全 文 ：第 １４卷第 １期
２０１６年 １月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 １
Ｊａｎ􀆰 ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０１􀆰 ００１
收稿日期：２０１５－０９－０２
基金项目：江苏省青年基金（ＢＫ２０１５０１３０）；中央高校基本科研业务费专项资金（ＪＵＳＲＰ１１５Ａ１７）
作者简介：方　 浩（１９８５—），男，江苏江阴人，博士，讲师，研究方向：生物化学工程与生物能源，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｆａｎｇｈａｏ＠ ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ
高效转化法定向进化里氏木霉的纤维素酶
方　 浩１，２，３，邓　 禹１，２，毛　 银１，夏黎明３
（１􀆰 江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 ２１４１２２； ２􀆰 江南大学 生物工程学院，
江苏 无锡 ２１４１２２； ３􀆰 浙江大学 化学工程与生物工程学院，浙江 杭州 ３１００２７）
摘　 要：优化了根癌农杆菌介导的里氏木霉的转化方法，得出转化的最适条件：共培养 ｐＨ ５􀆰 ３、共培养温度２４ ℃、
乙酰丁香酮浓度 ２００ μｍｏｌ ／ Ｌ、根癌农杆菌 ＯＤ６６０值 ０􀆰 ８、里氏木霉孢子预萌发时间 ３ ｈ。 此时转化率为１３ ０００个转化
子（以 １０７个里氏木霉孢子计），是未优化条件下的 ２７倍以上。 利用此高效转化法，结合强化纤维二糖水解酶基因
ＩＩ表达的操作，从 ３２４个转化子中筛选到了 １株优良的里氏木霉转化子 Ｃ１０，发酵 ５ ｄ 后，纤维二糖水解酶活力达
（１２２􀆰 ４４±５􀆰 ９１） Ｕ ／ ｍＬ，是初始菌株的 ５􀆰 ４倍；滤纸酶活力达（２８􀆰 ９２±２􀆰 ４５） ＩＵ ／ ｍＬ，是初始菌株的 ４􀆰 ３ 倍。 与初始
菌株所产纤维素酶相比，转化子 Ｃ１０所产纤维素酶降解玉米秸秆和稻草的能力有明显的提高。 本研究为里氏木霉
的基因工程改造及其纤维素酶的定向进化提供了有价值的实验数据。
关键词：根癌农杆菌；转化；里氏木霉；优化；纤维二糖水解酶；纤维素酶
中图分类号：Ｑ８１２　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０１－０００１－０７
Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｂｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ＦＡＮＧ Ｈａｏ１，２，３，ＤＥＮＧ Ｙｕ１，２，ＭＡＯ Ｙｉｎ１，ＸＩＡ Ｌｉｍｉｎｇ３
（１􀆰 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃｅｒｅａｌ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；
３􀆰 Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００２７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ
ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ ｃｏ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ ａｔ ｐＨ ５􀆰 ３，２４ ℃，
ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ２００ μｍｏｌ ／ Ｌ，Ａ􀆰 ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ＯＤ６６０ ｖａｌｕｅ ０􀆰 ８，ａｎｄ ｐｒｅ⁃ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ ｏｆ Ｔ􀆰 ｒｅｅｓｅｉ ｓｐｏｒｅｓ ｆｏｒ ３ ｈ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ １３ ０００ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｐｅｒ １０７
