全 文 ：第25卷 第10期
2013年10月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 25, No. 10
Oct., 2013
文章编号：1004-0374(2013)10-0966-12
脂肪酸合成系统潜能的挖掘与释放
王艺璇，柳志杰，刘天罡*
(武汉大学药学院，组合生物合成与新药发现教育部重点实验室，武汉 430071)
摘　要：在全球石油资源不断减少和温室气体不断积累的情况下，急需发展可再生燃料能源及各种生物化
工原料和产品。基于该目的，能够生产高能量密度液体生物燃料和高附加值化工品的微生物脂肪酸合成系
统备受关注。首先介绍了大肠杆菌脂肪酸代谢系统的组成，然后详细总结了通过改造脂肪酸代谢途径生产
脂肪酸以及脂肪酸衍生物的最新研究进展，并介绍了利用体外重建体系来研究脂肪酸合成途径对该系统进
行深入挖掘，以及根据得到的信息指导体内脂肪酸途径的改造来释放脂肪酸合成系统的潜能。
关键词：脂肪酸合成；无细胞体系；体外重建体系；合成生物学
中图分类号：O621；Q936；Q81 文献标志码：A
Excavation and releasing the potential of fatty acid
biosynthesis system—a review
WANG Yi-Xuan, LIU Zhi-Jie, LIU Tian-Gang*
(Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery, Ministry of Education,
School of Pharmaceutical Science, Wuhan University, Wuhan 430071, China)
Abstract: Diminishing petroleum reserves and the rapid accumulation of greenhouse gases have prompted an
interest in the development of biofuels and oleochemicals from renewable sources. Based on this purpose, fatty acid
biosynthesis system, a route for producing high-energy density, liquid biofuels and high-value oleochemicals, has
received significant attention. This review first introduced classic E. coli fatty acid biosynthesis system, and
summarized recent achievements on the engineering the fatty acid metabolic system to produce fatty acids and fatty
acid derivatives. Most importantly, this review introduced the in-depth excavation of the fatty acid biosynthesis
pathway by using the in vitro reconstituted system, and engineering the fatty acid metabolic system in vivo
according to the obtained information to release the potential of the fatty acid biosynthesis system.
