗原受体起源、研发疫苗、治疗
药物、诊断试剂和生物技术研究工具等方面取得了
长足的进展。Ablynx生物制药公司已用骆驼科动物
研发了针对 220种疾病的单域抗体，其中抗血栓单
域抗体已进入Ⅱ期临床 [55]。
VHH分子小，组织渗透性强，可以穿透或转移
进入血脑屏障，也可以快速经肾脏滤过 (肾脏截留
值约 60 kDa)，血液中半寿期约 2 h，虽不适合感染
或炎症疾病的治疗，但由于其表位靶向的唯一性，
人们将其作为新一代癌症治疗载体，携带毒性物质
靶向如实体瘤内呈现受阻的抗原，处理毒蛇咬伤 [26]，
作为杀微生物剂中和 HIV[52]；也将其用于体内分子
成像诊断，从分子和细胞水平实现对生命体系的无
创描绘和测量过程可视化展现 [56]。
在过去的几十年里，为促进经济开发，南美的
骆驼科动物的生产繁殖研究已得到加强，形成新的
皮毛、肉类等区域产品。在某些地区，这些动物还
被用作交通工具或家庭宠物 [30]。2002年羊驼引入
中国，青岛畜牧科技示范园和山西榆次中华羊驼养
殖基地目前是国内有一定规模的羊驼养殖场所。受
羊驼价格因素影响，我国目前在 HCAb领域的研究
尚处于起步阶段。
[参　考　文　献]
[1] Köhler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells
secreting antibody of predefined specificity. 1975. J Im-
munol, 2005, 174: 2453-5
[2] Reichert JM, Rosensweig CJ, Faden LB, et al. Monoclonal
antibody successes in the clinic. Nat Biotechnol, 2005, 23:
1073-8
[3] Zhu Z, Yan L. Next generation of antibody therapy for
cancer. Chin J Cancer, 2011, 30: 293-302
[4] Sundberg EJ, Mariuzza RA. Molecular recognition in
antibody-antigen complexes. Adv Protein Chem, 2002, 61:
119-60
[5] Huston JS, Levinson D, Mudgett-Hunter M, et al. Protein
engineering of antibody binding sites: recovery of specific
activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue
produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA,
1988, 85: 5879-83
[6] Rondon IJ, Marasco WA. Intracellular antibodies
(intrabodies) for gene therapy of infectious diseases. Annu
Rev Microbiol, 1997, 51: 257-83
[7] Miller BR, Demarest SJ, Lugovskoy A, et al. Stability
engineering of scFvs for the development of bispecific and
multivalent antibodies. Protein Eng Des Sel, 2010, 23:
潘　欣，等：单域抗体研究进展第5期 409
549-57
[8] Scott N, Reynolds CB, Wright MJ, et al. Single-chain Fv
phage display propensity exhibits strong positive
correlation with overall expression levels. BMC
Biotechnol, 2008, 8: 97
[9] Iwamoto S, Fujita Y, Kakino A, et al. An alternative
protein standard to measure activity of LOX-1 ligand
containing apoB (LAB) - utilization of anti-LOX-1 single-
chain antibody fused to apoB fragment. J Atheroscler
Thromb, 2011, 18: 818-28
[10] Samuel AS, Naz RK. Isolation of human single chain
variable fragment antibodies against specific sperm
antigens for immunocontraceptive development. Hum
Reprod, 2008, 23: 1324-37
[11] Singh PK, Agrawal R, Kamboj DV, et al. Construction of
a single-chain variable-fragment antibody against the
superantigen Staphylococcal enterotoxin B. Appl Environ
Microbiol, 2010, 76: 8184-91
[12] Hagemeyer CE, von Zur Muhlen C, von Elverfeldt D, et
al. Single-chain antibodies as diagnostic tools and
therapeutic agents. Thromb Haemost, 2009, 101: 1012-9
[13] Utsumi S, Karush F. The subunits of purified rabbit
antibody. Biochemistry, 1964, 3: 1329
[14] Ward ES, Güssow D, Griffiths AD, et al. Binding activities
of a repertoire of single immunoglobulin variable domains
secreted from Escherichia coli. Nature, 1989, 341: 544-6
[15] 潘欣. 医学生物侦检与防护技术概论. 北京: 军事医学
科学出版社, 2011
[16] Wesolowski J, Alzogaray V, Reyelt J, et al. Single domain
antibodies: promising experimental and therapeutic tools
in infection and immunity. Med Microbiol Immunol,
2009, 198: 157-74
[17] Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, et al.
