全 文 ：第 １３卷第 ２期
２０１５年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０２􀆰 ０１８
收稿日期：２０１４－０１－１０
基金项目：江苏省高校优势学科建设工程（１１１ ２ ０６）
作者简介：冯玲然（１９８８—），女，河南南乐人，硕士研究生，研究方向：微生物学；余晓斌（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｂｙｕ＠ ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ
普洱茶中功能性微生物的筛选及其对普洱茶感官
品质的影响
冯玲然，王　 强，罗　 玮，余晓斌
（江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 ２１４１２２）
摘　 要：普洱茶的渥堆发酵过程是以晒青毛茶的内含成分为基础，在微生物分泌的胞外酶及湿热作用下，发生一系
列化学变化，最终形成普洱茶独特的风味。 采用稀释涂布法，根据产酶微生物的特性，经过固体平板初筛和液体茶
汤培养基复筛，从普洱茶中分离得到若干株产酶菌株，并从中挑选优良菌株接种普洱茶固体发酵，考察其对普洱茶
感官品质的影响。 经分子生物学鉴定，Ｄ１３ １６ 为米曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ），相似度为 ９８􀆰 ６２％；ＧＪ ０２ 为米根霉
（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｃｒｙｚａｅ），相似度为 ９８􀆰 ５７％；ＸＷ １０ 和 ＤＦ ０３ 均为黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ），相似度分别为 ９９􀆰 １０％和
９９􀆰 ９２％。 结果表明：普洱茶香气的形成主要与蛋白酶产生菌有关，ＤＢ １６发酵后香气评分达到 ３１分（对照 ２８，总
分 ４０）；汤色主要受多酚氧化酶产生菌的影响，ＤＦ ０３发酵后汤色评分达到 １９分（对照 １２，总分 ２０）；而这四种功
能性微生物均在不同程度上促进了普洱茶滋味的形成。
关键词：普洱茶；筛选；微生物；酶；感官品质
中图分类号：ＴＳ２７２􀆰 ５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０２－００９３－０５
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｕ⁃ｅｒｈ ｔｅａ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔｓ
ｏｎ ｔｈｅ ｓｅｎｓｏｒｙ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｕ⁃ｅｒｈ ｔｅａ
ＦＥＮＧ Ｌｉｎｇｒａｎ，ＷＡＮＧ Ｑｉａｎｇ，ＬＵＯ Ｗｅｉ，ＹＵ Ｘｉａｏｂｉｎ
（Ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｕ⁃ｅｒｈ ｔｅａ ｉｓ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ
ｆｕｎｇｉ ｔｏ ｃｏｎｖｅｒｔ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｓｕｎ⁃ｄｒｉｅｄ ｇｒｅｅｎ ｔｅａ ｌｅａｖｅｓ，ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｕｎｉｑｕｅ Ｐｕ⁃ｅｒｈ ｆｌａｖｏｒｓ． Ｉｎ
ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ｗｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｏｍｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｕ⁃ｅｒｈ ｔｅａ． Ａｆｔｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｍａｉｎ
ｍｉｃｒｏｂｅｓ ＤＢ⁃１６ ａｎｄ ＧＪ⁃０２ ａｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ａｎｄ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ＤＦ⁃０３
ａｎｄ ＸＷ⁃１０ａｒｅ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅｓｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｔｏ Ｐｕ⁃ｅｒｈ ｔｅａ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｏ ｓｔｕｄｙ
ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｓｅｎｓｏｒｙ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｕ⁃ｅｒｈ ｔｅａ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ Ｐｕ⁃ｅｒｈ ｔｅａ􀆳ｓ ａｒｏｍａ ｉｓ ｍａｉｎｌｙ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ
ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｗｉｔｈ ａｎａｒｏｍａ ｓｃｏｒｅ ｏｆ ３１ （ｃｏｎｔｒｏｌ ２８，ｔｏｔａｌ ｓｃｏｒｅ ４０） ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ
ＤＢ⁃１６；ｔｈｅ ｌｉｑｕｏｒ ｃｏｌｏｒ ｉｓ ｍａｉｎｌｙ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｗｉｔｈ ａ ｌｉｑｕｏｒ ｃｏｌｏｒ ｓｃｏｒｅ
ｏｆ １９ （ｃｏｎｔｒｏｌ １２，ｔｏｔａｌ ｓｃｏｒｅ ２０） ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ ＤＦ⁃０３．Ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｏｆ Ｐｕ⁃ｅｒｈ ｔｅａ􀆳ｓ ａｒｏｍａ ａｎｄ ｃｏｌｏｒ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｕ⁃ｅｒｈ ｔｅａ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｍｉｃｒｏｂｅ；ｅｎｚｙｍｅ；ｓｅｎｓｏｒｙ ｑｕａｌｉｔｙ
　 　 普洱茶是以中国云南大叶种茶树的鲜叶经过
杀青、揉捻、干燥等工艺程序制备而成的晒青毛茶
为原料，再经过渥堆发酵而成的散茶和紧压茶。 如
今普洱茶生产工艺将古代制法的晒青和现代制法
的渥堆发酵结合，赋予其更独特的风味。 普洱茶在
发酵过程中的功能性微生物与其陈香、醇厚、甘甜、
丝滑等风味品质特点是分不开的［１－２］。 微生物分泌
的胞外酶（如多酚氧化酶、纤维素酶、果胶酶和蛋白
酶等）催化普洱茶生茶中茶多酚的氧化缩合、蛋白
质的降解、碳水化合物的分解以及各产物之间的聚
合等一系列复杂反应［３－４］。 在发酵过程中，大分子
碳水化合物被分解为小分子的糖及可溶性糖，可溶
性糖是构成普洱茶汤滋味和黏稠度的重要物质之
一，同时也是在感官上表现出的所谓“甘甜”。 茶叶
中所含蛋白质约占干物质量的 ２０％ ～ ３０％，经过加
工工艺分解为多种氨基酸，赋予普洱茶汤“醇厚”及
新鲜的口感。 芳香物质及糖类等，经过复杂的生物