Key words: fatty acid biosynthesis; cell free system; reconstituted system; synthetic biology
收稿日期：2013-05-30；修回日期：2013-07-29
基金项目：国家重点基础研究发展计划(“973”项目)
(2011CBA00806)
*通信作者：E-mail: liutg@whu.edu.cn
1　脂肪酸合成系统研究的意义
在全球石油资源不断减少以及污染越来越严重
的情况下，为了缓解人类对石油资源的依赖，我们
急需发展新型的可再生燃料能源及各种生物化工原
料和产品。由于目前的生物燃料性能不是非常理想，
所以新型生物燃料的研发受到了我们的广泛关注。
科研人员想制造出更接近目前汽油和柴油的分子，
在与目前发动机以及运输、储存设备匹配的基础
上性能更好的生物燃料。纵观生物体内所有代谢
途径，脂肪酸代谢途径产生的脂肪酸分子最接近
柴油分子，脂肪酸脱去羧基就可以将其变为长链
的烷烃 [1-3]，其就是柴油中的主要成分；同时，脂
肪酸经过酯化后即可形成生物柴油 —— 脂肪酸
脂 [4-6]；脂肪酸经过还原后可形成高级化工原料——
脂肪醇 [7-9]；3-羟基脂肪酸经酯化聚合后可形成高
级生物材料——聚羟基脂肪酸脂 (PHA)[10-12]。脂肪
酸合成途径还可以用来生产营养品——不饱和脂
肪酸 DHA和 EPA[13-15]。脂肪酸途径的改造以及高
王艺璇，等：脂肪酸合成系统潜能的挖掘与释放第10期 967
效利用对人类的可持续发展和提高生活质量将有重
要的贡献。
2　脂肪酸代谢系统的组成
2.1　脂肪酸代谢的过程
在所有的脂肪酸合酶中，大肠杆菌脂肪酸合酶
研究得最多，以下就简单地介绍大肠杆菌脂肪酸合
酶。大肠杆菌脂肪酸代谢过程如下 (图 1)：乙酰辅
酶 A (acetyl-CoA)在乙酰辅酶 A羧化酶 (acetyl-CoA
carboxylase, ACC)催化下形成丙二酰辅酶 A (malonyl-
CoA)。在大肠杆菌中，ACC由四个单元组成，生
物素羧基载体蛋白 (AccB)、生物素羧化酶 (AccC)
和酰基辅酶 A羧基转移酶 (AccA和 AccD)。在丙二
酰辅酶 A:ACP转酰基酶 (FabD)催化下，丙二酰辅
酶 A形成丙二酰 ACP (malonyl-ACP)。接着在 β-酮
脂酰 ACP合成酶Ⅲ (FabH)催化下，丙二酰 ACP与
乙酰辅酶 A (acetyl-CoA)缩合形成乙酰乙酰 ACP
(acetoacetyl-ACP)，从而进入链的延伸阶段。链的
延伸反应首先由 NADPH依赖的 β-酮脂酰 ACP还
原酶 (FabG)催化 3-酮脂酰 ACP (3-keto-acyl-ACP )
还原生成 3-羟脂酰 ACP (3-hydroxy-acyl-ACP)，接
着产物在 β-羟脂酰 ACP脱水酶 (FabZ或 FabA)催
化下生成烯酰 ACP (enoyl-ACP)。随后，烯酰 ACP
由 NADH依赖的烯酰 ACP还原酶 (FabI)催化还原
生成脂酰 ACP(acyl-ACP)。最后，生成的脂酰 ACP
在 β-酮脂酰 ACP合成酶Ⅰ (FabB)或Ⅱ (FabF)催
化下与丙二酰ACP缩合，从而实现碳链长度的延伸。
接着进行下一次循环，每一次循环脂酰碳链增加
两个CH2基团，直到形成的长链脂酰ACP形成磷脂、
游离脂肪酸 (free fatty acids, FFAs)或其他代谢物。
以上这些构成了脂肪酸合成系统 (fatty acid biosynthesis,
FAB)。在一定的代谢情况下，形成的游离脂肪酸会
通过 β-氧化而降解。游离脂肪酸首先在脂酰辅酶 A
合成酶 (FadD)催化下形成脂酰辅酶 A (acyl-CoA)，
接着在脂酰辅酶 A脱氢酶 (FadE)催化下生成烯酰
辅酶A (enoyl-CoA)，随后在烯酰辅酶A水合酶 (FadB
或 FadJ)催化下水合形成 3-羟脂酰辅酶A (3-hydroxy-
acyl-CoA)及脱氢形成 3-酮脂酰辅酶 A (3-ketoacyl-