Naturally occurring antibodies devoid of light chains.
Nature, 1993, 363: 446-8
[18] Muyldermans S, Lauwereys M. Unique single-domain
antigen binding fragments derived from naturally
occurring camel heavy-chain antibodies. J Mol Recognit,
1999, 12: 131-40
[19] Flajnik MF, Deschacht N, Muyldermans S. A case of
convergence: why did a simple alternative to canonical
antibodies arise in sharks and camels? PLoS Biol, 2011, 9:
e1001120
[20] Roux KH, Greenberg AS, Greene L, et al. Structural
analysis of the nurse shark (new) antigen receptor (NAR):
Molecular convergence of NAR and unusual mammalian
immunoglobulins. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95:
11804-9
[21] de Marco A. Biotechnological applications of recombinant
single-domain antibody fragments. Microb Cell Fact,
2011, 10: 44
[22] Vincke C, Loris R, Saerens D, et al. General strategy to
humanize a camelid single-domain antibody and identifica-
tion of a universal humanized nanobody scaffold. J Biol
Chem, 2009, 284: 3273-84
[23] Bond CJ, Marsters JC, Sidhu SS. Contributions of CDR3
to VHH domain stability and the design of monobody
scaffolds for naive antibody libraries. J Mol Biol, 2003,
332: 643-55
[24] Barar J, Javadzadeh AR, Omidi Y. Ocular novel drug
delivery: impacts of membranes and barriers. Expert Opin
Drug Deliv, 2008, 5: 567-81
[25] Achour I, Cavelier P, Tichit M, et al. Tetrameric and
homodimeric camelid IgGs originate from the same IgH
locus. J Immunol, 2008, 181: 2001-9
[26] Woolven BP, Frenken LG, van der Logt P, et al. The
structure of the llama heavy chain constant genes reveals a
mechanism for heavy-chain antibody formation.
Immunogenetics, 1999, 50: 98-101
[27] Deffar K, Shi HL, Li L, et al. Nanobodies - the new
concept in antibody engineering. Afr J Biotechnol, 2009,
8: 2645-52
[28] Harmsen MM, De Haard HJ. Properties, production, and
applications of camelid single-domain antibody fragments.
Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 77: 13-22
[29] Maass DR, Sepulveda J, Pernthaner A, et al. Alpaca (Lama
pacos) as a convenient source of recombinant camelid
heavy chain antibodies (VHHs). J Immunol Methods,
2007, 324: 13-25
[30] Saccodossi N, De Simone EA, Leoni J. Structural analysis
of effector functions related motifs, complement activation
and hemagglutinating activities in Lama glama heavy
chain antibodies. Vet Immunol Immunopathol, 2012, 145:
323-31
[31] Su C, Nguyen VK, Nei M. Adaptive evolution of variable
region genes encoding an unusual type of immunoglobulin
in camelids. Mol Biol Evol, 2002,19: 205-15
[32] Kirkham PM, Mortari F, Newton JA, et al. Immunoglo-
bulin VH clan and family identity predicts variable
domain structure and may influence antigen binding.
EMBO J, 1992, 11: 603-9
[33] Harmsen MM, Ruuls RC, Nijman IJ, et al. Llama heavy-
chain V regions consist of at least four distinct subfamilies
revealing novel sequence features. Mol Immunol, 2000,
37: 579-90
[34] Chothia C, Lesk AM. Canonical structures for the
hypervariable regions of immunoglobulins. J Mol Biol,
1987, 196: 901-17
[35] Desmyter A, Decanniere K, Muyldermans S, et al. Antigen
specificity and high affinity binding provided by one
single loop of a camel single-domain antibody. J Biol
Chem, 2001, 276: 26285-90
[36] Nguyen VK, Hamers R, Wyns L, et al. Camel heavy-chain
antibodies: diverse germline V(H)H and specific
mechanisms enlarge the antigen-binding repertoire.