ｓｐｏｒｅｓ，２７ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｂｅｆｏｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ． Ａ ｗｅｌｌ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ Ｔ􀆰 ｒｅｅｓｅｉ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ Ｃ１０ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ
ａｍｏｎｇ ３２４ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ
ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ ＩＩ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｗｉｔｈ （ １２２􀆰 ４４ ± ５􀆰 ９１） Ｕ／ ｍＬ
ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ （２８􀆰 ９２±２􀆰 ４５） ＩＵ ／ ｍＬ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ，５􀆰 ４ ａｎｄ ４􀆰 ３ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ
ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｔｒａｉｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｔｒａｉｎ，ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ
Ｃ１０ ｈａｄ ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｒｎ ｓｔｏｖｅｒ ａｎｄ ｒｉｃｅ ｓｔｒａｗ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｈａｓ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｔｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｔ􀆰 ｒｅｅｓｅｉ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ􀆰 ｒｅｅｓｅｉ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ； ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ； Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ； ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌ⁃
ａｓｅ； ｃｅｌｌｕｌａｓｅ
　 　 里氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）作为最重要的纤
维素酶生产菌株之一，能够分泌使纤维素原料完全
降解成单糖的纤维素酶体系，包括：纤维二糖水解
酶（ＣＢＨ，ＥＣ ３􀆰 ２􀆰 １􀆰 ９１）、内切 β 葡聚糖酶（ＥＧ，
ＥＣ ３􀆰 ２􀆰 １􀆰 ４）和 β 葡萄糖苷酶（ＥＣ ３􀆰 ２􀆰 １􀆰 ２１） ［１－３］。
由于里氏木霉的纤维素酶体系中 β 葡聚糖酶的活
力较低，已通过基因工程技术或者发酵工程技术获
得了不同程度的解决［４ ６］，但是另一个组分纤维二
糖水解酶 ＩＩ被忽视了，该组分仅占纤维素酶总蛋白
的 １０％～１５％［７］，这对于有效发挥纤维二糖水解酶 Ｉ
和纤维二糖水解酶 ＩＩ之间的协同作用来说［８］，产量
明显不足。 因此，利用基因工程技术提高里氏木霉
产纤维二糖水解酶 ＩＩ的能力，对于提高纤维二糖水
解酶的活力以及纤维素酶的协同降解效率具有重
要意义。
里氏木霉基因工程中的关键步骤之一是对里
氏木霉的转化。 目前常用的转化方法有 ４ 种：１）原
生质体介导的转化；２） 根癌农杆菌介导的转化；３）