A，合成起始和延伸单元；B，长链脂酰-ACPs的合成；C，β氧化降解途径。
图1 大肠杆菌脂肪酸代谢系统的组成
生命科学 第25卷968
CoA)，最后，在 3-酮脂酰辅酶 A硫解酶 (FadA或
FadI)作用下形成一分子乙酰辅酶 A以及一个少两
个碳的新的脂酰辅酶 A，从而完成一个循环。长链
脂酰辅酶 A经上面一次循环，碳链减少两个碳原子，
生成一分子乙酰辅酶 A。
2.2　酰基载体蛋白(acyl carrier protein, ACP)
大肠杆菌脂肪酸合酶为Ⅱ型脂肪酸合酶，即
脂肪酸的合成以酰基载体蛋白 (acyl carrier protein,
ACP)为载体，每一步均由独立的酶催化反应 [16]。
脂肪酸合成途径中的中间体通过共价键结合在酰基
载体蛋白上。与Ⅱ型脂肪酸合酶不同，在真核生物
的Ⅰ型脂肪酸合酶中，酰基载体蛋白是一个结构
域 [17-18]。大肠杆菌细胞内的酰基载体蛋白含量丰
富，约占总的可溶性蛋白的 0.25%[19]。大肠杆菌酰
基载体蛋白由 acpP基因编码 [20]，是细菌中第一个
被研究的此类蛋白 [21]。由 acpP编码合成的酰基载
体蛋白不带辅基 (称为 apo-ACP)，没有生物活性，
必须由 acpS基因编码的 holo-ACP合成酶 (holo-acyl
carrier protein synthase, AcpS)催化，通过磷脂键
将一个来自辅酶 A的 4’-磷酸泛酰基巯基乙胺
(4’-phosphopantetheine)连接在 apo-ACP的 36位丝
氨酸残基的羟基上，形成带辅基的酰基载体蛋白
(称为 holo-ACP)(图 2)，从而具有生物活性。脂肪
酸合成途径中的中间体的羧基连接在 4’-磷酸泛
酰基巯基乙胺的硫醇上，作为底物在催化下进行脂
肪酸合成反应 [22]。枯草杆菌磷酸泛酰巯基转移酶
基因 sfp是参与脂肽代谢的功能性基因，能够修饰
大部分的载体蛋白 [23]。在大肠杆菌细胞内表达枯草
杆菌磷酸泛酰巯基转移酶能够确保细胞内的 apo-
ACP绝大部分转变成 holo-ACP [24-25]。同时，具有
活性的 holo-ACP会被 ACP水解酶 AcpH水解成
apo-ACP和 4’-磷酸泛酰基巯基乙胺，4’-磷酸泛酰
基巯基乙胺可用于合成辅酶 A。研究发现，敲除
acpH基因后，相对于原始菌，突变株的 ACP辅基
更稳定，而过表达 AcpH后，细胞内 ACP都以 apo-
ACP形式存在 [26]。
图2 大肠杆菌酰基载体蛋白辅基代谢图
王艺璇，等：脂肪酸合成系统潜能的挖掘与释放第10期 969
3　利用代谢工程方法生产脂肪酸及其衍生物
3.1　脂肪酸的过量生产
在大肠杆菌中，脂肪酸合成的关键调节因子是
长链脂酰 ACP，长链脂酰 ACP对脂肪酸合成起负
调节作用 [27-28]，当过表达硫脂酶 TesA时，脂肪酸
合成途径的流量变大 [27]。ACC是整个脂肪酸合成
的关键限速酶，Davis等 [29]发现当共过表达 ACC
和 TesA时，脂肪酸含量高于仅过表达 TesA。刘天
罡等 [30]的体外实验也得到了 ACC酶催化的反应是
整个脂肪酸合成的限速步骤。Voelker等 [31]通过在
大肠杆菌中表达植物来源的中等链长的酰基载体
蛋白硫脂酶，积累以中等链长为主的脂肪酸，同时
发现只有中断 β氧化途径时脂肪酸才会积累。吕雪
峰等对大肠杆菌 BL21 (DE3)进行了 4步遗传改造
来过量生产脂肪酸 (图 3)：第一步，敲除 fadD基
因来中断 β-氧化途径以积累游离脂肪酸；第二步，
异源表达一种植物来源的硫脂酶来增加中等链长脂
肪酸的量；第三步，过量表达大肠杆菌 ACC以增
加底物丙二酰辅酶 A的量；第四步，过量表达大肠
杆菌的硫脂酶TesA。通过这些代谢工程方法的改造，
大肠杆菌脂肪酸含量达到了 2.5 g/L，产量提高了上
百倍 [32]。在此基础上，刘天罡等 [30]结合体外无细
胞体系研究的结果，对该硫脂酶的表达水平进行了
