全 文 ：第24卷 第1期
2012年1月
Vol. 24, No. 1
Jan., 2012
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2012)01-0089-06
碳纳米管作为siRNA转运载体的研究进展
刘　亮1，胡道德1*，陈文娟1，任吉存2
(1 上海交通大学附属第一人民医院，上海 200080；2 上海交通大学化学化工学院，上海 200240 )
摘　要：随着人们对 RNA干扰分子机理的研究愈加深入，siRNA作为一种新的基因治疗药物极有可能为
人类攻克癌症等难以治愈的疾病带来希望。然而，目前在 RNA干扰应用中遇到的最大挑战就是如何有效
地将 siRNA导入靶细胞且不致引起严重的细胞毒性。碳纳米管在药物传递和基因传递等生物医学领域的潜
在应用受到广泛关注；但要实现碳纳米管在基因治疗领域的应用，碳纳米管的功能化是关键，也是近几年
来研究的重点。综述近年来碳纳米管作为 siRNA转运载体在基因治疗领域的研究进展。
关键词：碳纳米管；siRNA；RNA干扰；基因治疗
中图分类号：R318.08； R730.59；TB383 文献标志码：A
Recent advances in the study of the carbon nanotubes
for small interfering RNA delivery
LIU Liang1, HU Dao-De1*, CHEN Wen-Juan1, REN Ji-Cun2
(1 Department of Clinical Pharmacology, Shanghai First People’s Hospital, Medical College, Shanghai Jiao Tong
University, Shanghai 200080, China; 2 College of Chemistry and Chemical Engineering, Shanghai Jiao Tong
University, Shanghai 200240, China)
Abstract: With increasing knowledge on the molecular mechanisms of endogenous RNA interference, small
interfering RNAs (siRNAs), as innovative nucleic acid medicines, bring great hopes to cure some incurable diseases
such as cancers. However, the main issue in RNA interference is to deliver siRNAs into the targeted cells without
eliciting toxicity. Carbon nanotubes are expected to solve the aforementioned issue in the field of gene therapy
especially in the application of RNA interference, which may be a revolutionary advancement in the area of
biomedicine. However, the lack of surface functional groups greatly limits its application. So functionalization is
needed. In recent years, much progress has been made in this area. In this review, we summarize the recent
development of carbon nanotubes for small interfering RNA delivery in the area of gene therapy.
Key words: carbon nanotubes; small interfering RNA; RNA interference; gene therapy
收稿日期：2011-08-06； 修回日期：2011-09-21