电穿孔转化；４）基因枪转化［９］。 其中根癌农杆菌介
导的转化适用于里氏木霉基因工程［１０］，因为其转化
成功率高，并且不需要借助特殊设备。 根癌农杆菌
介导的转化受很多因素影响，转化周期较长，从而
有较高的杂菌感染风险，使得转化率较低。
为了提高转化效率和里氏木霉产纤维素酶的
能力，本研究首先优化了影响根癌农杆菌介导的转
化过程的主要因素，并以优化后的转化方法，通过
高通量筛选，获得纤维二糖水解酶高产菌株，同时
对经过基因工程改造后所得的里氏木霉纤维素酶
的降解木质纤维素酶的能力也进行了测定。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌株与质粒
１􀆰 １􀆰 １　 菌株
里氏木霉 Ｔ􀆰 ｒｅｅｓｅｉ ＺＵ ０２、 根 癌 农 杆 菌
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＧＬ １均为笔者所在实
验室保存菌株。
１􀆰 １􀆰 ２　 质粒
重组质粒 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ ｈｐｈ ＰｓＣＴ 构建自
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００，详见图 １，用于本研究的里氏木霉
转化。
１􀆰 ２　 培养基
１）ＬＢ培养基（ｇ ／ Ｌ）　 胰蛋白胨 １０，酵母提取物
５，ＮａＣｌ １０； ｐＨ ７􀆰 ４。 固体 ＬＢ 培养基，加 ２０ ｇ ／ Ｌ
琼脂。
２）ＩＭ 培养基 　 ８０ μＬ、ｐＨ ４􀆰 ８ 柠檬酸缓冲液
（１􀆰 ２５ ｍｏｌ ／ Ｌ），２ ｍＬ 镁钠元素溶液，１０ ｇ ／ Ｌ ＣａＣｌ２·
２Ｈ２Ｏ溶液 １００ μＬ，１ ｇ ／ Ｌ ＦｅＳＯ４溶液 １００ μＬ，１００ μＬ
微量元素溶液，２００ ｇ ／ Ｌ ＮＨ４ＮＯ３溶液 ２５０ μＬ，５００
ｇ ／ Ｌ甘油 １ ｍＬ，１ ｍｏｌ ／ Ｌ ２ （ Ｎ 吗啡啉）乙磺酸
（ＭＥＳ）４ ｍＬ（ｐＨ ５􀆰 ３），２００ μｍｏｌ ／ Ｌ乙酰丁香酮 ２００
μＬ，混合后终 ｐＨ ５􀆰 ３。 固体 ＩＭ 培养基，加 ２０ ｇ ／ Ｌ
琼脂［１１］。
镁钠元素溶液：３０ ｇ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ 与 １５ ｇ ＮａＣｌ
溶于蒸馏水中，定容至 １ Ｌ，灭菌后 ４ ℃储存，备用。
微量元素溶液：１００ ｍｇ ＺｎＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ，１００ ｍｇ
ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ，１００ ｍｇ Ｈ３ＢＯ３，１００ ｍｇ ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ，
１００ ｍｇ Ｎａ２ＭｏＯ４·２Ｈ２Ｏ，溶于蒸馏水中，定容至 １ Ｌ，
灭菌，４ ℃储存，备用。
其他溶液配制后灭菌，４ ℃储存，备用。 对于热
不稳定溶液，采用 ０􀆰 ２２ μｍ 薄膜滤菌器过滤除菌，
４ ℃储存，备用。
３）ＰＤＡ培养基（ｇ ／ Ｌ） 　 马铃薯 ２００，葡萄糖 ２０，
琼脂 ２０，ｐＨ 自然；固体 ＰＤＡ培养基，加 ２０ ｇ ／ Ｌ琼脂。
４）初筛培养基　 固体 ＰＤＡ培养基，另加潮霉素
Ｂ １００ μｇ ／ ｍＬ，头孢霉素 ２００ μｇ ／ ｍＬ，ｐＨ自然。
５） 复筛培养基 （ ｇ ／ Ｌ ） 　 微晶纤维素 ２０、
（ＮＨ４） ２ＳＯ４ ５、ＫＨ２ ＰＯ４ １５、ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ８、ＣａＣ１２ ０􀆰 ６、
ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ００５、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０􀆰 ００１ ６、ＺｎＳＯ４·
７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ００１ ４、ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ ０􀆰 ００３ ７、潮霉素 Ｂ ０􀆰 １、
琼脂粉 ２０；ｐＨ ４􀆰 ８。
６）种子培养基（ ｇ ／ Ｌ） 　 葡萄糖 １５、酵母浸膏
