全 文 ：第24卷 第3期
2012年3月
Vol. 24, No. 3
Mar., 2012
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2012)03-0223-05
RNA干扰引起的非特异性免疫反应及其机制研究探讨
吴江锋1,2，张贺吉1，柳长柏1*
(1 三峡大学分子生物学研究所，宜昌 443002；2 三峡大学医学院，宜昌 443002)
摘　要：基因的表达失控是疾病发生的主要原因之一，干扰靶基因的表达可能成为有效的治疗手段。RNA
干扰技术是近年兴起的基因调控干预方法，其基础，特别是应用研究极受关注，人们期待 RNA干扰能成
为肿瘤、病毒感染等难治疾病的临床治疗手段。然而，这一新兴技术在应用研究过程中显现出诸多问题，
如细胞毒性、引起机体非特异性反应等等。就 RNA干扰引起的非特异性免疫反应展开综述，探讨其机制，
期望为 RNA干扰的应用研究提供一些思考。
关键词：RNA干扰；小干扰 RNA；非特异性免疫
中图分类号：Q291; Q52 文献标志码：A
Study in non-specific immune response and mechanisms induced
by RNA interference
WU Jiang-Feng1,2, ZHANG He-Ji1, LIU Chang-Bai1*
(1 Molecular Biology Institution of China Three Gorges University, Yichang 443002, China; 2 School of Medical Science
of the China Three Gorges Univisity, Yichang 443002, China)
Abstract: Since unregulated gene expression is one of the main causes of diseases, interfering of target gene
expression may become an effective treatment method. RNA interference technology has already been a method of
gene regulation in recent years and lots of people have expected that RNA interference technology can be applied to
deal with diseases such as tumor and viral infection. But in the process of its application, the RNA interference
technology has faced some deficiencies such as cytotoxicity and a series of non-specific reaction in the body and so
on. This paper reviews briefly relevant reports of the non-specific immune reactions and their mechanisms induced
by the RNA interference.
Key words: RNA interference; siRNA; non-specific immunity
收稿日期：2011-11-17； 修回日期：2012-02-17
基金项目：国家自然科学基金项目(81070348)；湖北
省卫生厅青年科技人才项目(QUX2010-28)
*通信作者：Tel: 0717-6397179; E-mail: cbliu@ctgu.edu.cn
RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 是指在进
化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded
RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解
的现象。因其具有针对性强、特异性高的特点，
RNAi技术被广泛应用于阻断或抑制基因表达，成
为基因治疗的新手段[1]。但是，随着对RNAi的深入
研究发现，小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)
的免疫副作用不容忽视，它主要通过激活天然免疫系
统，诱导炎症因子，如干扰素-α (interferon-α, IFN-α)、
肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor, TNF-α)、转
