全 文 ：第 １４卷第 ２期
２０１６年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０２􀆰 ００５
收稿日期：２０１５－１２－０７
基金项目：陕西省自然科学基础研究计划（２０１４ＪＭ２０５７）
作者简介：杨兰兰（１９９０—），女，陕西榆林人，研究方向：微生物发酵；张小里（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｌｚｈａｎｇ＠ ｎｗｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
磷脂酶 Ｄ高产菌株的原生质体紫外诱变选育
杨兰兰，张小里，封娟娟，朱南南，赵彬侠
（西北大学 化工学院，陕西 西安 ７１００６９）
摘　 要：为了获得磷脂酶 Ｄ高产菌株，由链霉菌野生菌株 ＬＤ０５０１出发研究原生质体的制备和再生条件，建立原生
质体紫外诱变筛选方案。 采用酶解法制备原生质体，用紫外线对原生质体诱变，ＴＬＣ检测突变株产磷脂酶 Ｄ活力。
原生质体的适宜条件：种子培养基中甘氨酸质量浓度 ５ ｇ ／ Ｌ，菌龄 ７２ ｈ，用 ３ ｍｇ ／ ｍＬ 的溶菌酶在 ３０ ℃下酶解 ７５
ｍｉｎ。 通过原生质体诱变筛选，得到 １株高产菌株，磷脂酶 Ｄ水解活力达 ４􀆰 ２９ Ｕ ／ ｍＬ，提高幅度为 １８０􀆰 ４％。 该方法
有效改善了链霉菌野生菌株原生质体的制备效果，紫外诱变筛选显著提高了磷脂酶 Ｄ的活力，高产突变株具有较
好的稳定性。
关键词：磷脂酶 Ｄ；原生质体；紫外诱变；筛选
中图分类号：Ｑ９３　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０２－００２２－０５
Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｈｉｇｈ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＵＶ ｒａｄｉａｔｉｏｎ
ＹＡＮＧ Ｌａｎｌａｎ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｏｌｉ，ＦＥＮＧ Ｊｕａｎｊｕａｎ，ＺＨＵ Ｎａｎｎａｎ，ＺＨＡＯ Ｂｉｎｘｉａ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ′ａｎ ７１００６９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ａ ｈｉｇｈ⁃ｙｉｅｌｄｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ｓｔｒａｉｎ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ． ＬＤ０５０１，ｗｅ
ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｔｓ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ′ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄ ｉｔｓ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｂｙ
ＵＶ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｓ ｗｅｌｌ． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ＵＶ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ
ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＴＬＣ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ＬＤ０５０１ ｗａｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｍｙｃｅｌｉａ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ０􀆰 ５％ ｇｌｙｃｉｎｅ ａｎｄ
ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｏｒ ７２ ｈ􀆰 Ｔｈｅ ｍｙｃｅｌｉａ ｗｅｒｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｗｉｔｈ ３ ｍｇ ／ ｍＬ ｌｙｓｏｚｙｍｅ ａｔ ３０ ℃ ｆｏｒ ７５ ｍｉｎ． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ． ＬＤ０５０１ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＵＶ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ａ ｈｉｇｈ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｓｔｒａｉｎ，ｗｈｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ′ｓ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅａｃｈｅｄ ４􀆰 ２９ Ｕ ／ ｍＬ， ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ １８０􀆰 ４％ ｃｏｍｐａｒｅｄ
ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｔｒａｉｎ． Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ＬＤ
０５０１ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ｓｔｒａｉｎ′ ｓ ｖｉｔａｌｉｔｙ ｇｒｅａｔｌｙ ｂｙ ＵＶ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｇｈ⁃ｙｉｅｌｄｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｔｏ ｂｅ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｓｔａｂｌｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ；ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ；ＵＶ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
　 　 磷脂酶 Ｄ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ，ＰＬＤ）普遍存在于生
物界中，是重要的细胞磷脂代谢酶，通过磷酸二酯
键，催化水解卵磷脂（ＰＣ）产生磷脂酸（ＰＡ）和游离
胆碱。 ＰＬＤ亦能在醇类物质存在下催化磷脂酰基
转移反应制备（合成）磷脂或稀有磷脂［１－２］。 磷脂在
食品工业中起到乳化、湿润和分散作用，在医药中
是抗肿瘤药物制剂的重要辅料。 链霉菌属微生物
是常用磷脂酶 Ｄ 的生产菌株，但野生菌株酶活较
低（＜１􀆰 ５ Ｕ ／ ｍＬ），因此，通过筛选及改良获得高产
菌株是提高磷脂酶 Ｄ活力的重要途径。
目前，国外利用微生物发酵生产 ＰＬＤ 的研究报
道较多，研究者通过野生菌株筛选、基因重组等方法
筛选高产菌株，已经取得了一定的效果［３］。 与之相
比，国内研究磷脂酶 Ｄ菌株选育的报道较少，文献报
道的磷脂酶 Ｄ 高产菌株酶活为 ３～３􀆰 ５ Ｕ ／ ｍＬ［４］。 笔
者所在团队前期采用诱变剂处理孢子来选育磷脂酶
Ｄ高产菌株，取得了一定效果［５］，但变异株稳定性较
差，酶活力亦有待进一步提高。 由于去除细胞壁的原
生质体对诱变剂更加敏感，较易发生突变，目前利用
原生质体诱变技术选育竹红菌甲素［６］、β 葡萄糖苷
酶、木聚糖酶和柠檬酸［７］等高产菌株已有不少成功报
道，但还没有通过原生质体诱变选育 ＰＬＤ 优良菌株
的报道。 本文中，笔者研究产磷脂酶Ｄ链霉菌株的原
生质体制备和再生，进而对其进行紫外诱变，改良菌
株的产酶能力，以期筛选得到磷脂酶 Ｄ的高产菌株，
从而为磷脂酶 Ｄ的工业化发酵生产奠定基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 出发菌株
磷脂酶 Ｄ 产生菌 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ． ＬＤ０５０１，保藏
于笔者所在实验室。