基金项目：上海市科委纳米技术专项基金 ( 1 0 5 2
nm04000)
*通信作者：E-mail：shanghaiyao@sina.com
RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由
双链 RNA诱发的、同源 mRNA高效特异性降解
的现象。目前的研究已经初步阐明了 RNA干扰的
作用机制。首先，双链 RNA进入胞浆后在 Dicer
酶的作用下加工裂解成 21~23个核苷酸的双链小
片段干扰 RNA (small interfering RNA，siRNA)。然
后 siRNA与 RNA 诱导的沉默复合体 (RNA induced
silencing complex , RISC)结合形成 RISC/siRNA复
合物。在这个过程中或之后，解链酶在 ATP供能的
情况下将 siRNA解链，有义链从复合物中离开被降
解。随后，siRNA的反义链引导 RISC与 mRNA分
子互补结合，并降解 mRNA，最终导致特定基因表
达的抑制 [1-2]。
虽然 siRNA可由进入胞浆后的双链 RNA裂解
而得到，但人工合成的 siRNA进入细胞后同样也可
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以发挥 RNA干扰效应。将特定序列的 siRNA导入
哺乳动物细胞可以特异性剔除或关闭特定基因的表
达，并能达到长期抑制靶基因的效果 [3]。目前 RNA
干扰技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病
及恶性肿瘤的基因治疗领域；但 siRNA存在着体内
稳定性差、难以穿过脂双层构筑的细胞膜等问题 [4]。
因此，设计合理的运载 siRNA进入胞浆的载药系统
便成为当今国内外研究的热点。
Juliano等 [5]总结了目前 siRNA在 RNA干扰
应用中所面临的困难。首先，siRNA在机体生理环
境下容易被核酸酶降解。与 DNA不同，RNA核糖 2
位置存在羟基而非稳定的氢原子，RNA更容易被
核酸酶破坏分子结构而失活。其次，siRNA分子
相对较小，在发挥生理作用之前容易经肾脏快速
排泄掉。最后，siRNA难以穿透细胞膜进入胞浆，
即使被吞噬也难以从内颗粒中释放出来。病毒、阳
离子脂质体等是一些常用的转运 siRNA进入胞浆的
载体，但是在基因治疗和 RNA干扰应用中仍然存
在着一定的不足，例如病毒载体具有转染效率高的
优点，但可能引发细胞发生突变及免疫反应 [6]；脂
质体对原代细胞、免疫细胞转染效率低 [7]；采用化
学基团对 siRNA修饰的方法降低了 RNA干扰效应
等 [8]。作为一种优异的纳米材料，碳纳米管在药物
传递和基因传递等生物医学领域的应用受到广泛关
注 [9]。
1　碳纳米管的特点及应用
碳纳米管属于碳同素异形体的富勒烯家族，是
由一系列碳原子经 sp2 杂化形成的同轴中空管状结
构。碳纳米管按石墨烯片的层数可分为：单壁碳纳
米管 (single-walled nanotubes, SWNTs)和多壁碳纳
米管 (multi-walled nanotubes, MWNTs)。SWNTs 由
单层六棱形碳环结构卷曲而成，直径为 0.4~2 nm，
而MWNTs由数层到数十层不等同心卷曲的石墨片
构成，直径为 2~100 nm[9]。碳纳米管具有奇异的物
理化学性能，如独特的金属或半导体导电性 [10-11]、
极高的机械强度 [12]和导热能力 [13]以及较强的微波
吸收能力 [14]等，一经发现即受到物理、化学和材
料科学界以及高新技术产业部门的极大重视。
近年来，碳纳米管在医学、分子生物学等领
域的研究也日益增多 [15-17]，表现出了独特的优势。
首先，碳纳米管与配体 (生物大分子、有机小分子、
表面活性剂等 )的连结简单易行。碳纳米管的原
子都位于表面，具有非常大的比表面积 (理论上
SWNTs比表面积可以达到 1 300 m2/g)，使得碳纳
米管与配体的作用更加充分。碳纳米管管壁存在高
度离域化的大 π键，因此具有共轭 π键的分子更容
易与其外壁形成 π-π非共价键结合 [18]；碳纳米管具
有柔性的一维纳米结构，可以弯曲增加对配体的亲
和力 [17]。其次，碳纳米管具有非凡的进入细胞的能
力，即使是对于原代细胞、免疫细胞甚至病毒。再次，
碳纳米管具有较强且稳定的拉曼光谱信号以及在近