化生长因子-β (transforming growth factor-β, TGF-β)
和白介素-6 (interleukin-6, IL-6) 等的产生，导致机
体受损[2]，严重影响其应用。因此，减轻甚至消除
siRNA引起的免疫副作用将成为研究的新方向。本
文就RNAi技术引起的非特异性免疫反应作一综
述，为完善其临床应用奠定基础。
1　RNA干扰的基本原理
RNAi的机制迄今还在不断探索中，尚未完全
生命科学 第24卷224
明了。目前认为，参与 RNAi的小 RNA主要包括
siRNA 和 微 小 RNA(microRNA, miRNA)。miRNA
属于内源性的 RNA, 它首先由生物体自身的基因组
转录为呈茎环特征，大小为 70~90 nt且具有不完全
互补的双链 pre-miRNA，然后被运送到细胞质；而
siRNA属于外源性的，当病毒基因、转座子和人工
转入基因等外源性基因随机整合到宿主细胞基因
组后，利用宿主细胞转录为完全互补的双链 dsRNA。
pre-miRNA或 dsRNA经 Dicer酶切割成大小为 21~23
nt的双链 miRNA或 siRNA[3]。在解旋酶的作用下，
miRNA或 siRNA解链成正义链和反义链，在 ATP
的参与下，反义链与核酸内切酶、核酸外切酶、解
旋酶及 AGO2(Argonaute 2)等相关蛋白质结合形成
RNAi沉默复合物 (RNA-induced silencing complex,
RISC)。该 RISC对靶基因的 mRNA进行识别和降
解 [4]。由此可见，miRNAs调控着内源性的基因表达，
而 siRNAs是为了保持基因组的完整性，防止异物
或者外源性核酸的入侵。RNAi技术主要通过引入
外源性的 siRNA介导靶基因的特异性沉默 [5]。
2　RNAi技术引起的非特异性反应
2.1　脱靶效应
在 RNAi技术的应用过程中，siRNA除了与靶
基因结合之外，还可能与非靶基因结合，阻断非特
异性基因的表达，引起相应的并发症，称为 RNAi
的脱靶效应 (off-target effects of RNAi, OTEs)。这种
OTE可能是由于外源性 RNAi分子的转染激活了哺
乳细胞内抗病毒的干扰素通路，也可能是非靶基因
与 RNAi分子存在一定的核酸序列的同源性。在应
用过程中，前者可以避免，而后者较难预测。关于
非靶基因与 RNAi分子的同源性引起的 OTE，目前
可通过四个方面来解释：首先，RISC中反义链的 5
端的 2~8个碱基与 mRNA的配对是非常严格的，
但哺乳动物细胞能够耐受余下的碱基与 mRNA之
间错配；其次，正义链可能会插入到 RISC中代替
反义链；再次，RISC中反义链的 5端的 2~8个碱
基可能会像 miRNA一样，能识别、结合 mRNA的 3
端非编码区 (3 untranslated region, 3UTR)[6]；最后，
miRNA及其他内源性的 siRNA会竞争性结合 AGO2
等相关蛋白，从而降低外源性 siRNA的特异性识
别效率，进一步导致脱靶现象 [7]。
2.2　细胞质中的RNA感应元件介导的免疫反应
在细胞质中，外源性 dsRNA和 ssRNA 能被
相应的感应元件 (cellular sensors of foreign RNA)识
别，介导免疫应答，这些感应元件包括 Toll样受体
(Toll-like receptors, TLR)、PLR(RIG-1-like receptor)、
双链 RNA激活的蛋白激酶 (double-stranded RNA-
activated protein kinase，PKR)等 (图 1)[8]。
图1 细胞内dsRNA和ssRNA 的感应元件及其介导的免疫反应[8]
吴江锋，等：RNA干扰引起的非特异性免疫反应及其机制研究探讨第3期 225
2.2.1　TLR介导的免疫反应
目前已经确定的 TLR在人类是 10个，小鼠为 12
个，多数 TLR位于细胞膜表面，而 TLR3、TLR7、
TLR8和 TLR9位于细胞器内，主要表达在内质网、
高尔基体、溶酶体上，具有识别核酸的功能。当细
胞以内吞方式将细胞外核酸吞进溶酶体中，dsRNA
作为 TLR3的特异性配体，ssRNA作为 TLR7/8的
特异性配体，激活相应路径，介导天然免疫。这种
天然免疫反应的发生与 siRNA的自身序列和导入方
式存在很大的关联性，如 GU含量高或者核苷酸数
量多的 siRNA更易介导天然免疫 [9-12]。
2.2.1.1　TLR3与dsRNA　　TLR3属I型跨膜受体，
胞外区富含亮氨酸重复序列，跨膜区由21个氨基
酸残基组成，胞内区属于Toll /IL 1受体结构域(Toll/
interleukin-I receptor domain, TIR结构域)。病毒感染