１􀆰 ２　 培养基、溶液和试剂
ＰＤＡ培养基、发酵培养基、种子培养基配制参
照文献［５］；微量元素溶液、ＴＥＳ 缓冲液、Ｐ 溶液、再
生培养基配制参照文献［８］。 溶菌酶，生工生物工
程（上海）股份有限公司。
１􀆰 ３　 原生质体的制备与再生
１􀆰 ３􀆰 １　 单孢子悬浮液的制备
从斜面刮取成熟的孢子到 ９ ｍＬ 无菌生理盐水
的试管中，用玻璃珠将其打碎，三层滤纸过滤，无菌
生理盐水调整孢子密度 １０６ ～１０７个 ／ ｍＬ。
１􀆰 ３􀆰 ２　 原生质体的制备
用移液管移取 ０􀆰 ５ ｍＬ 的孢子悬浮液接种到含
有一定量甘氨酸的 ２０ ｍＬ 菌丝体培养液体中，２８
℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 摇瓶培养 ４８ ｈ，４ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０
ｍｉｎ，收集菌丝体，超声 ３０ ｍｉｎ，菌丝体振荡打碎，使
其便于溶解。 然后再用 ０􀆰 ３ ｍｏｌ ／ Ｌ 的蔗糖溶液洗 １
次，Ｐ 溶液复洗 ２ 次。 加入适量的溶菌酶，放入 ３０
℃的水浴锅中，每隔 ７ ～ ８ ｍｉｎ 拿出来轻轻摇晃一
下，６０ ｍｉｎ后，３ ５００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ 去除上层清
液，最后 ５００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ 保留上层清液，即得
到原生质体悬浮液。 用 Ｐ 缓冲液调整原生质体悬
浮液到合适的浓度，接种到再生培养基；用无菌蒸
馏水调整原生质体悬浮液到合适浓度，接种到 ＰＤＡ
培养基平板上，２８ ℃培养 ７ ｄ，计数菌落。
１􀆰 ４　 原生质体的计数方法
原生质体的计数按上述方法进行，再按式（１） ～
（２）计算原生质体的形成率与再生率。
原生质体形成率 ＝ （Ｃ － Ｂ） ／ Ｃ × １００％ （１）
原生质体再生率 ＝ （Ａ － Ｂ） ／ （Ｃ － Ｂ） × １００％
（２）
式中：Ａ 为原生质用 Ｐ 溶液稀释后涂布于再生平板
上存活的菌落数；Ｂ 为原生质体用无菌水稀释后涂
布于 ＰＤＡ 平板上存活的菌落数；Ｃ为酶解前菌丝体
涂布于 ＰＤＡ上长出的菌落数。
１􀆰 ５　 单孢子及原生质体紫外诱变选育
将制备好的单孢子和原生质体悬浮液各用无
菌移液管吸约 ４ ｍＬ，分别滴到含有大头针、直径为 ６
ｃｍ的培养皿中，置于 １５ Ｗ 紫外灯下距离 ３０ ｃｍ 处
均匀照射一定时间（０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０ 和 １５０
ｓ），然后把照射过的菌悬液稀释于无菌生理盐水中，
取合适浓度的 ０􀆰 １ ｍＬ 单孢子和原生质体诱变菌分
别滴到 ＰＤＡ培养基和再生培养基上并涂匀，每个浓
度涂 ３套平板。 将平板用黑塑料袋包严置于 ２８ ℃
恒温培养箱中培养 ３ ｄ，然后再正常培养 ３ ～ ７ ｄ 后
计菌落数，统计其致死率。
１􀆰 ６　 摇瓶初筛
挑选再生平板上生长饱满且水解圈较大的诱变
菌落 ６０株，每个菌落接种于 １００ ｍＬ 发酵培养基，２８
℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ条件下发酵 ７ ｄ，离心收集发酵液，对发
酵液进行酶活力测定，每样做 ３个平行，取均值。
１􀆰 ７　 分析方法
磷脂酶Ｄ水解活力测定采用 ＴＬＣ方法，参照文献
［５］，菌丝干质量是用 １０ ｍＬ 发酵液，离心收集沉淀，１１０
℃烘至恒质量，称量计算，每样做 ３个平行，取均值。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 原生质体的制备与再生
２􀆰 １􀆰 １　 甘氨酸浓度对原生质体形成量的影响
甘氨酸分子结构与 Ｄ 丙氨酸的结构相似，因此
３２　 第 ２期 杨兰兰等：磷脂酶 Ｄ高产菌株的原生质体紫外诱变选育
在菌丝体培养液中加入甘氨酸可代替 Ｄ 丙氨酸掺
入到细胞壁，干扰细胞壁肽聚糖之间的交联，引起新
合成的细胞壁的不完整，有利于提高溶菌酶对链霉菌
菌丝体细胞壁的敏感度。 然而，甘氨酸浓度过高不仅
会影响溶解菌丝体所需的数量，还会影响细胞壁的形
成，使得原生质体的再生细胞壁的条件受到一定程度
的阻碍。 为此，笔者在菌丝体培养基中分别加入不同
质量浓度的甘氨酸，测定原生质体的密度和菌丝体生
长情况，结果如表 １所示。