优化，使得大肠杆菌脂肪酸产量达到了 4.5 g/L/d，
产物转化率达到理论值的 20%。Lennen等 [2]用四
种不同拷贝数的质粒表达植物来源的硫脂酶 BTE，
结果发现在低拷贝质粒表达的情况下，脂肪酸的含
量最高。Hoover等 [33]通过改变诱导剂 IPTG的浓
度 (0~1 mmol/L)来改变植物来源的硫脂酶 BTE的
表达水平，发现当添加的诱导剂 IPTG浓度为 50
μmol/L时，积累的脂肪酸量最高。Keasling课题组
在 2010年构建了脂肪酸含量为 1.2 g/L大肠杆菌突
变株 [5]，随后该课题组改变硫脂酶的表达量，使用
低拷贝的载体以优化硫脂酶的表达水平，脂肪酸含
量就提高到了 3.8 g/L[34]。大肠杆菌脂肪酸合成途径
在多个层面上被严格的调控 [35]，在转录层面上，脂
肪酸合成途径各个基因受 FabR和 FadR蛋白严格
调控 [35]。FadR是个转录因子，通过结合在特定
DNA系列上来控制脂肪酸合成、降解以及跨膜运
输中相关基因的表达 [36]。Keasling课题组在构建
的过量积累脂肪酸的大肠杆菌中进一步过表达
fadR，发现脂肪酸合成途径中的 fabB、fabF 和
accA基因表达加强，脂肪酸含量提高了 7.5倍，达
到了 (5.2 ± 0.5) g/L，产物转化率达到理论值的
73%[37]。Xu等 [38]根据代谢途径的特点，将大肠杆
菌脂肪酸合成途径分为三个模块：上游乙酰辅酶 A
形成模块，中间乙酰辅酶 A活化模块以及下游脂肪
酸合成模块，通过优化这三个模块，在大肠杆菌中积
累了 8.6 g/L的脂肪酸。
在一定的条件下，有些微生物产生并储存的油
脂占其生物总量的 20%以上，具有这样表型的微
生物称为油脂微生物。通过限制培养基营养 [39-40]以
及应用不同发酵模式 [41]调控油脂合成，油脂微生
物油脂含量得到了很大的提高。为了进一步提高这
些油脂微生物的油脂含量，学者们开始用代谢工程
方法来改造油脂微生物以提高油脂含量。研究发现，
在油脂微生物中，脂肪酸合成中碳链延伸反应所需
的 NADPH几乎完全来源于苹果酸酶 (ME)催化的
反应 [42-43]。Zhang等 [44]在 M. circinelloides中过表
达苹果酸酶，发现油脂积累量提高了 2.5倍。对油
图3 改造大肠杆菌脂肪酸代谢途径过量生产脂肪酸
生命科学 第25卷970
脂酵母油脂积累机理的研究发现，油脂酵母线粒体
中的异柠檬酸脱氢酶 (ICDH)受 AMP的调节。当胞
内氮源匮乏时，AMP在脱氨酶作用下脱氨形成
IMP。ICDH活性受到 AMP减少的影响，甚至没有
活性，导致了线粒体内柠檬酸的积累，积累的柠檬
酸会被转运到胞液中。在胞液中的 ATP-柠檬酸裂
解酶 (ACL)作用下，柠檬酸会裂解为草酰乙酸和乙
酰辅酶 A，积累的乙酰辅酶 A在脂肪酸合酶 (FAS)
作用下合成油脂 [43, 45]。在酿酒酵母 (Saccharomyces
cerevisiae)不含有编码 ACL的基因。最近，Tang
等 [46]在酿酒酵母中敲除异柠檬酸脱氢酶基因
ICDH，同时异源表达 ATP-柠檬酸裂解酶 ACL，脂
肪酸含量提高了 21.1%。随着油脂微生物全基因组
测序的完成 [47-48]，这些可为油脂积累机制研究提供
大量新信息，从而可以更好地指导代谢工程改造以
进一步提高油脂含量。
3.2　生物柴油的生产
生物柴油是最重要的液体可再生能源产品之
一，其化学成分主要为长链脂肪酸酯，通常为甲酯
或乙酯。生物柴油具有含硫量低、能量密度高、燃
烧充分、润滑性能好等液体能源产品所期望的优良
性能，还具有可再生、易生物降解、储运安全、抗
爆性好等特点，所以可作为优质的石化柴油替代品。
2003 年，Kalscheuer 等 [49] 在一种不动杆菌
(Acinetobacter) 中发现了生物柴油生产的关键
酶——蜡酯合成酶 /二酰基甘油酰基转移酶 (WS/