化学反应产生萜烯醇类等化合物，表现出了普洱茶
特有的“陈香”风味。 茶多酚在茶叶中是最具有特
征性的物质，经发酵过程氧化分解为各种茶色素，
赋予了普洱茶茶汤独特古朴的红褐底色［５－６］。
普洱茶的品质成分主要是在渥堆发酵过程中
形成。 如粗纤维、蛋白质、茶多酚和果胶等在微生
物分泌的胞外酶和湿热条件的协调作用下，发生了
氧化、聚合、降解、分解和转化反应，鲜、醇、甜、酸、
涩、苦等风味物质综合调和，形成了普洱茶陈醇微
涩的独特口感［７］。 因此，考察普洱茶中的产酶功能
性微生物对普洱茶品质成分的影响具有重要意义。
本研究中，笔者从普洱熟茶中筛选得到产多酚
氧化酶、蛋白酶、果胶酶和纤维素酶的微生物，并将
其接种普洱茶固体发酵，考察不同功能性微生物对
普洱茶感官品质的影响。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
所用晒青毛茶、普洱熟茶均由云南中茶茶叶有
限公司提供。
１􀆰 ２　 培养基
奶粉培养基　 牛肉膏 ５ ｇ，蛋白胨 １０ ｇ，ＮａＣｌ １０ ｇ，
琼脂 ２５ ｇ，脱脂奶粉 １０ ｇ，水 １ ０００ ｍＬ。 ｐＨ ７􀆰 ０～７􀆰 ２。
果胶培养基　 果胶 １ ｇ，蔗糖 ２０ ｇ， ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
０􀆰 ５ ｇ， ＫＣｌ ０􀆰 ５ ｇ，Ｆｅ２（ＳＯ４）３ ０􀆰 ０１ ｇ， Ｋ２ＨＰＯ４ １ ｇ，
ＮａＮＯ３ ３ ｇ，琼脂 ２５ ｇ，水 １ ０００ ｍＬ。 ｐＨ自然。
刚果红纤维素培养基　 羟甲基纤维素钠（ＣＭＣ
Ｎａ） １０ ｇ， （ ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ ２ ｇ， ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ５ ｇ，
ＫＨ２ＰＯ４ １ ｇ，ＮａＣｌ ０􀆰 ５ ｇ，刚果红 ０􀆰 ２ ｇ，琼脂 ２５ ｇ，水
１ ０００ ｍＬ。 ｐＨ自然。
茶叶琼脂培养基　 晒青毛茶 ３０ ｇ，水 １ ０００ ｍＬ，
煮沸 ５ ｍｉｎ，纱布过滤去除茶渣，琼脂 ２０ ｇ。 ｐＨ ６􀆰 ０，
１２１ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ。
液体茶汤培养基　 晒青毛茶粉碎，按固液化 １ ∶
２５ ｇ ／ ｍＬ加水混合，煮沸 １０ ｍｉｎ，２５０ ｍＬ三角瓶装液
５０ ｍＬ，ｐＨ ６􀆰 ０，１１０ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ。
固体发酵培养基　 按 ｍ（晒青毛茶） ∶ ｍ（水）＝
５ ∶ ２ 的比例混合，充分混合后分装 ２５０ ｍＬ 三角瓶，
每瓶 ２０ ｇ。
１􀆰 ３　 试验方法
１􀆰 ３􀆰 １　 蛋白酶产生菌的筛选
称取普洱茶熟茶 １ ｇ，加入 ９９ ｍＬ无菌生理盐水
中，浸泡 １０ ｍｉｎ，采用稀释涂布法，将茶叶水稀释至
１０－３、１０－４、１０－５梯度，分别取 １００ μＬ 涂布于奶粉培
养基，３７ ℃下培养 ４ ～ ５ ｄ，观察各个菌株的生长状
况，若在菌落周围出现透明的水解圈，则表明该菌
具有产生蛋白酶的能力。
１􀆰 ３􀆰 ２　 果胶酶产生菌的筛选
稀释涂布于果胶培养基，３７ ℃下培养 ４ ～ ５ ｄ，
后加质量分数为 １􀆰 ０％十六烷基三甲基溴化铵
（ＣＴＡＢ，多糖沉淀剂），静置 １０ ｍｉｎ，若在菌落周围
出现透明圈，则表明该菌具有产生果胶酶的能力。
１􀆰 ３􀆰 ３　 纤维素酶产生菌的筛选
稀释涂布于刚果红纤维素培养基，３７ ℃下培养
６～７ ｄ，观察各个菌株的生长状况，若在菌落周围出
现透明圈或者菌落菌丝变红，则表明该菌具有产生
纤维素酶的能力。
１􀆰 ３􀆰 ４　 多酚氧化酶产生菌的筛选
稀释涂布于茶叶琼脂培养基，３７ ℃下培养 ４～５
ｄ，观察各个菌株的生长状况，若有褐色素产生，则
表明该菌具有产生多酚氧化酶的能力。