２０、（ＮＨ４ ） ２ ＳＯ４ ２􀆰 ５、ＫＨ２ＰＯ４ ６、ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ８、ＣａＣ１２
１􀆰 ０；ｐＨ ４􀆰 ８。
７）产酶培养基（ ｇ ／ Ｌ） 　 乳糖 １８、微晶纤维素
１０、玉米浆粉 １２、（ＮＨ４） ２ＳＯ４ ０􀆰 ５、ＭｇＳＯ４ １、ＣａＣ１２
０􀆰 ５、ＫＨ２ ＰＯ４ ６、 ＦｅＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ ０􀆰 ００５、ＭｎＳＯ４·Ｈ２ Ｏ
０􀆰 ００１ ６、ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ００１ ４、ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ ０􀆰 ００３ ７、
麸皮（粉碎）２；ｐＨ ４􀆰 ８。
１􀆰 ３　 根癌农杆菌感受态细胞的制备及转化［１２］
挑单菌接种于 ５ ｍＬ ＬＢ培养基（利福霉素 ５～１０
μＬ），于 ２８ ℃、２２０ ｒ ／ ｍｉｎ 预培养过夜。 转接至 ２５
ｍＬ ＬＢ中，以体积分数 ３％ ～５％为接种量，相同条件
培养至 ＯＤ６００达到 ０􀆰 ６（４ ～ ６ ｈ）。 分装，１􀆰 ２ ｍＬ ／管，
冰浴 ３０ ｍｉｎ。 ８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ２ ｍｉｎ，弃上清。 加
５００ μＬ ／管冰上预冷的 ＭｇＣｌ２（１００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ），重悬，
冰上放置 １０～２０ ｍｉｎ。 ８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ２ ｍｉｎ，弃上
２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
清。 重悬于冰上预冷的 １００ μＬ 的 ２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＣａＣｌ２，冰上放置 ２０ ｍｉｎ。 加入 １００ ～ ５００ ｎｇ 的重组
质粒 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ ｈｐｈ ＰｓＣＴ，冰浴 ３０ ｍｉｎ，液氮
速冻 １ ｍｉｎ，３７ ℃温育 ３ ｍｉｎ，冰浴 ２ ｍｉｎ。 加入 ６００
μＬ的 ＬＢ 培养基，混合均匀。 在 ２８ ℃、８０ ～ １００
ｒ ／ ｍｉｎ条件下培养 ３ ｈ。 ３ ０００ ～ ４ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３
ｍｉｎ，吸去部分上清液，余下 ２００ μＬ与沉淀物混合均
匀，涂布至含 ２５ μｇ ／ ｍＬ利福霉素和 ５０ μｇ ／ ｍＬ卡那
霉素的抗性平板。 ２８ ℃ 培养 ２ ～ ３ ｄ 后，含有重组
质粒的转化子长出。
１􀆰 ４　 根癌农杆菌介导的里氏木霉转化
将根癌农杆菌转化子接种到含 ２５ μｇ ／ ｍＬ 利福
霉素和 ５０ μｇ ／ ｍＬ卡那霉素的 ＬＢ 培养基上划线，挑
取单克隆进行液体培养（ＬＢ 培养基，卡那霉素 ５０
μｇ ／ ｍＬ，利福霉素 ２５ μｇ ／ ｍＬ），２８ ℃，２０～２４ ｈ；收集
菌体，用 ＩＭ培养基稀释至 ＯＤ６６０ ＝ ０􀆰 １５～０􀆰 ２０，添加
乙酰丁香酮 ２００ μｍｏｌ ／ Ｌ，２８ ℃、２２０～２５０ ｒ ／ ｍｉｎ暗处
培养约 ６～１０ ｈ至 ＯＤ６６０ ＝ ０􀆰 ６～０􀆰 ８［１１］。
用 ５～８ ｍＬ 无菌水从培养 ４ ～ ７ ｄ 的 ＰＤＡ 斜面
上洗下里氏木霉的孢子，棉花过滤得到孢子悬液，
血球计数板计数，然后用无菌水调节孢子密度至
１０７ ～１０８个 ／ ｍＬ。 取 １５０ μＬ 活化的农杆菌菌液和
１５０ μＬ稀释的孢子悬液混合，涂布在 ＩＭ 培养基平
板的硝酸纤维素膜上，２４～２５ ℃暗处培养 ４８～７２ ｈ。
将滤纸揭下，反铺到含 ５０ μｇ ／ ｍＬ 潮霉素 Ｂ 和 ２００
μｇ ／ ｍＬ头孢霉素的初筛培养基平板上，２８ ℃培养至
转化子长出。
１􀆰 ５　 里氏木霉转化子的复筛
用切割器将选择性初筛培养基平板上的里氏
木霉转化子菌落切成直径约为 ０􀆰 ３ ｃｍ的菌块，每个
转化子取 ３块后转移到筛选平板上，３０ ℃培养 ２～３