DGAT)，其能够催化不同链长的脂酰辅酶 A与乙醇
反应生成脂肪酸乙酯。随后，他们通过在大肠杆菌
中异源表达 Acinetobacter baylyi ADP1的WS/DGAT
酶以及运动发酵单胞菌 (Zymomonas mobilis )的丙
酮酸脱羧酶 (pyruvate decarboxylase)和乙醇脱氢酶
(alcohol dehydrogenase)，生产的脂肪酸乙脂产量达
到了 1.28 g/L[6]。Keasling课题组通过建立动态感应 -
调节系统 (dynamic sensor-regulator system, DSRS)，
动态调节脂酰辅酶 A与乙醇的浓度，脂肪酸乙脂含
量达到了 1.5 g/L，达到了最大理论产率的 28%[34]。
3.3　脂肪醇的生产
脂肪醇在化妆品、洗涤剂、护肤品、药品中有
大量的运用。2000年，Metz等 [50]纯化了能够积累
长链脂肪醇的 jojoba的脂酰辅酶 A还原酶 (fatty
acyl CoA reductase, FAR)，通过实验证明该酶能将
脂酰辅酶 A还原成为脂肪醇。刘天罡等 [51]在大肠
杆菌中表达了 jojoba的 FAR基因，产生了 0.2 g/L
的 C12-C18脂肪醇。Doan等 [7]在大肠杆菌中表达
了 5个拟南芥 (Arabidopsis)的 FAR基因，生产得到
了脂肪醇。Keasling课题组在敲除 fadE基因的大
肠杆菌中异源表达乙酸钙不动杆菌 (Acinetobacter
calcoaceticus)的 FAR基因 acr1，同时过表达 tesA
和 fadD基因，生产得到了 100 mg/L的 C16和 C18
链长的脂肪醇 [5]。Zheng等 [52]在大肠杆菌中共表达
植物硫脂酶基因 BTE、fadD和 acr1基因，生产得
到了 210.1 mg/L的 C12和 C14链长的脂肪醇，通
过进一步优化基因的表达水平，产量达到了 449.2
mg/L。同时通过共表达 tesA、fadD和 FAR基因，
得到了 101.5 mg/L的链长为 C16和 C18的脂肪醇。
Tan等 [53]在蓝细菌中异源表达来自于 jojoba的脂酰
辅酶 A还原酶，同样合成了 200.44 μg/L的脂肪醇。
利用脂酰辅酶 A还原酶生产脂肪醇，会同时积累脂
肪醛 [7-8]，积累的脂肪醛对细胞有毒性。2011年，
Willis等 [54]证实一种来自 Marinobacter aquaeolei
VT8的脂酰辅酶 A还原酶可以将脂酰辅酶 A直接
还原成脂肪醇，而不积累脂肪醛。Hofvander等 [55]
进一步证实 M. aquaeolei VT8的Maqu_2220蛋白即
为脂酰辅酶 A还原酶，并且证明该酶能够催化脂
肪醛、脂酰 CoA以及脂酰 ACP得到脂肪醇。可以
用 M. aquaeolei VT8的脂酰辅酶 A还原酶来生产脂
肪醇，以避免积累脂肪醛，减少对细胞的毒性。最近，
Akhtar等 [3]发现一种来自Mycobacterium marinum的
羧酸还原酶 (carboxylic acid reductase, CAR)可以直
接催化脂肪酸得到脂肪醛，通过在大肠杆菌中共表
达这种羧酸还原酶和醛还原酶 (aldehyde reductase,
AHR)生产得到了 350 mg/L的脂肪醇。
3.4　脂肪烷烃的生产
脂肪烷烃是与目前汽油、柴油和航空燃料主要
成分一样的分子，作为生物能源，不需要投入大量
的成本来改变下游的运输储藏设备甚至汽车和飞机
的发动机构造。Schirmer等 [1]成功解析了蓝细菌中
烷烃的合成途径，脂酰 ACP首先在脂酰 ACP 还原
酶 (acyl-ACP reductase)的作用下形成脂肪醛，然后
脂肪醛经醛脱羰酶 (aldehyde decarbonylase)催化脱
羰基生成相应的烷烃。在大肠杆菌中共表达这两个
酶，生产得到了 300 mg/L的脂肪烷烃。Tan等 [53]