１􀆰 ３􀆰 ５　 游离氨基酸的测定
游离氨基酸的测定采用茚三酮比色法［８］。
１􀆰 ３􀆰 ６　 水溶性果胶的测定
水溶性果胶的测定采用沉淀法［９］。
１􀆰 ３􀆰 ７　 粗纤维和茶多酚的测定
粗纤维和茶多酚的测定参考文献［１０］进行。
１􀆰 ３􀆰 ８　 液体茶汤发酵条件
由于普洱茶固体发酵周期较长，为提高筛选效
率，复筛采用液体茶汤发酵。 将平板初筛菌种接入液
体茶汤培养基中，３７ ℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ振荡培养 ４～５ ｄ。
１􀆰 ３􀆰 ９　 固体发酵条件
将复筛得到的优良菌株接种固体发酵培养基，
３７ ℃、湿度 ８０％的条件下培养 ４０ ｄ，发酵结束后进
４９ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
行感官评审。
１􀆰 ３􀆰 １０　 普洱茶内质感官评审方法
普洱茶感官评定的具体描述、评价和记录参考
云南省地方标准 ＤＢ ５３ ／ Ｔ １０３—２００６ 普洱茶，本研
究仅对普洱茶的内质进行感官评审。 普洱茶内质
的各指标权数为：香气 ４０％、滋味 ４０％、汤色 ２０％、
叶底 ２０％，总分 １００ 分。 根据各指标的等级和权数
评分，具体特征等级见表 １。
１􀆰 ３􀆰 １１　 菌种鉴定
基因组提取 　 按照上海生工生物工程有限公
司的 ＳＫ１３７５ 真菌基因组 ＤＮＡ 抽提试剂盒说明书
提取。
ＰＣＲ扩增的反应体系　 ５０ μＬ 的总反应体积中
包含 １ μＬ ＤＮＡ模板，每个引物 ０􀆰 ５ μＬ（１０ μｍｏｌ ／ Ｌ），
０􀆰 ５ μＬ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（１０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ），２􀆰 ５ μＬ １０×Ｔａｑ
ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ，加水至 ２５ μＬ。 扩增条件：９５ ℃预变
性 ５ ｍｉｎ，９４ ℃变性 ３０ ｓ，５５ ℃退火 ３５ ｓ，７２ ℃延伸 １
ｍｉｎ，３５个循环，最后 ７２ ℃延伸 ８ ｍｉｎ。 １８ｓ ｒＤＮＡ 测
序引物序列：ＮＳ１：５’ ＧＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＣＴＣ
３’；ＮＳ６：５’ ＧＣＡＴＣＡＣＡＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＴＧＣＣＴＣ ３’
ＮＳ５： ５’ ＧＴＴＴＣＴＡＧＧＡＣＣＧＣＣＧＴＡ ３’（中间引物，
用于测序）。 ＰＣＲ产物经 ｌ％的琼脂糖凝胶电泳检测，
紫外成像系统拍照。 由 ＰＣＲ产物电泳结果切割所需
ＤＮＡ目的条带纯化，具体操作步骤见说明书。 将纯
化后的 ＰＣＲ产物送往上海生工生物工程技术服务有
限公司进行序列测定。 测定的 １８Ｓ ｒＤＮＡ 序列用
Ｂｌａｓｔｎ工具与 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库中的序列进行相似性
比较分析。
表 １　 普洱散茶（熟茶）感官品质特征
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｅｎｓｏｒｙ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ Ｐｕ⁃ｅｒｈ
ｌｏｏｓｅ ｔｅａ （ｒｉｐｅ ｔｅａ）
香气 滋味 汤色 叶底
特级 陈香浓郁 浓醇甘夷 红艳明亮 红褐柔嫩
一级 陈香显露 浓醇回甘 红浓明亮 红褐较嫩
三级 陈香浓纯 醇厚回甘 红浓尚亮 红褐尚嫩
五级 陈香纯正 醇和回甘 深红尚浓 红褐欠嫩
七级 陈香纯正 醇和回甘 褐红尚浓 红褐稍粗
九级 陈香平和 纯正尚甘 褐红欠浓 红褐粗松