表 １　 甘氨酸添加量对原生质体形成的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ
ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
ρ（甘氨酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
原生质体密度 ／
（１０４个·ｍＬ－１）
ｍ（湿菌丝体） ／
ｇ
０ ０􀆰 ２０ ０􀆰 ２０
２􀆰 ５ ２􀆰 ６０ ０􀆰 １９
５􀆰 ０ ３􀆰 ８０ ０􀆰 １５
７􀆰 ５ ２􀆰 ８４ ０􀆰 １４
１０􀆰 ０ ２􀆰 ３６ ０􀆰 １３
１２􀆰 ５ ２􀆰 ３４ ０􀆰 １０
１５􀆰 ０ ２􀆰 １１ ０􀆰 ０９
　 注：菌丝体的湿质量以 ２０ ｍＬ发酵液中的菌体质量计。
图 １　 菌龄、溶菌酶浓度、酶解时间、酶解温度对原生质体形成率和再生率的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ａｇｅ，ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ，ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ｏｎ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
由表 １可知：在甘氨酸质量浓度低于 ５ ｇ ／ Ｌ 时，
原生质体的形成量随着甘氨酸质量浓度的增加不
断增加，但高于 ５ ｇ ／ Ｌ时，原生质体的形成量开始呈
现下降趋势。 甘氨酸浓度的持续增加，表现出对菌
丝体生长情况的抑制程度不断加强。 甘氨酸质量
浓度在 ５ ｇ ／ Ｌ时，原生质体的形成最佳。
２􀆰 １􀆰 ２　 菌龄、溶菌酶解浓度、酶解温度、酶解时间原
生质体形成率和再生率的影响
链霉菌原生质体是通过溶菌酶水解菌丝体细
胞壁形成的，不同的链霉菌种属性也不尽相同，还
有溶菌酶自身的性质也有差异，所以合适的菌龄和
溶菌酶浓度对原生质体的形成有至关重要的作用。
不同种龄的菌丝生理活性不同，对溶菌酶的敏感度
也有差异，一般处于对数生长期的菌体利于原生质
体的制备和再生。 研究了菌龄、溶菌酶浓度、酶解
温度、酶解时间原生质体形成率和再生率的影响，
结果如图 １所示。 由图 １（ａ）可以看出：菌龄为 ７２ ｈ
时，原生质体的形成率和再生率达到最高。 溶菌酶
浓度太低，水解缓慢，会影响原生质体的形成和再
生，但溶菌酶浓度过高，酶解时间过长，就会导致脱
壁现象太彻底，破坏了原生质体再细胞壁所需的引
物，虽然原生质体的形成率会不断增加，但严重影
响了原生质体的再生率。 由图 １（ｂ）和图 １（ｃ）可以
看出：溶菌酶浓度越大，酶解时间越长，原生质体形
４２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
成率越大。 兼顾原生质体形成率和再生率，溶菌酶
最佳质量浓度为 ３ ｍｇ ／ ｍＬ，最适酶解时间为 ７５ ｍｉｎ。
温度对酶的活性有很大影响，在一定范围内，温度
升高，溶菌酶活性越好，原生质体形成量也会增加，
但温度达到一定程度，会使溶菌酶的活性钝化，原
生质体的形成量也会减少。 由图 １（ｄ）可以看出酶
解温度为 ３０ ℃时，原生质体的形成率和再生率效果
最好，即 ３０ ℃为最佳酶解温度。
２􀆰 ２　 单孢子和原生质体的紫外剂量的确定
原生质体没有细胞壁的保护，应该能更敏感接
受紫外线的照射，但是实验结果表明，同一紫外诱
变下，原生质体较单孢子有更强的紫外线耐受能
力。 可能是由于原生质体悬于含有黏性很大的 Ｐ 缓
冲液中，原生质体聚集成团，所以致死需要更长的
诱变时间。 研究了单孢子和原生质体的紫外剂量，
结果如图 ２所示。
图 ２　 紫外线处理的诱变致死率
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｄｅａｔｈ ｒａｔｅ ｏｆ ＵＶ ｍｕｔａｔｉｏｎ
由图 ２ 可知：单孢子悬液和原生质体经紫外照
射后，随照射时间的增加，致死率上升；０ ～ ３０ ｓ 范围
内，曲线急剧上升，致死率变化显著，３０ ｓ以后，曲线
上升趋于平缓。 但原生质体较单孢子紫外线耐受
能力更强，单孢子随诱变剂量的增加，致死率上升
更迅速，单孢子在 ９０ ｓ 时，致死率为 １００％，而原生
质体在 １２０ ｓ为 １００％。 大量实验研究表明［９－１０］，致
死率为 ８０％左右的正突变率相对较高，因此，采用
４５ ｓ为最合适的诱变剂量。