通过在蓝细菌中过量表达 ACC 以提高细胞内脂
酰 ACP的含量，提高了蓝细菌脂肪烷烃的产量。
Akhtar等 [3]在大肠杆菌中共表达来自Mycobacterium
marinum的羧酸还原酶 CAR和醛脱羰酶，生产得
到了 2 mg/L的脂肪烷烃。直接催化脂肪酸得到脂
肪醛的羧酸还原酶的发现具有重要的意义，改造微
王艺璇，等：脂肪酸合成系统潜能的挖掘与释放第10期 971
生物过量积累游离脂肪酸取得了很大的进展，在此
基础上可以进一步表达该羧酸还原酶以及相关酶，
从而大幅度提高脂肪酸衍生物，如脂肪醇、脂肪烷
烃等产量。
3.5　聚羟基脂肪酸脂(PHA)的生产
随着全球石油资源的不断减少，人们开始寻找
一个能替代石油化工类塑料的可持续发展的材料。
聚羟基脂肪酸酯 (PHA)是微生物体内的一类 3-羟
基脂肪酸组成的线性聚酯，与传统的、以石油为原
料合成的塑料，如聚乙烯、聚丙烯等有相似的材料
学性质，而且由于 PHA是在微生物体内合成的，
这保证了它的立体特异性，这对于 PHA的生物可
降解性和生物相容性非常重要。当前 PHA已经被
认为是一种“环境友好塑料”，可以替代传统不可
降解塑料，得到了越来越多的重视 [56-61]。
碳链长度在 C6-C14之间的中等链长的 PHA
(mcl-PHA)能够很好地应用在生物医学方面，如人
造心脏瓣膜、人造食管、人造软骨和皮肤再生等，
因此近年来越来越多的学者开始研究中等链长的
PHA[62-69]。中等链长的 PHA可以由脂肪酸合成或降
解途径的中间代谢物合成 (图 4)。连接脂肪酸代谢
和 PHA合成的酶有烯酰辅酶 A水合酶 (enoyl-CoA
hydratase, PhaJ)、R-3-羟脂酰载体蛋白硫脂酶 ((R)-
3-hydroxyacyl-acyl-carrier protein thioesterase, PhaG)
A，利用脂肪酸合成途径；B，利用脂肪酸降解途径。
图4 利用脂肪酸代谢系统生成聚羟基脂肪酸酯
生命科学 第25卷972
和中等链长 PHA聚合酶 (mcl-PHA polymerases, PhaC)。
Wang等 [10]通过 qRT-PCR发现 P. putida KT2440的
PP0763基因具有编码 3-羟脂酰辅酶 A连接酶的
特性，进而在大肠杆菌中异源表达来自 P. putida
KT2440的 PhaG、PP0763和来自 Pseudomonas sp. 61-3
PHA合成酶 PhaC，构建的重组菌在以葡萄糖为碳
源的培养基中积累了 400 mg/L的中等链长 PHA。
但由于这些酶催化反应没有链长特异性，所以生产
得到的 PHA为多聚物，如Wang等生产的 mcl-PHA
就包括碳链长度为 8、10、12、14的单体，这样生
产得到的 PHA无法精确控制单体组成，以及分离纯
化获得单体成本极高。于是，越来越多的研究集中
在如何生产 PHA均聚物 (homo-polymers)[12, 56, 58, 70-71]。
陈国强课题组敲除了 Pseudo-monas putida KT2442
的 phaG基因以及 β氧化相关的基因，在以脂肪酸
为碳源下得到了对应链长的 PHA均聚物 [56, 70]。
Nomura课题组敲除了大肠杆菌的 fadB和 fadJ基因
以完全中断 β氧化，再表达 PHA合成相关的酶
PhaJ和 PhaC，同样在以脂肪酸为碳源下得到了对
应链长的 PHA均聚物 [71]。随后，Pfleger课题组也
得到了类似的结果，他们敲除大肠杆菌的 fadB、
fadJ、fadA和 fadI基因以完全中断 β氧化，再表达
PHA合成相关的酶 PhaJ和 PhaC，以月桂酸为底物
得到了 C12链长的 PHA均聚物 [12]。但是，这些生
产 PHA均聚物的方法都需要额外添加脂肪酸等碳
源，这类碳源的价格普遍比糖类碳源贵很多，且对
细胞毒性较大，不利于细胞培养。以相对廉价的简
单糖类为碳源来生产 PHA，能够有效地降低其生产