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 蛋白酶产生菌的筛选
蛋白酶可催化普洱茶中蛋白质水解形成氨基
酸，能改善普洱茶的鲜爽度和香气，提高茶汤质量。
本研究利用奶粉培养基从熟茶茶样中筛选出若干
株蛋白酶产生菌，根据菌落周围透明圈大小，挑选
出 ＤＢ ０７、ＤＢ ０８、ＤＢ １３、ＤＢ １６ 和 ＤＢ ２０ 这
５ 株较优菌株做进一步液体茶汤发酵试验，结果见
图 １。 由图 １可知：游离氨基酸的含量明显上升，其
中菌株 ＤＢ １６ 效果最佳。 根据文献［５，１１］报道，
在普洱茶发酵过程中，蛋白酶的作用并不能使游离
氨基酸的含量升高，熟茶中游离氨基酸含量反而比
生茶中的含量低。 这是由于在普洱茶固体发酵过
程中，氨基酸发生氧化分解和转化，形成香气物质，
并且能够与茶多酚的氧化分解产物结合形成茶褐
素等物质。 而在液体茶汤发酵过程中，菌种单一，
氨基酸很少发生分解和转化，而且已测试这几株菌
株不分泌多酚氧化酶。 所以，在微生物分泌的蛋白
酶催化作用下，茶汤中游离氨基酸含量明显上升。
图 １　 初筛菌株对游离氨酸含量的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｎ ｆｒｅｅ
ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｃｏｎｔｅｎｔ
２􀆰 ２　 果胶酶产生菌的筛选
从果胶培养基上挑选出 ＧＪ ０２、ＧＪ ０８、ＧＪ
０９、ＧＪ １３和 ＧＪ １７这 ５ 株透明圈 ／菌落直径比例
大的菌株做进一步复筛试验，结果见图 ２。 由图 ２
可知：发酵结束后，水溶性果胶含量明显升高，其中
接种菌株 ＧＪ ０２ 的实验组比对照提升了近 ４ 倍。
在茶叶加工过程中，鲜叶中的原果胶在果胶酶的作
用下水解成水溶性果胶和阿拉伯糖、半乳糖等物质
参与滋味品质的形成。 水溶性果胶是茶汤具有味
厚感和增加茶汤浓稠度并使茶汤甘醇的主要物质，
其含量变化影响普洱茶的品质［１２］。 在普洱茶渥堆
发酵过程中，原果胶和水溶性果胶成波动变化，但
总体趋势是原果胶减少而水溶性果胶增加［１２－１３］，本
文的研究结果也证实了这一点。
２􀆰 ３　 纤维素酶产生菌的筛选
根据刚果红染色后形成的水解圈直径和菌落
５９　 第 ２期 冯玲然等：普洱茶中功能性微生物的筛选及其对普洱茶感官品质的影响
图 ２　 初筛菌株对水溶性果胶含量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｎ ｗａｔｅｒ⁃ｓｏｌｕｂｌｅ
ｐｅｃｔｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ
直径的比值，挑选产纤维素酶能力较强的菌株 ＸＷ
０１、ＸＷ ０２、ＸＷ ０６、ＸＷ １０ 和 ＸＷ １２，将这 ５
株菌株接种液体茶汤发酵，结果见图 ３。 由图 ３ 可
知，菌株 ＸＷ １０ 降解茶汤中粗纤维的能力最强。
廖东兴［４］研究发现，粗纤维含量在渥堆发酵过程中
呈下降趋势。 纤维素酶作为胞壁水解酶类，可以增
加细胞壁的通透性，促进多酚类物质和游离氨基酸
等的溶出，提高水浸出物的含量，有助于保障成品
茶中含有丰富的水浸出物。
图 ３　 初筛菌株对粗纤维含量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｎ ｃｒｕｄｅ
ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ
２􀆰 ４　 多酚氧化酶产生菌的筛选
多酚氧化酶是一种含铜氧化酶，在普洱茶发酵
过程中，它将茶多酚氧化成茶色素类物质，赋予普
洱茶红艳明亮、经久耐泡的特性。 笔者从固体茶叶
平板上挑选出 ＤＦ ０３、ＤＦ １１、ＤＦ １６、ＤＦ ２１、
ＤＦ ２８和 ＤＦ ３４ 这 ６ 株生长旺盛、褐色色素产量
高的菌株做进一步液体茶汤发酵试验，结果见图 ４。
由图 ４可知，菌株 ＤＦ ０３ 降解茶多酚能力最强。