红外光区能产生较强的荧光信号的性质，因此可以
通过监测碳纳米管的拉曼光谱和荧光信号，追踪被
碳纳米管携带的药物的体内代谢过程 [9]。
2　碳纳米管的功能化及复合siRNA
虽然碳纳米管在医学、分子生物学等领域的应
用有着巨大优势，但碳纳米管在绝大多数溶剂中的
分散性不好、细胞毒性较高，而且表面缺少官能团
大大限制了它的应用。因此，必须首先对碳纳米管
进行改性与化学基团连接，即碳纳米管的功能化 [9,19]。
碳纳米管的功能化不仅可以提高碳纳米管的分散
性、降低细胞毒性，而且是碳纳米管与 siRNA相互
作用组装碳纳米管 /siRNA复合物的关键。功能化
的碳纳米管应满足以下条件：具有高生物相容性、
可降解性、低细胞毒性；具有较高的运载 siRNA进
入靶细胞的能力，并能保护 siRNA免受核酶的降解；
运载 siRNA进入细胞后应较容易释放游离 siRNA，
从而使 siRNA与内生的 RISC作用，发挥 RNA干
扰效应；全身用药时应具有一定的组织靶向性，避
免被肝肾等器官快速清除 [5,20]。
共价功能化和非共价功能化是制备功能化碳纳
米管的两种常用方法 [19]。共价功能化主要是通过酸
处理后在碳纳米管端口与缺陷位置引入羧酸基团，
再通过其他化学反应在碳纳米管表面接上其他所需
基团，典型的方法有 1,3-偶极环加成反应、酰胺化
反应、酯化反应等。非共价功能化主要是利用表面
活性剂或聚合物等分子的疏水部分与碳纳米管的疏
水管壁相互作用进行复合，而表面活性剂或聚合物
的亲水部分与溶剂作用，阻止碳纳米管的团聚，使
其稳定分散于溶剂中。
功能化后的碳纳米管与 siRNA形成复合物主要
通过两种途径：非共价吸附和共价结合。下面将根
据碳纳米管复合 siRNA方式的不同对此分类介绍。
2.1　非共价吸附
非共价吸附是制备碳纳米管 /siRNA复合物的
常用方法，研究也最为广泛。静电作用、范德华力、
刘　亮，等：碳纳米管作为siRNA转运载体的研究进展第1期 91
疏水相互作用都可以促使核酸缠绕或吸附于碳纳米
管表面。
2.1.1　静电吸附
由于 siRNA有负电性，带有正电的碳纳米管
就能够通过静电作用吸附 siRNA。目前文献报道的
使碳纳米管带正电的方法主要是在碳纳米管上引入
氨基基团。一方面，氨基容易被质子化而带正电荷；
另一方面，氨基作为一种极性基团的引入，可以提
高碳纳米管在溶剂中的分散性。
Zhang等 [21]对 SWNTs用氨基基团修饰，制得
SWNTs-CONH-(CH2)6NH3
+，然后将其通过静电相
互作用吸附复合 siRNA以下调癌基因 mTERT的表
达。SWNTs/siRNA复合物通过抑制癌基因 mTERT
的表达对三种小鼠癌细胞株的生长都起到了抑制作
用，并且将复合物注入荷瘤小鼠后，不仅肿瘤的生
长受到抑制，而且肿瘤的重量也显著降低。Yang
等 [22]用同样方法对 SWNTs进行处理，将 SWNTs
氨基化后与 SOCS1 siRNA复合进行肿瘤免疫治疗。
将 SWNTs/siRNA复合物静脉注入荷瘤小鼠瘤内后，
复合物可优先被树突状细胞、巨噬细胞等摄取而沉
默细胞中的 SOCS1基因，激发机体的免疫系统，
从而控制和杀伤肿瘤细胞。Wang等 [23]也对 SWNTs
进行氨基化修饰，制得 SWNTs-CONH (CH2)12CH3，
然后将其在室温下与 Cyclin A2 siRNA孵育，成功
转染人慢性髓系白血病细胞 K562，并有效下调了
癌基因的表达。Podesta等 [24]通过 1,3-偶极环加成
反应对MWNTs氨基化处理并复合 siTOX siRNA以
下调癌基因的表达，他们用人肺癌细胞 Calu 6制备
荷瘤小鼠模型，实验组瘤内注射MWNTs/siRNA复
合物，对照组瘤内注射脂质体 DOTAP/siRNA复合
物，发现实验组小鼠的肿瘤生长得到有效抑制，且
小鼠存活期得到明显延长。这也是首次在体内实验
中把碳纳米管与阳离子脂质体两种转运 siRNA载体
的转运效率进行对比，并发现碳纳米管 /siRNA复
合物在延长荷瘤小鼠的生存期方面较脂质体 /siRNA
复合物更有效。他们认为这可能与碳纳米管携带
siRNA采取了更温和的方式进入肿瘤细胞有关。以
上这些研究都是用带有氨基的单链烷基链共价修饰
碳纳米管，这些探索试验证明，碳纳米管加上氨基
基团通过静电吸附作用复合 siRNA是可行的。
基于 Podesta等 [24]成功对MWNTs进行氨基化