成本，促进 PHA材料的工业化生产和应用开发。
改造微生物脂肪酸代谢途径，利用葡萄糖等廉价碳
源来生产 PHA均聚物具有重要的意义，有待于进
一步的研究。
4　脂肪酸合成系统的体外重建来研究脂肪酸
合成途径
微生物来源的脂肪酸及其衍生物是重要的生物
能源和化工原料的潜在替代品，通过代谢工程方法
生产得到了脂肪酸及其衍生物，但是脂肪酸合成途
径作为细胞主代谢途径，受到细胞本身诸多层面的
调控，其产量和产率难以提升，使其产品成本距离
石油化工还有一段差距。如何有针对性地去改造微
生物以有效地、大幅度地提高产量就显得尤为重要。
对脂肪酸合酶的研究是这一研究方向的关键和热
点。目前，用于脂肪酸合成系统的研究方法主要有
基因敲除、基因过表达以及体外重建脂肪酸合成系
统，这些方法互为验证、互为补充，在脂肪酸代谢
系统的研究中起到独特的作用 [72]。
利用无细胞体系重建体内代谢途径，进行定量
化改造，可以达到“手术刀”的效果，包括以下几
步 (图 5)：(1)体外途径系统的构建；(2)体外酶反
应以及动力学分析；(3)提炼信息并提供量化的数
据；(4)指导体内的遗传改造。刘天罡等通过构建
无细胞体系研究了大肠杆菌从乙酰辅酶 A到脂肪酸
合成体系中相关酶的活性，得到了随着乙酰辅酶 A
羧化酶浓度的增加，脂肪酸产率变大，丙二酰辅酶
A的浓度是整个脂肪酸合成的限速步骤，而硫脂酶
和 apo-ACP的浓度对脂肪酸产率的影响呈现出极大
值的情况，所以要精确控制硫脂酶和 apo-ACP的表
达水平使得脂肪酸的产率达到最大 [30]。如上文，通
过优化体内硫脂酶的表达水平，脂肪酸及其衍生物
产量得到了很大的提高，刘天罡等的体外实验很好
地解释了这个现象。大肠杆菌在发酵生产产品过程
中通常会产生大量的乙酸等副产物 [73]，于是一些研
究就集中在敲除丙酮酸氧化酶基因 poxB、磷酸转乙
酰酶基因 pta[74]、乙酸激酶基因 ackA、乙醇脱氢酶
基因 adhE，同时过表达乙酰辅酶 A合成酶 (acetyl-
CoA synthetase)基因 acs[75]等来减少乙酸等副产物
的量，在这些研究中，这些遗传改造提高了产品的
产量。而这些改造对大肠杆菌过量生产脂肪酸没有
效果 [30, 76]，这些结果说明乙酰辅酶 A的浓度不是整
个合成的限速步骤。刘天罡等的体外实验结果很好
地解释了这个现象：当乙酰辅酶 A浓度超过 100
μmol/L时，乙酰辅酶 A浓度的进一步增加对脂肪
酸合成速率没有影响。在油脂酵母中过表达苹果酸
酶，提高 NADPH的浓度，油脂含量得到了提高 [44]。
在大肠杆菌中，辅因子 NADPH的浓度是不是也限
制了脂肪酸的合成速率呢？刘天罡等通过体外无细
胞系统得到了 NADPH的 Km值为 34.7 μmol/L[30]，
而大肠杆菌中 NADPH浓度一般为 200 μmol/L[77-78]，
这说明在大肠杆菌中 NADPH的浓度不会影响脂肪
酸的合成速率，因此不需要改造大肠杆菌细胞来增
加 NADPH浓度以提高脂肪酸的产率。
为了研究脂肪酸合成途径中各个酶、辅因子以
及底物对脂肪酸合成速率的影响，达到有针对性
地改造脂肪酸合成途径，以大幅度地提高脂肪酸及
其衍生物的产率。在无细胞体系基础上，刘天罡等
进一步在体外人工构建了大肠杆菌脂肪酸合成途
径，并进行了动力学研究 [25]，该工作可以称为体外
王艺璇，等：脂肪酸合成系统潜能的挖掘与释放第10期 973
系统 2.0版 (图 6)，该系统为建立人工脂肪酸体系
提供了重要信息。在这里，笔者将简单介绍该工作
以便于读者更好地理解体外重建体系研究的原理与
方法。
首先，体外脂肪酸合成系统的构建。在大肠杆
菌中，从丙二酰辅酶 A合成脂肪酸需要 9个独立的
酶 ：FabA、FabB、FabD、FabF、FabG、FabH、
FabI、FabZ和 ACP (图 1)。另外加入硫脂酶 TesA
A，体外途径系统的构建； B，体外酶反应以及动力学分析；C，提炼信息并提供量化的数据；D，指导体内的遗传改造。