２􀆰 ３　 初筛和摇瓶复筛
经过初筛得到 ６ 株高产突变株，接种于发酵培
养基进行摇瓶复筛，设置 ３ 个摇瓶平行实验，在 ２８
℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 条件下发酵 ７ ｄ，测定其产酶能力，结
果见图 ３。
由图 ３ 可知，经过初筛选出的 ６ 株高产菌株有
较高的酶活，其中编号 ３２号仍是酶活最高的突变菌
株，酶活力为 ４􀆰 ２９ Ｕ ／ ｍＬ。
图 ３　 突变株紫外诱变结果
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ
ｄｕｒｉｎｇ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
２􀆰 ４　 突变株的遗传稳定性测定结果
将编号 ３２突变株连续摇瓶传代 ５代，每代培养
时间为 ７ ｄ，测定每代的发酵液，结果见表 ２。 由表 ２
可知，该菌株传代 ５代后，其相对酶活力为原菌株的
９７􀆰 ２％，说明该菌株有稳定的遗传特征。
表 ２　 编号 ３２菌株的遗传稳定性
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ Ｎｏ􀆰 ３２ ｓｈｏｗｎ ｂｙ
ｃｈａｎｇｅｓ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
传代次数 酶活力 ／ （Ｕ·ｍＬ－１）
１ ４􀆰 ２９
２ ４􀆰 ２６
３ ４􀆰 ２４
４ ４􀆰 ２４
５ ４􀆰 １９
６ ４􀆰 １７
２􀆰 ５　 链霉菌 ＰＬＤ０５０１形态学特征
观察原生质体诱变后再生平板上的成熟菌落，
同时观察摇瓶发酵对数生长期时菌丝体的生长状
况，如表 ３所示。
表 ３　 出发菌株和高产菌株菌落的形态
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｔｒａｉｎ
ａｎｄ ｈｉｇｈ⁃ｙｉｅｌｄ ｓｔｒａｉｎ
类型
菌落特征
出发菌株 高产菌株
菌落形态 光滑规律的边缘 圆形，中间有更多褶皱
菌落大小 较小 较大
菌落颜色 表面呈白色，接近培养基处微黑 米黄色
菌落厚度 中间稍有突起，较薄 中间突起明显，较厚
菌丝生长情况 丰富、粗糙 松散、修长
５２　 第 ２期 杨兰兰等：磷脂酶 Ｄ高产菌株的原生质体紫外诱变选育
２􀆰 ６　 高产菌株磷脂酶 Ｄ的发酵特性
突变菌株和出发菌株随时间变化的发酵性能
如图 ４所示。 由图 ４可知：链霉菌在发酵的进程中，
基本在对数生长期才开始有磷脂酶 Ｄ 出现，在稳定
期（第 ６天）时，磷脂酶 Ｄ 的水解活力达到最高，突
变菌株的磷脂酶 Ｄ水解活力（４􀆰 ２９ Ｕ ／ ｍＬ）大约是出
发菌株水解活力（１􀆰 ５３ Ｕ ／ ｍＬ）的 ３倍，除此之外，突
变菌株磷脂酶 Ｄ 水解活力的增长速率 （ ０􀆰 ０８６
Ｕ ／ （ｍＬ·ｈ））（在对数期初期，第 ３天）是出发菌株的
（０􀆰 ０３５ Ｕ ／ （ｍＬ·ｈ））２􀆰 ５ 倍。 但在稳定期之后磷脂
酶 Ｄ水解活力有下降的趋势，可能是由于发酵液的
酸碱度对酶蛋白质活性的影响。
图 ４　 突变菌株及出发菌株磷脂酶 Ｄ水解活力、
干菌体质量随时间变化关系
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ
ａｎｄ ｄｒｙ ｃｅｌｌ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ
ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｔｒａｉｎ
在磷脂酶 Ｄ发酵过程中，突变菌株较出发菌株
的代谢速度快，由图 ４ 可知，在前 ２ 天，突变菌株菌
丝干质量的增加比出发菌株稍快，但在对数生长初
期（第 ３ 天），突变菌株的菌丝干质量的增加速率
（０􀆰 ０１８ ｇ ／ ｈ）是出发菌株 ０􀆰 ００８ ｇ ／ ｈ）２􀆰 ２５ 倍，３～６ ｄ
是链霉菌的对数生长期，链霉菌菌丝干质量在前 ６ ｄ
迅速积累，达到最大，突变菌株（０􀆰 ８３５ ｇ）是出发菌
株（０􀆰 ５７４ ｇ）的 １􀆰 ４５倍。 生长至 ６ ｄ 以后是稳定期
和衰亡期，并且菌丝体生长基本处于停滞状态。
３　 结论
原生质体的制备的影响因素很多，本文选取了链
霉菌原生质体的制备和再生过程中几个主要的影响
因素：甘氨酸浓度、菌龄、酶解温度、酶解时间、溶菌酶
浓度进行研究，发现甘氨酸浓度 ５ ｇ ／ Ｌ，菌龄为 ７２ ｈ，
酶解温度３０ ℃，酶解７５ ｍｉｎ，溶菌酶质量浓度３ ｍｇ ／ ｍＬ