ｄ。 定时观察、记录生长情况和菌落直径。 从中选
出生长速率快、菌落直径大的转化子。
１􀆰 ６　 产酶试验
将筛选得到的里氏木霉转化子 Ｃ１０和初始菌株
分别划线于 ＰＤＡ试管斜面，３０ ℃培养 ５～７ ｄ，挑取分
生孢子接种于种子培养基，３０～３２ ℃、１７０ ｒ ／ ｍｉｎ培养
４８ ｈ后转接至产酶培养基。 每个菌株做 ３个平行摇
瓶产酶实验。 产酶条件：２５０ ｍＬ 摇瓶装液量 ５０ ｍＬ，
接种量 １０％，２８～３０ ℃、１７０ ｒ ／ ｍｉｎ振荡培养。 定期取
样，检测发酵液的纤维二糖水解酶活力。
１􀆰 ７　 酶活力测定
纤维二糖水解酶活力测定方法如下：每支试管
加入 ０􀆰 ０２ ｇ微晶纤维素和 １􀆰 ０ ｍＬ、０􀆰 ０５ ｍｏｌ ／ Ｌ柠檬
酸缓冲液，将 ０􀆰 ５ ｍＬ 适当稀释的酶液加入试管中，
混匀后于 ５０ ℃水浴中反应 ３０ ｍｉｎ 后，终止反应，离
心，３，５ 二硝基水杨酸法（ＤＮＳ 法） ［１３］测定上清液
中的还原糖量。 一个酶活力单位定义为在标准反
应条件下，１ ｈ 内生成 １ ｍｇ 还原糖所需的酶量，以
Ｕ ／ ｍＬ表示。
滤纸酶活力按照国际理论与应用化学协会
（ＩＵＰＡＣ）推荐的标准方法［１４］测定。
１􀆰 ８　 酶解实验
稻草和玉米秸秆粉碎至颗粒小于 ２ ｍｍ，用碱法
预处理，称取 ２０ ｇ（干质量）稻草或玉米秸秆浸泡于
１６０ ｍＬ ２０ ｇ ／ Ｌ ＮａＯＨ 水溶液中，于 １２０ ℃处理 ３０
ｍｉｎ。 用自然水洗涤预处理后的物料至中性，用纱布
拧干后保存于 ４ ℃冰箱中，平衡水分并用于成分测
定和后续酶解实验。 碱处理玉米秸秆的组成（质量
分数）：纤维素 ６３􀆰 ６％，半纤维素 ２４􀆰 ３％；碱处理稻
草的组成 （质量分数）：纤维素 ５９􀆰 ７％，半纤维
素 ２１􀆰 １％。
称取相当于 ４０ ｇ ／ Ｌ 纤维素的碱处理玉米秸秆
或稻草于 ２５０ ｍＬ锥形瓶中，加入 ２􀆰 ５ ｍＬ １ ｍｏｌ ／ Ｌ柠
檬酸缓冲液和一定量的蒸馏水后搅拌，加入 ２０ ＩＵ ／ ｇ
底物（干质量）的粗制纤维素酶（里氏木霉的发酵
液），加入蒸馏水补足 ５０ ｍＬ，充分搅拌后于 ５０ ℃、
１４０ ｒ ／ ｍｉｎ条件下反应 ４８ ｈ。 定时取样测定还原糖
含量，实验采用 ３个平行样，取平均值。
１􀆰 ９　 还原糖测定与酶解得率计算
高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）测定酶解反应产生的
还原糖，色谱仪为 Ｓｙｌｔｅｃｈ Ｍｏｄｅｌ ５００，色谱柱为
Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ ＩＣ Ｓｅｐ ＩＣＥ Ｃｏｒｅｇｅｌ ８７Ｈ３ 型有机酸
柱，柱温 ６０ ℃，检测器为 Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｍｏｄｅｌ
６０４０ ＸＲ 型折光率检测器。 测定中取 ３ 个平行样，
取平均值。 酶解得率计算见式（１）。
酶解得率＝ｍ（还原糖） ×０􀆰 ９×１００％ ／ ｍ（底物中
（纤维素和半纤维素）） （１）
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 里氏木霉转化的重组质粒
本研究使用的重组质粒 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ ｈｐｈ
ＰｓＣＴ构建自 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００，如图 １ 所示，其详细构
建过程可参见文献［１５］。 ｈｐｈ 是潮霉素抗性标记，
ＰｓＣＴ是纤维二糖水解酶ＩＩ强表达盒，其中 Ｐ 是纤维
二糖水解酶 Ｉ强启动子，ｓ是产物分泌到胞外所需的
３　 第 １期 方　 浩等：高效转化法定向进化里氏木霉的纤维素酶
信号肽，Ｃ是纤维二糖水解酶 ＩＩ基因，Ｔ是纤维二糖
水解酶 Ｉ终止子。 该载体将使得里氏木霉转化子获
得高表达纤维二糖水解酶 ＩＩ 的能力，使得里氏木霉
纤维素酶中纤维二糖水解酶活力明显提高［１６］。 重
组质粒 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ ｈｐｈ ＰｓＣＴ在大肠杆菌中扩
增，载体制备后转入根癌农杆菌中，用于后续里氏
木霉的转化。
图 １　 重组质粒 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ ｈｐｈ ＰｓＣＴ