图5 利用无细胞系统为代谢途径改造提供指导信息
图6 体外重建脂肪酸合成体系
生命科学 第25卷974
以得到游离的脂肪酸。将这些蛋白分别表达和纯化。
FabA、FabB、FabD、FabF、FabG、FabH、FabI、
FabZ 和 TesA 的纯化用 E. coli BL21 (DE3) 菌株。
而 ACP的纯化使用 E. coli BAP1作为宿主。E. coli
BAP1是在 E. coli BL21 (DE3)菌株的染色体上整合
了枯草杆菌磷酸泛酰巯基转移酶基因 sfp，用 E. coli
BAP1纯化 ACP能够确保得到的 ACP主要以 holo-
ACP的形式存在。通过测量信使 RNA水平和蛋白
浓度，以及体外实验确定体外重建脂肪酸合成系统
的最初状态。
在构建好体外脂肪酸合成系统后，进行动力学
研究。通过加入 [2-14C]丙二酰辅酶 A或 [1-14C]乙
酰辅酶 A放射性底物 (其他的为非放射性底物，酶
和辅因子 )后反应开始。定时取出反应液，测定生
成的脂肪酸的放射性，换算即可得到体系的脂肪酸
合成速率。通过分别改变体系中的各个酶的浓度，
就可以得到脂肪酸合成速率与途径中各个酶浓度的
关系。
利用构建的体外脂肪酸合成体系，刘天罡等
发现 FabA、FabB、FabD、FabF、 FabG、FabH、
FabI、FabZ、ACP和 TesA这 10个蛋白浓度对脂肪
酸合成速率的影响可以分为 4组。第一组，FabA、
FabB、FabD和 FabG蛋白浓度发生改变时，脂肪
酸合成速率没有受到影响；第二组，当 FabF和
FabH蛋白浓度变大时，脂肪酸合成速率下降；第
三组，脂肪酸合成速率随 FabI和 FabZ蛋白浓度的
变大而上升；第四组，脂肪酸合成速率随 ACP和
TesA蛋白浓度的变大而上升，但当这两个蛋白浓
度超过一定值后，脂肪合成速率反而下降。综合上
面的结果，应该控制 FabF和 FabH在较低水平，过
表达 FabI和 FabZ，而控制 ACP和 TesA在适当的
水平使得脂肪酸合成速率达到最大值。根据得到的
结果，对构建的体外体系中各个蛋白的浓度进行了
优化，在优化体系中，脂肪酸合成以超出寻常的速
率进行。同时，体内实验也很好地证明了体外的实
验结果，在大肠杆菌中进一步过表达 FabI、FabZ
和 FabG，在摇瓶培养的情况下脂肪酸含量从 0.45
g/L增加到了 0.65 g/L。通过这套体系得到的信息可
以很好地指导体内的改造，以大幅度提高脂肪酸及
其衍生物的产量。这套体系为今后脂肪酸合成的研
究提供了全新的研究平台，为利用脂肪酸合酶系统
生产新型生物燃料、化工原料、生物材料等奠定了
扎实的理论基础。
5　总结与展望
由上文可以看出，利用体外重建体系可以对脂
肪酸合成系统的潜能进行深入的挖掘，根据体外实
验得到的信息来指导体内脂肪酸途径的改造可以很
好地释放脂肪酸合成系统的潜能。该体系还能广泛
地用来分析其他微生物的脂肪酸合成途径，同时也
可以用来研究其他的代谢途径，为改造微生物的代
谢途径提供了很多有针对性的、有效的信息。通过
代谢工程方法 (图 7A)生产得到了相应的生物燃料
及生物化工产品，但为了满足工业化的要求，还需
要对构建的系统进行进一步的改造。利用体外重建
体系提供的信息得到脂肪酸合成最优的系统，接下
来，可以根据得到的最佳比例指导体内构建脂肪酸
合成途径。随着利用人工合成的方法对现有的、天
然存在的生物系统进行重新设计和改造的合成生物
学的发展，可以用合成生物学方法 (图 7B)在体内
实现脂肪酸合成速率的最大化，以实现脂肪酸以及
脂肪酸衍生物的工业化生产。
[参　考　文　献]
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图7 利用合成生物学方法建立最优化的代谢途径
生命科学 第25卷976
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