细胞后，利用宿主细胞合成dsRNA，dsRNA作为一
种疾病相关分子模式 (pathogen-associated molecular
pattern, PAMP)被TLR3特异性识别，引起宿主细胞
的抗病毒应答[13]。2004年，Karikó等[14]发现，将特
异性siRNA或者shRNA转染到HEK293细胞中后，
出现了IFN-β表达轻度升高等RNAi靶向抑制之外
的副作用；当该细胞的TLR3受体高表达时，IFN-β
的表达上调；在加入抑制剂抑制TLR3的功能后，
IFN-β的表达也随之下调；若将siRNA和shRNA转
染到原代培养的人树突状细胞或者巨噬细胞中，
IFN-α、TNF-α和HLA-DR 的表达明显升高。因此，
RNAi技术的应用过程中会通过活化TLR3产生免疫
副作用。2009年，Cho等[15]研究发现，21 nt或更长
的非特异性siRNA会抑制角膜新生血管化和后肢新
生血管的生成，同血管内皮生长因子特异性siRNA
具有类似作用，但在淋巴管内皮细胞及血管内皮
细胞中并未找到该特异性siRNA的核苷酸片段，但
内皮细胞的凋亡指数增加，TLR3的表达上调并出
现磷酸化，可见，长度不小于21 nt的外源siRNA可
以通过TLR3的磷酸化来激活免疫系统，对细胞产
生一定的毒性。2011年，Farina等[16]利用dsRNA类
似物poly(I:C)刺激系统性硬化症小鼠的表皮细胞发
现，内皮素1、内皮素转化酶1和细胞黏附分子1的
表达都会升高；当系统性硬化症小鼠的IFN受体被
敲除后，三者在表皮细胞中的表达受到抑制；检测
TLR3信号相关蛋白缺陷的系统性硬化症小鼠时，
内皮素1和内皮素转化酶1降低，但细胞黏附分子1
的表达未受影响。因而，系统性硬化症在天然免疫
的病理机制方面可能是dsRNA通过激活TLR3来实
现的。
TLR3 介导 dsRNA 引起的免疫反应，主要
由 TLR3的 TIR结构域结合细胞质中的 TRIF(TIR-
domain-containing adapter-inducing interferon-β) 后，
TRIF 募 集 TRAF6(TNF receptor-associated factor 6)
和 RIP1(receptor-interacting protein 1)形成复合物，
进一步活化转录因子 IRF3、NF-κB、ATF2-C-Jun，
促进 IFN-α、IFN-β和 IL-6的表达，激活天然免疫
反应 [17-18]。
2.2.1.2　TLR7/ 8与ssRNA　　TLR7/8属于同一亚
型，具有天然识别ssRNA病毒的功能，前者主要
分布在B细胞和浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid
dendritic cells, pDC)，后者分布在单核细胞、巨
噬细胞和髓样树突状细胞(myeloid dendritic cells,
mDC)。2004年，Lund等[19]报道，当水疱性口炎病
毒(属于ssRNA病毒)感染鼠的pDC后，通过分泌高
水平的IFN-α和IL-12来抵抗病毒入侵，而TLR-/-小鼠
来源的pDC，对水疱性口炎病毒不应答。Welte等[20]
在研究西尼罗河病毒(WNV)时发现，将病毒分别注
射到野生型和TLR7-/-型小鼠皮肤，病毒会入侵到淋
巴结和周围组织中，并伴随DC的迁移和成熟。在
病毒感染小鼠的初期阶段，血液中的TNF-α、IL-6
和IL-12等细胞因子在野生型小鼠体内的表达高于
TLR7-/-型小鼠，但皮肤内的角蛋白细胞数量低于
TLR7-/-型，这表明当WNV病毒感染小鼠皮肤后，
机体会通过角蛋白细胞内的TLR7反应促成DC的迁
移，加速病毒扩散，最终激活全身免疫系统。随
着ssRNA病毒感染与TLR7活化机制之间的研究发
现，外源性寡核苷酸或者ssRNA，特别是富含尿
苷酸和鸟苷酸的ssRNA链，也是TLR7/8的典型配
体。自2005年以来，许多学者发现外源性的siRNA
转染到细胞后，激活TLR7/8为代表的天然免疫反
应，分泌炎症因子，产生毒副作用。Hornung等[21]
就是其中之一，他们设计了以TLR9为靶基因的4条
siRNA，分别刺激体外培养的人源pDC，均能分泌
大量的IFN-α。进一步发现4条siRNA的免疫刺激强
度不同，同一条siRNA的正义链的刺激强度比反义
链高。将免疫刺激效果最好的siRNA导入到小鼠骨
髓，发现除了IFN-α的表达增加外，还可激活CD4+/
CD8+T细胞和pDC，当该siRNA导入TLR7-/-小鼠骨
髓，并未检测到IFN-α的表达，脾细胞中也无活化
迹象。由此可见，机体通过TLR7信号途径导致了
外源siRNA的非特异性毒副作用。
TLR7/8介导 ssRNA引起的免疫反应，主要是
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ssRNA通过结合膜上的 TLR7/8激活了胞质内的髓