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＣＡＭＢＩＡ１３００⁃ｈｐｈ⁃ＰｓＣＴ
图 ２　 共培养 ｐＨ对转化率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ ｐＨ ｏｎ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ
２􀆰 ２　 共培养 ｐＨ 对根癌农杆菌介导的里氏木霉转
化的影响
　 　 利用柠檬酸缓冲液（终浓度 ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ）调节 ＩＭ
培养基的 ｐＨ，考察 ｐＨ对根癌农杆菌介导的里氏木
霉转化的影响，结果如图 ２ 所示。 图 ２ 中的纵坐标
ＴＲ，即转化率（ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ），以每 １０７个里氏
木霉孢子所出现的转化子数计算。 由图 ２ 可知，ｐＨ
５􀆰 ３为最适 ｐＨ，此时每 １０７个里氏木霉孢子出现 ３７０
个转化子，ｐＨ低于或者高于该数值，都会导致转化
率下降。 其他宿主的根癌农杆菌介导转化的结果
显示，最适 ｐＨ介于 ５􀆰 ０ ～ ５􀆰 ３ 之间［１７－１８］。 本研究结
果与文献报道一致，尽管根癌农杆菌介导转化的宿
主不同。 这说明共培养 ｐＨ 主要是对根癌农杆菌的
生长或转化进程有影响。 因此，将 ｐＨ ５􀆰 ３作为最适
ｐＨ用于后续转化。
２􀆰 ３　 共培养温度对根癌农杆菌介导的里氏木霉转
化的影响
　 　 共培养温度是指里氏木霉孢子与含有重组表
达质粒的根癌农杆菌转化子在硝酸纤维素薄膜上
共培养所需的温度，考察不同共培养温度对里氏木
霉转化率的影响，ｐＨ 为 ５􀆰 ３，其他条件同 １􀆰 ４ 节，结
果见图 ３。 由图 ３可知：２４ ℃是根癌农杆菌介导的
里氏木霉转化的最适共培养温度，此时每 １０７个里
氏木霉孢子出现 ４３０ 个转化子。 当温度下降时，转
化率较缓慢地下降；当温度上升时，转化率迅速下
降，说明高温对转化率有更不利的影响。 有文献报
道的最适温度在 ２２ ～ ２５ ℃之间［１９］，本结果与文献
报道一致。 因此将 ２４ ℃作为最适共培养温度用于
后续转化。
图 ３　 共培养温度对转化率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ
２􀆰 ４　 乙酰丁香酮对根癌农杆菌介导的里氏木霉转
化的影响
　 　 不管是预培养还是共培养，添加乙酰丁香酮都
是必须的，因为乙酰丁香酮能够诱导根癌农杆菌中
的 ｖｉｒ 基因，使得重组 ＤＮＡ 能够转移到宿主细胞
中［１１，１９］。 考察乙酰丁香酮浓度对里氏木霉转化率
的影响，ｐＨ为 ５􀆰 ３，共培养温度为 ２４ ℃，结果见图
４。 由图 ４可知，乙酰丁香酮浓度越大，转化率越高。
当浓度超过 ２００ μｍｏｌ ／ Ｌ 后，转化率几乎不再增加，
因此 ２００ μｍｏｌ ／ Ｌ为乙酰丁香酮最适添加量，用于后
续实验。
２􀆰 ５　 根癌农杆菌浓度对根癌农杆菌介导的里氏木
霉转化的影响
　 　 本研究中改变根癌农杆菌浓度就意味着改变
根癌农杆菌与里氏木霉的比例，这对转化率和后续
４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
图 ４　 乙酰丁香酮浓度对转化率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ （ＴＲ）
筛选实验都有影响，因为合适的比例不仅可以提高
转化率，还避免了某一菌种的高背景生长，这不利
于转化子筛选［１１］。 ｐＨ为 ５􀆰 ３，共培养温度为 ２４ ℃，
乙酰丁香酮浓度 ２００ μｍｏｌ ／ Ｌ，考察根癌农杆菌浓度
对里氏木霉转化的影响，结果见图 ５。 由图 ５ 可知，
ＯＤ６６０值为 ０􀆰 ８时有最高的转化率，因此将该浓度用
于后续转化实验。
图 ５　 根癌农杆菌浓度对转化率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ａ􀆰 ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （ＯＤ）
ｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ （ＴＲ）
２􀆰 ６　 孢子预萌发时间对根癌农杆菌介导的里氏木