时，原生质体的形成率和再生率都比较合适，因此，以
此条件为基础进行后续原生质体的紫外诱变。
原生质体没有细胞壁的保护较单孢子悬液，对
紫外线更敏感，能较好的改变菌株的遗传性能。 本
文中，笔者利用原生质体紫外诱变选育技术，得到
一株磷脂酶 Ｄ的水解活力为 ４􀆰 ２９ Ｕ ／ ｍＬ高产菌株，
（较出发菌株（１􀆰 ５３ Ｕ ／ ｍＬ）提高大约 ３倍）。
原生质体诱变技术大大提升了磷脂酶 Ｄ 的水
解活力，但诱变后菌株遗传性状的改变是随机性
的，同时液体发酵筛选高产菌工作量很大，周期很
长。 为了进一步提高该菌的生产经济效益，今后的
研究中可以通过基因重组改良菌株的代谢途径，加
快生长速度，也可以构建高通量筛选方法缩短优良
菌株产磷脂酶 Ｄ的发酵周期。
参考文献：
［ １ ］ 　 ＬＩＵ Ｙ，ＺＨＡＮＧ Ｔ，ＱＩＡＯ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ⁃ｙｉｅｌｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｖｉａ ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ｆｒｏｍ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ ｏｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ
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［ ２ ］ 　 ＨＡＴＡＮＡＫＡ Ｔ， ＮＥＧＩＳＨＩ Ｔ， ＫＵＢＯＴＡ⁃ＡＫＩＺＡＷＡ Ｍ， ｅｔ ａｌ．
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ
ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｅｐｔａｔｕｓ ＴＨ⁃２ ［ Ｊ］ ． Ｅｎｚｙｍｅ
Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２００２，３１（３）：２３３⁃２４１．
［ ３ ］ 　 Ｓｉｍｋｈａｄａ Ｊ Ｒ， Ｃｈｏ Ｓ Ｓ， Ｌｅｅ Ｈ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ ｄ（ ＰＬＤ５７） ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ． ＣＳ⁃５７ ［ Ｊ］ ． Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍａ Ｒｅｓ， ２００７，３０ （ １０）：
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［ ４ ］ 　 梁丽敏，刘春凤，杜阳吉．产磷脂酶 Ｄ 链霉菌发酵条件优化
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［ ５ ］ 　 刘嫒媛，张小里，姚娜，等．磷脂酶 Ｄ 的紫外诱变选育及发酵
条件的优化［Ｊ］ ．化工进展，２０１２，３１（９）：２０３６⁃２０３８．
［ ６ ］ 　 潘魏松，嵇源源，杨珠英，等．原生质体紫外诱变选育竹红菌
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［ ７ ］ 　 徐凯，张伟国．原生质体融合选育耐高温柠檬酸生产菌［ Ｊ］ ．生
物加工过程，２０１５，１３（５）：２６⁃３０．
［ ８ ］ 　 诸葛健，王正详．工业微生物实验技术手册［Ｍ］．北京：中国轻
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［ ９ ］ 　 段向东，贾啸静，陈丽华，等．原生质体紫外诱变选育达托霉
素高产菌株［Ｊ］ ．化学与生物工程，２０１４，３１（５）：５１⁃６２．
［１０］ 　 胡艳丽，钟添华，产竹华，等．原生质体紫外诱变选育可利用
廉价碳源的高产油新菌株［ Ｊ］ ．微生物学通报，２０１４，４１（５）：
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（责任编辑　 荀志金）
６２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