样分化因子 (myeloid differentiation factor 88, MyD88)。
MyD88具有三个结构域，N端的死亡区 (death domain,
DD)、中间区和 C端的 Toll区 (TLR7结合区 )。活
化的MyD88通过募集白介素 -1受体相关激酶 4(IL-
1R-associated kinase-4, IRAK-4)，使 IRAK-1和 IRAK-2
磷酸化，二者进一步活化 TRAF6，激活 IRF5、
IRF7 和 NF-κB等转录因子，促进 IFNα和炎症因
子的分泌，介导天然免疫 [17,22]。
2.2.2　RLR与dsRNA
RLR是一类新发现的能识别 dsRNA的受体，
在细胞质中介导抗 RNA 病毒的免疫反应，主要
包括三个成员，即视黄酸诱导基因 I (retinoic acid
inducible gene-I, RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因 5
(melanoma differentiation associated gene 5, MDA5)
以及 LGP2(laboratory of genetics and physiology 2)。
RIG-I和MDA5的 N端含有两个 CARD(caspase rec-
ruitment domains)，中段是一个 DExD/H解旋酶结
构域 (DExD/H box helicase domain)，C端是 CTD (C-
terminal regulatory domain)，CTD能识别 RNA。当
dsRNA与 RIG-I或者 MDA5的 C端 CTD结合时，
N端的 CARD引起线粒体膜上的 IPS-1 (IFN-β pro-
moter stimulator 1)活化，进而激活转录因子 IRF3、
IRF5、IRF7和 NF-κB，上调 IFN和促炎症因子的
表达。在识别 dsRNA的选择上，RIG-I一般识别稍
短的、5端含有 3个磷酸基团的平端 dsRNA，而
MDA5识别稍长的、5端无 3个磷酸基团的平端
dsRNA。LGP2的结构无CARD，因此它无信号功能，
但它能增强MDA5的免疫反应，负性调节 RIG-I的
作用 [23-24]。
2.2.3　PKR与dsRNA
PKR又称DAI或 p68，是经典 IFN的诱导产物，
参与 IFN的抗病毒机制，结构分为 N端 dsRNA结
合区 (dsRNA binding motifs, dsRBMs)和 C端激酶
结构域 (C-terminal kinase domain, KD)催化区。dsRNA
结合区由 70个左右的氨基酸残基组成，主要识别
具有黏性末端的 dsRNA，无序列特异性，但与病毒
RNA或者 siRNA的长度及 3端的 tt突出序列关系
紧密 [25]。Puthenveetil等 [26]证实，3端存在修饰的
siRNA比无修饰的 siRNA更易活化 PKR。Boo和
Yang[27]认为，PKR在识别 dsRNA后，促使真核起
始因子 2(eukaryotic initiation factor 2α, eIFα)磷酸化，
进入细胞核抑制病毒基因转录，PKR也可通过 P38、
MAP/INK和 STAT1通路导致 IFN的表达，或者通
过激活转录因子 ATF2和 c-Jun诱导炎症因子的表
达，介导免疫反应的发生 [28]。
总之，采用 RNAi进行基础和临床治疗时，除
了脱靶效应的副作用之外，主要是通过感应元件介
导的免疫反应。当外源性 RNA 与 TLR3、TLR7/8、
RIG-I、MDA5、PKR等感应元件结合之后，通过
下游的信号分子 TRIF、MyD88和 IPS-1，激活转录
因子 IRF3/5/7、ATF2和 NF-κB，引起细胞因子和
促炎症因子的表达，产生相应的副作用。感应元件
介导的免疫反应可分为四条途径：(1)较长的外源
黏端 dsRNA(通常大于 21 nt)能结合细胞膜或者
内含体膜上的 TLR3，通过 TRIF活化转录因子 IRF3、
ATF2和 NF-κB，上调 IFNβ、IL-6、TNFα的表达；
(2)外源 ssRNA和较短的黏端 dsRNA可以结合内含
体膜上的 TLR7/8，通过 MyD88 活化转录因子
IRF5/7和 NF-κB，上调 IFNα和促炎症因子的表达；
(3)当 RIG-I识别稍短的、5端含有 3个磷酸基团的
平端 dsRNA，MDA5识别稍长的、5端无 3个磷酸
基团的平端 dsRNA之后，二者均通过线粒体膜上
的 IPS-1激活转录因子 IRF3/5/7和 NF-κB，进而上
调 IFN和促炎症因子的表达；(4)当黏性末端的
dsRNA与 PKR结合后，通过激活转录因子 ATF2
诱导炎症因子的表达。
3　免疫副反应的控制