霉转化的影响
　 　 预萌发是指孢子在 ＩＭ 培养基中 ２４ ℃培养一
段时间，然后开始共培养，考察里氏木霉孢子的预
萌发对转化率的影响，ｐＨ 为 ５􀆰 ３，共培养温度为 ２４
℃，乙酰丁香酮浓度 ２００ μｍｏｌ ／ Ｌ，ＯＤ６６０值 ０􀆰 ８，结果
见图 ６。 由图 ６可知：即便是 １ ｈ的预萌发都可以显
著提高转化率。 当预萌发 ３ ｈ 时，得到最高的转化
率，每 １０７里氏木霉孢子出现 １３ ０００个转化子，是未
预萌发的 ２７倍。 当预萌发时间超过 ３ ｈ 后，转化率
会略有所下降，可能是因孢子的老化所导致的。 此
结果也说明了里氏木霉的萌发孢子（ｇｅｒｍｌｉｎｇｓ）比孢
子更适合于瘤农杆菌介导的转化。
图 ６　 孢子预萌发时间对转化率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｐｏｒｅ ｐｒｅ⁃ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ
ｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ （ＴＲ）
在上述 ５ 个影响因素优化后，根癌农杆菌介导
的里氏木霉转化方法有了很高的转化率，使其成为
里氏木霉基因工程的有效工具，可以产生大量的转
化子，为筛选里氏木霉优良工程菌株提供了便利。
本研究采用优化后的转化方法，通过两步高效筛
选，在 ３２４ 个里氏木霉转化子中筛选到了 １ 株里氏
木霉优良工程菌 Ｃ１０，能够高产纤维二糖水解酶。
２􀆰 ７　 产酶实验结果
表 １对比了里氏木霉初转化子 Ｃ１０与初始菌株
的纤维二糖水解酶活力，前者发酵至 １２０ ｈ 时纤维
二糖水解酶活力为（１２２􀆰 ４４±５􀆰 ９１） Ｕ ／ ｍＬ，是初始菌
株（２２􀆰 ４９±２􀆰 ２７） Ｕ ／ ｍＬ 的 ５􀆰 ４ 倍。 里氏木霉纤维
素酶中纤维二糖水解酶活力通过基因工程技术得
到显著提高，原因是通过 ｃｂｈ１强启动子高表达 ｃｂｈ２
基因，并且纤维二糖水解酶 ＩＩ 的比活力高于纤维二
糖水解酶 Ｉ，使得纤维二糖水解酶 ＩＩ 高表达，从而使
整个纤维二糖水解酶活力明显提高。
表 ２对比了里氏木霉初转化子 Ｃ１０与初始菌株
的滤纸酶活力（即总酶活），前者发酵至 １２０ ｈ时滤纸
酶活力为（２８􀆰 ９２±２􀆰 ４５） ＩＵ ／ ｍＬ，是初始菌株（６􀆰 ７１±
０􀆰 ７９） ＩＵ ／ ｍＬ的 ４􀆰 ３倍。 滤纸酶活力的提高主要是
因为纤维二糖水解酶的提高，因为里氏木霉纤维素酶
中的 ＣＢＨ Ｉ和 ＣＢＨ ＩＩ是其参与木质纤维原料酶解最
重要的组分，研究发现降解木质纤维原料（蒸汽爆破
预处理玉米秸秆）的纤维素酶最优组成是 ３７􀆰 ５％ 纤
维二糖水解酶 ＩＩ和 １９􀆰 ８％ 纤维二糖水解酶 Ｉ，两者相
加超过 ５３％，说明纤维二糖水解酶的重要性大于其他
所有组分的总和［２０］。 所以纤维二糖水解酶活力的提
高以及纤维二糖水解酶之间的协同作用（ｅｘｏ⁃ｅｘｏ⁃
ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ）的改善，显著地提高了纤维素酶的总体
酶活。
５　 第 １期 方　 浩等：高效转化法定向进化里氏木霉的纤维素酶
表 １　 重组菌 Ｃ１０与初始菌株的纤维二糖
水解酶活力的对比
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｒｏｍ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ Ｃ１０ ａｎｄ Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ
产酶时间 ／ ｈ
纤维二糖水解酶活力 ／ （Ｕ·ｍＬ－１）
初始菌株 转化子 Ｃ１０
２４ ３􀆰 １５±０􀆰 ３８ ９􀆰 ７５±１􀆰 ３６
４８ ７􀆰 ２８±１􀆰 ０２ ２８􀆰 ４６±３􀆰 ３５
７２ １２􀆰 ４２±１􀆰 ２４ ６２􀆰 ９７±４􀆰 １２
９６ １７􀆰 ３４±１􀆰 ６６ １０５􀆰 ５４±５􀆰 ８７
１２０ ２２􀆰 ４９±２􀆰 ２７ １２２􀆰 ４４±５􀆰 ９１
１４４ ２４􀆰 ６９±２􀆰 ３４ １２５􀆰 ８８±７􀆰 ４２
表 ２　 重组菌 Ｃ１０与初始菌株的滤纸酶活力的对比
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｒｏｍ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ Ｃ１０ ａｎｄ Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ
产酶时间 ／ ｈ
滤纸酶活力 ／ （ ＩＵ·ｍＬ－１）
初始菌株 转化子 Ｃ１０
２４ ０􀆰 ８５±０􀆰 １３ １􀆰 ７９±０􀆰 ３３
４８ ２􀆰 １９±０􀆰 ２５ ５􀆰 ０３±０􀆰 ４１
７２ ３􀆰 ７１±０􀆰 ３５ １１􀆰 ３５±１􀆰 ０８
９６ ５􀆰 ６４±０􀆰 ８１ １８􀆰 ９６±１􀆰 ８２
１２０ ６􀆰 ７１±０􀆰 ７９ ２８􀆰 ９２±２􀆰 ４５
１４４ ７􀆰 ０５±０􀆰 ７６ ２４􀆰 ５０±７􀆰 ４２
２􀆰 ８　 酶解实验结果
将重组里氏木霉所产的纤维素酶应用到降解
农业废弃物中，分别酶解碱处理玉米秸秆和碱处理
稻草，结果分别由图 ７和图 ８所示，以初始菌株所产
纤维素酶为对比。 由图 ７、图 ８ 可知：在同等酶用量
和相同酶解条件下，里氏木霉转化子 Ｃ１０ 所产纤维
素酶降解碱处理玉米秸秆的得率 ７６􀆰 ８％，降解碱处
理稻草的得率 ６８􀆰 ２％；高于初始菌株所产纤维素酶
降解碱处理玉米秸秆的得率 ６７􀆰 ５％，降解碱处理稻
草的得率 ５７􀆰 ３％；转化子 Ｃ１０ 所产纤维素酶的降解
性能较初始菌株提高了 ９􀆰 ３％ ～１０􀆰 ９％，说明纤维二
糖水解酶之间的协同作用的改善对于纤维素酶降
解木质纤维素有明显的促进作用，该结果也证实了
纤维二糖水解酶组分在木质纤维素降解中的重要
作用。 实验结果说明本研究建立的里氏木霉基因
工程技术是高效的，此高效转化法不仅可以在很大
程度上减少里氏木霉基因工程中转化子筛选的工
作量，而且对里氏木霉纤维素酶的定向进化有重要
的促进作用。
图 ７　 碱处理玉米秸秆的酶解
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ
ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｃｏｒｎ ｓｔｏｖｅｒ
图 ８　 碱处理稻草的酶解
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ
ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｒｉｃｅ ｓｔｒａｗ
３　 结论
根癌农杆菌介导的里氏木霉转化的最优条件：共
培养 ｐＨ ５􀆰 ３、共培养温度 ２４ ℃、乙酰丁香酮浓度 ２００
μｍｏｌ ／ Ｌ、根癌农杆菌浓度 ＯＤ６６０值 ０􀆰 ８、里氏木霉孢子
预萌发时间 ３ ｈ，此时每 １０７里氏木霉孢子出现 １３ ０００
个转化子，是未优化条件下的 ２７ 倍以上。 将此高效
转化法用于定向进化里氏木霉的纤维素酶，获得优良
里氏木霉转化子 Ｃ１０，其纤维二糖水解酶活力为
（１２２􀆰 ４４± ５􀆰 ９１） Ｕ ／ ｍＬ，是初始菌株（２２􀆰 ４９ ± ２􀆰 ２７）
Ｕ ／ ｍＬ的 ５􀆰 ４倍；滤纸酶活力为（２８􀆰 ９２±２􀆰 ４５） ＩＵ ／ ｍＬ，
是初始菌株（６􀆰 ７１±０􀆰 ７９） ＩＵ ／ ｍＬ 的 ４􀆰 ３ 倍。 在同等
条件下，里氏木霉转化子 Ｃ１０所产纤维素酶降解碱处
理玉米秸秆和碱处理稻草的性能较初始菌株提高了
９􀆰 ３％～１０􀆰 ９％。 综上所述，本研究建立的里氏木霉基
因操作技术是高效的，对进行里氏木霉纤维素酶的定
向进化具有很好的参考价值。
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ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒａｎｄｏｍ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ
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ｍｉｘｔｕｒｅ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔｅａｍ⁃ｅｘｐｌｏｄｅｄ ｃｏｒｎ ｓｔｏｖｅｒ ｂｙ
ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ［ Ｊ］ ． Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２００９，
１００：８１９⁃８２５．
（责任编辑　 周晓薇）
７　 第 １期 方　 浩等：高效转化法定向进化里氏木霉的纤维素酶