EMBO J, 2000, 19: 921-30
[37] Holt LJ, Herring C, Jespers LS, et al. Domain antibodies:
proteins for therapy. Trends Biotechnol, 2003, 21: 484-90
[38] Deschacht N, De Groeve K, Vincke C, et al. A novel
promiscuous class of camelid single-domain antibody
contributes to the antigen-binding repertoire. J Immunol,
2010, 184: 5696-704
[39] Liu JL, Anderson GP, Goldman ER. Isolation of anti-toxin
single domain antibodies from a semi-synthetic spiny
生命科学 第24卷410
dogfish shark display library. BMC Biotechnol, 2007, 7:
78
[40] Streltsov VA, Varghese JN, Carmichael JA, et al.
Structural evidence for evolution of shark Ig new antigen
receptor variable domain antibodies from a cell-surface
receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101: 12444-9
[41] Dooley H, Stanfield RL, Brady RA, et al. First molecular
and biochemical analysis of in vivo affinity maturation in
an ectothermic vertebrate. Proc Natl Acad Sci USA, 2006,
103: 1846-51
[42] Stanfield RL, Dooley H, Verdino P, et al. Maturation of
shark single-domain (IgNAR) antibodies: evidence for
induced-fit binding. J Mol Biol, 2007, 367: 358-72
[43] Corcos D, Osborn MJ, Matheson LS. B-cell receptors and
heavy chain diseases: guilty by association? Blood, 2011,
117: 6991-8
[44] Prelli F, Frangione B. Franklin’s disease: Igγ 2 H chain
mutant BUR. J Immunol, 1992, 148: 949-52
[45] Khamlichi AA, Aucouturier P, Preud’ homme JL, et al.
Structure of abnormal heavy chains in human heavy-
chain-deposition disease. Eur J Biochem, 1995, 229: 54-
60
[46] Riechmann L, Muyldermans S. Single domain antibodies:
comparison of camel VH and camelised human VH
domains. J Immunol Methods, 1999, 231: 25-38
[47] Cortez-Retamozo V, Backmann N, Senter PD, et al.
Efficient cancer therapy with a nanobody-based conjugate.
Cancer Res, 2004, 64: 2853-7
[48] Chen W, Zhu Z, Feng Y, et al. Construction of a large
phage-displayed human antibody domain library with a
scaffold based on a newly identified highly soluble, stable
heavy chain variable domain. J Mol Biol, 2008, 382: 779-
89
[49] van der Vaart JM. Expression of VHH antibody fragments
in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol, 2002,
178: 359-66
[50] Gorlani A, Lutje Hulsik D, Adams H, et al. Antibody
engineering reveals the important role of J segments in the
production efficiency of llama single-domain antibodies in
Saccharomyces cerevisiae. Protein Eng Des Sel, 2012, 25:
39-46
[51] Sircar A, Sanni KA, Shi J, et al. Analysis and modeling of
the variable region of camelid single-domain antibodies. J
Immunol, 2011, 186: 6357-67
[52] van der Linden RH, Frenken LG, de Geus B, et al.
Comparison of physical chemical properties of llama
VHH antibody fragments and mouse monoclonal
antibodies. Biochim Biophys Acta, 1999, 1431: 37-46
[53] Graef RR, Anderson GP, Doyle KA, et al. Isolation of a
highly thermal stable lama single domain antibody specific
for Staphylococcus aureus enterotoxin B. BMC Biote-
chnol, 2011, 11: 86
[54] Laeremans T, van Bergen En Henegouwen PM, Silence K,
et al. Single domain antibodies directed against epidermal
growth factor receptor receptor and uses therefor: United
States, US 2011/0184151 A1[P]. 2011-07-28
[55] Arbabi Ghahroudi M, Desmyter A, Wyns L, et al.
Selection and identification of single domain antibody
fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett,
1997, 414: 521-6
[56] Dolk E, van der Vaart M, Lutje Hulsik D, et al. Isolation
of llama antibody fragments for prevention of dandruff by
phage display in shampoo. Appl Environ Microbiol, 2005,
71: 442-50