与对照相比，茶多酚含量从 ２６􀆰 ８％下降到 １１􀆰 ８％。
杨希等［１４］接种黑曲霉、米曲霉以及红曲霉进行普洱
茶发酵，茶多酚含量分别下降 １０％、 １２􀆰 ５％ 和
１３􀆰 ５％，并且茶汤色发生明显变化。 梁名志等［１５］研
究人工接种对普洱茶化学成分影响发现，采用人工
接种真菌，普洱茶中的茶多酚由生茶的 ２８􀆰 ８８％下
降到 １８􀆰 ０２％。 多酚氧化酶可催化茶多酚氧化分解
成茶色素类物质，茶色素类物质中含有茶多酚氧化
产物、蛋白质、糖类和咖啡碱等物质，成分十分复
杂，而茶黄素、茶褐素和茶红素三者的含量和比例
对普洱茶的汤色和叶底又有着直接的关系［１６］。 因
此，多酚氧化酶产生菌的筛选与添加对普洱茶品质
成分的形成具有重要意义。
图 ４　 初筛菌株对茶多酚含量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｎ ｔｅａ
ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ｃｏｎｔｅｎｔ
２􀆰 ５　 菌株的初步鉴定
根据《真菌鉴定手册》 ［１７］、《酵母菌的特征与鉴
定手册》 ［１８］和《伯杰细菌鉴定手册》 ［１９］对所筛菌株
进行形态学和生理生化鉴定。 鉴定结果表明，所筛
菌株绝大多数为霉菌，仅有少量酵母和细菌。 其
中，产蛋白酶菌株 ＤＢ １６ 菌落生长较快，质地疏
松，初呈淡黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无
色，可利用多种基质生长，初步判断为米曲霉；产果
胶酶菌株 ＧＪ ０２ 菌落最初呈白色，后变为灰褐色，
菌丝匍匐爬行，无色，假根发达，分枝呈根状，褐色，
初步判断为根霉；产纤维素酶菌株 ＸＷ １０ 和产多
酚氧化酶菌株 ＤＦ ０３ 菌落生长迅速，分生孢子头
呈放射状，产酶丰富，孢子颜色分别呈褐色和黑色，
初步判断均为黑曲霉，但菌落形态（尤其是孢子颜
色和数量）差异明显，初步判断并非同一株菌。 再
将 ＤＢ １６、ＧＪ ０２、ＸＷ １０和 ＤＦ ０３的 １８ｓ ｒＤＮＡ
序列提交 ＧｅｎＢａｎｋ数据库，利用 Ｂｌａｓｔｎ 工具进行序
列比对，对这 ３ 株菌进行序列相似性分析。 分子生
物学鉴定结果表明， ＤＢ⁃１６ 为米曲霉 （ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｏｒｙｚａｅ），相似度 ９８􀆰 ６２％；ＧＪ ０２ 为米根霉（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ
ｏｒｙｚａｅ），相似度 ９８􀆰 ５７％；ＸＷ⁃１０ 和 ＤＦ ０３ 均为黑
６９ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
曲霉 （ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ），相似度分别为 ９９􀆰 １０％
和 ９９􀆰 ９２％。
２􀆰 ６　 微生物对普洱茶感官品质的影响
分别挑选产 ４ 种酶的微生物中的优良菌株，接
种普洱茶固体发酵。 发酵结束后，根据云南省地方
标准 ＤＢ ５３ ／ Ｔ １０２ ２００３对四组茶叶进行内质感官
评审，评审结果见表 ２。 与对照相比，蛋白酶产生菌
ＤＢ １６明显提升了普洱茶香气和滋味。 这是由于
蛋白酶将茶叶中的蛋白质水解成游离氨基酸，而氨
基酸一方面直接提高普洱茶的鲜爽度，相对降低普
洱茶的苦涩味，另一方面又可分解转化成香气物
质，或与多酚氧化产物形成茶色素类物质［５］。 果胶
酶产生菌 ＧＪ ０２ 对普洱茶滋味的提升较大。 普洱
茶中原果胶在果胶酶的催化作用下水解成水溶性
果胶和其他可溶性糖类，水溶性果胶是普洱茶醇厚
口感的直接决定因素，可溶性糖又可降低普洱茶的
苦涩味，两者共同赋予其“浓醇甘夷”的特性［１２］。
纤维素酶产生菌 ＸＷ １０对普洱茶整天感官特性都
有所提升，但幅度不大。 这是由于纤维素酶改变了
细胞壁的通透性，促进了普洱茶中可溶性糖和氨基