修饰，并取得了理想的体内试验结果，Herrero等 [25]
设想如果继续增加MWNTs上氨基数目，是否可以
增强功能化的碳纳米管运载 siRNA的效率，为此他
们构建了树枝状大分子修饰的MWNTs作为 siRNA
的转运载体，即首先把聚乙二胺树枝状聚合物共价
连接于MWNTs上，得到第一代树枝状聚合物修饰
的MWNTs (G1)。聚乙二胺树枝状聚合物存在较多
氨基基团，可以增加MWNTs在水中的分散性。然
后，他们继续提高聚合物上氨基数目得到第二代树
枝状聚合物修饰的MWNTs (G2)。研究发现与带有
氨基的单链烷基链修饰的MWNTs相比，树枝状聚
合物修饰的MWNTs复合 siRNA进入 HeLa细胞发
挥 RNA干扰效应的能力更强，并且 G2转运 siNRA
的能力强于G1。这说明提高碳纳米管上氨基的数目，
可以提高碳纳米管运载 siRNA的效率。这也提示我
们选用合适的带有氨基基团的聚合物对碳纳米管修
饰，对于提高 RNA干扰效应是很有前途的应用。
聚乙烯亚胺 (polyethylenimine, PEI)是一种新
型阳离子多聚物基因载体，具有较强的核酸结合能
力、细胞黏合能力和缓冲能力，因其“质子海绵”
效应，无需溶酶体溶解肽的辅助作用，即可将内吞
的核酸释放到细胞质中 [26-27]。Foillard等 [28]构建了
PEI (Mr = 600)共价修饰的碳纳米管以复合 siRNA
并转染人脑胶质瘤细胞 U87luc，发现可以沉默靶基
因的表达，沉默效率与脂质体相当，且远高于单独
使用 PEI。而 Varkouhi等 [29]同样采用 PEI (Mr 2.5 ×
104)修饰的碳纳米管复合 siRNA，并转染人肺癌细
胞 H1299，发现碳纳米管 /siRNA复合物只能达到
20%的靶基因沉默效率，而单独使用 PEI可以达到
20%~30%，且细胞活性试验发现 PEI修饰的碳纳米
管的毒性较高，也就是说 PEI对碳纳米管的修饰对
于提高 RNA干扰效应并没有起到积极作用。相似
的方法得出相反的结论可能与使用不同相对分子质
量的 PEI有关，因为低相对分子质量的 PEI毒性较
低 [30]。另外转染细胞的不同也难以将两者进行简单
比较。但是，这也提示我们在用 PEI对碳纳米管修
饰时选择适合的 PEI，对改性后的碳纳米管的运载
能力和细胞毒性或许有重要影响。
值得一提的是McCarroll等 [31]合成了一种由赖
氨酸和脂类聚合的树枝状大分子材料 TOL7，构建
了 TOL7修饰的 SWNTs。一方面，TOL7含有脂链
可以通过疏水作用缠绕在碳纳米管侧壁上，而且脂
链的缠绕提高了碳纳米管对细胞膜脂质双层的亲
和性；另一方面，TOL7亲水端带正电的赖氨酸可
以吸附带负电的 siRNA，并提高碳纳米管的水分散
性。体外细胞试验证明，TOL7可以复合 Apo B
siRNA，并能携带其进入小鼠肝细胞 FL83B沉默靶
生命科学 第24卷92
基因的表达，沉默效率与脂质体相当，而且细胞活
性试验发现 TOL7修饰的碳纳米管细胞毒性低。将
TOL7修饰的碳纳米管与 siRNA复合后经尾静脉注
入小鼠体内，发现当用药量为 0.96 mg/kg时，即可
下调肝脏中靶基因的表达。研究也发现功能化的碳
纳米管细胞毒性小，且没有引起机体明显的免疫反
应。这是首次用脂质和氨基酸的聚合物对碳纳米管
进行修饰，并且取得了理想的治疗效果。
2.1.2　疏水作用力吸附
siRNA的碱基可以通过疏水作用力吸附于碳
纳米管上，而亲水的核糖和磷酸基团向外朝向水中，
因此在这种复合方式中，siRNA对于碳纳米管既是
修饰基团，又是被转运者 [19,32]。Bartholomeusz等 [32]
采用这种方式复合 siRNA，直接将碳纳米管与
siRNA进行简单的超声混合后制得碳纳米管 /siRNA
复合物，4℃条件下保存 30 d后复合物在水中仍均
匀分散，且维持 siRNA的生理活性。通过给荷人胰
腺癌小鼠注射碳纳米管 /HIF-1α siRNA复合物，可
以有效地干扰癌基因的表达并抑制小鼠肿瘤的生
长。Ladeira等 [33]用羧基化的碳纳米管复合 InsP3R-
Ⅱ siRNA，转染相较于肿瘤细胞更难转染的心肌细
胞，可以达到 96%的基因沉默效率，而这对于常
规的转染试剂如脂质体是难以达到的。给碳纳米管
加入羧基基团有三个作用：减少细胞毒性，增强复
合后 siRNA的稳定性，提高对 siRNA的转载能力。