RNAi技术存在很多优点，虽仍面临脱靶和免
疫反应等方面的挑战，但这些不足也在逐渐得以克
服。Castanotto等 [29] 认为，经化学修饰后的 siRNA
稳定性增强，抑制效率增加，脱靶和免疫刺激等非
特异性现象降低。因为 siRNA的反义链主要参与
RISC的结合，实现靶基因的特异性沉默，所以，
对 siRNA的正义链进行修饰可能在不影响沉默靶基
因的前提下起到更好的效果。实践证明，若将
siRNA正义链上的部分核糖核酸的 2-OH甲基化或
者加上荧光标志，可以降低 siRNA通过激活 TLR
引起的免疫反应 [30]。在 siRNA运载工具的选择上，
阳离子脂质体包裹的 siRNA复合物比裸 siRNA更
易刺激细胞的免疫反应，采用电穿孔法将外源
siRNA导入细胞，免疫反应会受到抑制 [29,31]。
4　结论
RNAi技术引起细胞的免疫应答及细胞毒性严
重影响该技术在临床上的应用。因此，深入了解
RNAi技术在应用中引起免疫副反应的分子机制，
吴江锋，等：RNA干扰引起的非特异性免疫反应及其机制研究探讨第3期 227
掌握 TLR及 RNA感知元件识别特定 siRNA的结构
特点，对 siRNA进行适当的化学修饰或者序列设
计 [30]，针对不同的靶细胞采用恰当的运输方式，将
从根本上减少副作用，使 RNAi技术更好的应用于
临床靶向治疗。
[参　考　文　献]
[1] 鞠吉雨, 李在连. RNA干扰与肿瘤基因治疗. 食品与药
品, 2009, 11(1): 54-7
[2] 韩继波, 陈晨, 陈始明, 等. RNA干扰非特异性研究进
展.生物技术通报, 2009, (7): 27-30
[3] Carthew RW, Sontheimer EJ. Origins and mechanisms of
miRNAs and siRNAs. Cell, 2009, 136(4): 642-55
[4] Manjunath N, Dykxhoorn DM. Advances in synthetic
siRNA delivery. Discov Med, 2010, 9(48): 418-30
[5] Lambeth LS, Van Hateren NJ, Wilson SA, et al. A direct
comparison of strategies for combinatorial RNA
interference. BMC Mol Biol, 2010, 11(77):1-15
[6] Tschuch C, Schulz A, Pscherer A. Off-target effects of
siRNA specific for GFP. BMC Mol Biol, 2008, 9(60):1-14
[7] Martínez de Alba AE, Jauvion V, Mallory AC, et al. The
miRNA pathway limits AGO1 availability during siRNA-
mediated PTGS defense against exogenous RNA. Nucleic
Acids Res, 2011, 39(21): 9339-44
[8] Olejniczak M, Galka P, Krzyzosiak WJ. Sequence-non-
specific effects of RNA interference triggers and microR-
NA regulators. Nucleic Acids Res, 2010, 38(1): 1-16
[9] Robbins M, Judge A, Ambegia E. et al. Misinterpreting the
therapeutic effects of small interfering RNA caused by
immune stimulation. Hum Gene Ther, 2008, 19(10): 991-9
[10] Jin B, Sun T, Yu XH, et al. Immunomodulatory effects of
dsRNA and its potential as vaccine adjuvant. J Biomed
Biotechnol, 2010, 2010: 1-17
[11] Judge AD, Sood V, Shaw JR, et al. Sequence-dependent
stimulation of the mammalian innate immune response by
synthetic siRNA. Nat Biotechnol, 2005, 23(4): 457-62
[12] Blasius AL, Beutler B. Intracellular toll-like receptors.