酸等的释放。 多酚氧化酶产生菌 ＤＦ ０３ 对普洱茶
滋味和汤色的提升较为明显。 多酚氧化酶一方面
大大降低了茶多酚的含量，改善了普洱茶的滋味；
另一方面，茶多酚的降解产物茶色素对普洱茶的汤
色起着决定性的作用。 茶黄素、茶红素和茶褐素的
含量和比例赋予普洱茶红艳明亮的独特品质［１４，１６］。
普洱茶的发酵是茶叶内的物质在各种微生物分泌
的胞外酶和水热作用下，发生降解、转化、聚合等反
应，最终形成独特的风味。 普洱茶自然发酵过程
中，微生物种类繁多，功能各异，但并非没有规律
可循［２０］。
表 ２　 微生物对普洱茶感官品质的影响
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｏｎ ｓｅｎｓｏｒｙ
ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｕ⁃ｅｒｈ ｔｅａ
菌株编号
普洱茶内质感官品质评分
香气
（４０分）
滋味
（４０分）
汤色
（２０分）
叶底
（２０分）
对照 ２８ ２５ １２ １４
ＤＢ １６ ３１ ３３ １１ １４
ＧＪ ０２ ２６ ３６ １３ １３
ＸＷ １０ ３０ ２８ １４ １５
ＤＦ ０３ ２９ ３４ １９ １５
３　 结论
蛋白酶产生菌可明显增加液体茶汤中游离氨
基酸的含量，ＤＢ １６ 最为明显；果胶酶产生菌的接
入促使液体茶汤中水溶性果胶含量明显升高，其中
接种菌株 ＧＪ ０２的实验组较对照提升了近 ４倍；纤
维素酶产生菌可分解普洱茶中粗纤维，促进可溶性
糖及其他物质的溶出，其中 ＸＷ １０效果最佳；在茶
多酚降解菌株中，ＤＦ ０３ 的能力最强，茶多酚含量
下降了 １５％。 蛋白酶产生菌 ＤＢ １６ 明显提升了普
洱茶香气和滋味；果胶酶产生菌 ＧＪ ０２对普洱茶滋
味的提升较大；纤维素酶产生菌ＸＷ １０ 对普洱茶
整天感官特性都有所提升，但幅度不大；多酚氧化
酶产生菌 ＤＦ ０３对普洱茶滋味和汤色的提升较为
明显。 产酶微生物对普洱茶感官品质的提升，其实
质是微生物分泌的胞外酶与普洱茶营养物质之间
相互作用的结果。 因此，在普洱茶渥堆发酵过程
中，外源微生物或者酶的添加对提升普洱茶品质和
稳定性以及缩短发酵周期具有重要意义。
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（下转第 １０２页）
７９　 第 ２期 冯玲然等：普洱茶中功能性微生物的筛选及其对普洱茶感官品质的影响
图 ８　 ＥＣＢ提取液动态脱色曲线
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｄｅｃｏｌｒｉｚａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ Ｂ ｅｘｔｒａｃｔ
３　 结论
研究碱性阴离子交换树脂 ＷＤ ６ 对发酵棘白
菌素 Ｂ（ＥＣＢ）提取液的脱色效果。 当 ＷＤ ６ 树脂
添加量为 ４％（质量分数）、脱色温度为 ３０ ℃、摇床
转速为 １５０ ｒ ／ ｍｉｎ、脱色时间为 １００ ｍｉｎ 时，ＷＤ ６
树脂对 ＥＣＢ提取液的脱色率可达到 ８８􀆰 ３％以上，而
ＥＣＢ损失率仅为 ４􀆰 ８％。 说明 ＷＤ ６ 树脂能够较
好地吸附 ＥＣＢ提取液中的色素。 对 ＷＤ ６ 树脂吸
附 ＥＣＢ提取液中色素的吸附等温线的研究表明，该
吸附反应符合 Ｈｅｎｒｙ等温吸附模型。
参考文献：
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（责任编辑　 管　 珺）
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（上接第 ９７页）
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（责任编辑　 荀志金）
２０１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