与其他功能化修饰使碳纳米管带正电荷而通过静电
吸附作用复合 siRNA的方式相比，羧基化修饰的碳
纳米管转染效率可能更高，这可能与其携带 siRNA
进入细胞后更容易释放游离的 siRNA有关。
2.2　共价结合
共价结合是 siRNA分子通过共价键连接于碳
纳米管两端或是碳纳米管表面的修饰基团上。Kam
等 [34]构建了一种基于 SWNTs的 siRNA运载系统。
他们对 SWNTs用末端带有氨基的聚乙烯二醇化的
磷脂分子 (PL-PEG-NH2)修饰。PL-PEG-NH2通过
范德华力和疏水作用力将 PL上的疏水性烷基链吸
附于 SWNTs侧壁上，而亲水性的 PEG外伸向水中
以提高 SWNTs的水溶性，末端氨基则通过二硫键
与硫醇基修饰的 siRNA连接。这种方法构建的复合
物被靶细胞吞噬进入内涵体或溶酶体后，二硫键被
破坏，释放出游离的 siRNA，转染 HeLa细胞发现
这种复合 siRNA的方式具有较高的靶基因沉默效
率，且基因沉默效率高于使用脂质体作为转染试剂。
Liu等 [7] 采用同样方法复合 CD4 siRNA、CXCR4
siRNA并转染常规方法难以转染的 T细胞和人外周
血单核细胞，研究发现其基因沉默效率远高于使用
脂质体。这种高运载效率与碳纳米管具有较高的比
表面积可以复合大量的 siRNA并高效运载其进入细
胞，以及进入内涵体或溶酶体后，二硫键被破坏后
可较易释放出游离 siRNA有关。针对 T细胞和
MAGI细胞的细胞增殖试验以及细胞毒性试验也发
现这种功能化碳纳米管的方法对细胞正常增殖影响
小、细胞毒性低，而脂质体 lipofectamine2000在高
浓度时对MAGI细胞有轻微毒性 [35]。
3　碳纳米管的毒性
近年来，随着碳纳米管在生物医学领域的研
究愈加深入，其生物安全性也逐渐受到人们的重
视。在体外细胞试验中，研究发现碳纳米管对多
种细胞都有细胞毒性，比如：Shvedova等 [36]发现
SWNTs可致人角蛋白细胞内自由基增加，过氧化
物聚集；Monteiro-Riviere 等 [37]发现 MWNTs可致
人角蛋白细胞内促炎细胞因子白介素 -8表达增加；
Bottini等 [38]发现 MWNTs在高浓度下可显著降低
细胞活性并导致凋亡；Cui 等 [39]发现 SWNTs可以
刺激 HEK293细胞，下调与细胞黏附功能相关的基
因和蛋白，导致细胞黏附能力降低。同时，SWNTs
可上调与细胞凋亡相关的基因 P16、Rb、P53，并
使细胞停滞于 G1期，最终导致细胞凋亡等。动物
试验中也观察到碳纳米管的毒性作用，如给小鼠气
管内注入碳纳米管可致上皮样肉芽肿、间质性炎症
以及致纤维化 [40-41]等。但目前人们对碳纳米管的毒
性研究结果不尽一致且存在广泛争议 [9,19]。一方面
碳纳米管本身，如碳纳米管的种类、所含杂质、碳
纳米管的长度等不同；另一方面功能化碳纳米管
方式、功能化程度不同。此外，对于碳纳米管细
胞毒性的研究尚缺少完备精确的评价标准。比如，
碳纳米管的细胞水平和体内水平的毒性评价中使
用的细胞株不同、受试动物的类型种别不同也是
毒理性研究结果多样性的重要因素。尽管如此，
目前研究倾向于认为提高碳纳米管在水中的分散
性、稳定性可以降低碳纳米管的细胞毒性，提高
其生物相容性 [7,42-46]。因此，碳纳米管的功能化方
式便显得更为重要。
4　结语
RNA干扰作为一种新的基因治疗方法近年来
获得迅速发展，在很大程度上是因为其作为细胞内
刘　亮，等：碳纳米管作为siRNA转运载体的研究进展第1期 93
源性基因表达调节物质的低毒性和特异性。由于碳
纳米管具有极大的比表面积、狭长的管状结构等特
性，有望开发出基于碳纳米管的基因治疗载体，解
决目前在基因治疗领域尤其是 RNA干扰应用中的
难题。要实现碳纳米管在基因治疗领域的应用，碳
纳米管的功能化是关键。
近年来人们已开发出多种功能化碳纳米管方法
复合 siRNA，并实现了靶基因的沉默，但是碳纳米
管作为 siRNA载体的研究目前多停留在细胞试验或
动物试验阶段，离临床应用仍有很大距离。开发一
种运载效率高、细胞毒性低的功能化碳纳米管的方
法仍将是一件具有挑战性的工作。相信通过研究人
员的不懈努力，一定会逐步解决碳纳米管在基因治
疗领域应用中遇到的难题。
[参　考　文　献]
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