Immunity, 2010, 32(3): 305-15
[13] 金丹, 吕凤林. TLR3免疫识别dsRNA病毒的分子机制.
病毒学报, 2005, 21(2): 155-9
[14] Karikó K, Bhuyan P, Capodici J, et al. Small interfering
RNAs mediate sequence-independent gene suppression
and induce immune activation by signaling through toll-
like receptor 3. J Immunol, 2004, 172(11): 6545-9
[15] Cho WG, Albuquerque RJ, Kleinman ME, et al. Small
interfering RNA-induced TLR3 activation inhibits blood
and lymphatic vessel growth. Proc Natl Acad Sci USA,
2009, 106(17): 7137-42
[16] Robbins M, Judge A, MacLachlan I. siRNA and innate
immunity. Oligonucleotides, 2009, 19(2): 89-102
[17] Farina G, York M, Collins C, et al. dsRNA activation of
endothelin-1 and markers of vascular activation in
endothelial cells and fibroblasts. Ann Rheum Dis, 2011,
70(3): 544-50
[18] Lai Y, Yi G, Chen A, et al. Viral double-strand RNA-
binding proteins can enhance innate immune signaling by
toll-like receptor 3. PLoS One, 2011, 6(10): e25837
[19] Lund JM, Alexopoulou L, Sato A, et al. Recognition of
single-stranded RNA viruses by Toll-like receptor 7. Proc
Natl Acad Sci USA, 2004, 101(15): 5598-603
[20] Welte T, Reagan K, Fang H, et al. Toll-like receptor
7-induced immune response to cutaneous West Nile virus
infection. J Gen Virol, 2009, 90(Pt11): 2660-8
[21] Hornung V, Guenthner-Biller M, Bourquin C, et al.
Sequence-specific potent induction of IFN-α by short
interfering RNA in plasmacytoid dendritic cells through
TLR7. Nat Med, 2005, 11(3): 263-70
[22] Yu H, Wang ZL, Sun G, et al. Recognition of nucleic acid
ligands by toll-like receptors 7/8: importance of chemical
modification. Curr Med Chem, 2012, 19(9): 1365-77
[23] Allam R, Lichtnekert J, Moll AG, et al. Viral RNA and
DNA trigger common antiviral responses in mesangial
cells. J Am Soc Nephrol, 2009, 20(9): 1986-96
[24] Bruns AM, Horvath CM. Activation of RIG-I-like receptor
signal transduction. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2012,
47(2): 194-206
[25] Marques JT, Devosse T, Wang D, et al. A structural basis
for discriminating between self and nonself double-
stranded RNAs in mammalian cells. Nat Biotechnol, 2006,
24(5): 559-65
[26] Puthenveetil S, Whitby L, Ren J, et al. Controlling
activation of the RNA-dependent protein kinase by
siRNAs using site-specific chemical modification. Nucleic
Acids Res, 2006, 34(17): 4900-11
[27] Boo KH, Yang JS. Intrinsic cellular defenses against virus
infection by antiviral type I interferon. Yonsei Med J,
2010, 51(1): 9-17
[28] Han Q, Zhang C, Zhang J, et al. Involvement of activation
of PKR in HBx-siRNA-mediated innate immune effects
on HBV inhibition. PLoS One, 2011, 6(12): e27931
[29] Castanotto D, Rossi JJ. The promises and pitfalls of RNA-
interference-based therapeutics. Nature, 2009, 457(7228):
426-33
[30] Samuel-Abraham S, Leonard JN. Staying on message:
design principles for controlling nonspecific responses to
siRNA. FEBS J, 2010, 277(23): 4828-36
[31] Zhang XD. An effective method for controlling false
discovery and false nondiscovery rates in genome-scale
RNAi screens. J Biomol Screen, 2010, 15(9): 1116-22