全 文 ：第24卷 第1期
2012年1月
Vol. 24, No. 1
Jan., 2012
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2012)01-0025-07
人源性激肽释放酶结合蛋白与内皮细胞功能
邢永梅，刁　勇*
(华侨大学分子药物学研究所，泉州 362021)
摘　要：人源性激肽释放酶结合蛋白 (Kallistatin，Kal)是一种负性急性期内源性蛋白，与多种内皮相关性
生理和病理过程密切相关，如血管生成及损伤修复、炎症、心功能不全、肾损伤、糖尿病等。炎症和氧化
应激可引起内皮功能障碍，而 Kal可抑制肿瘤坏死因子 α引起的内皮细胞活化，通过 KLF4-eNOS、PI3K-
AKT-eNOS和 AKT-FOXO1等信号通路，增加内皮细胞 NO合酶的表达和 NO生成，抑制内皮细胞损伤和
凋亡。动物实验显示，Kal表达增加可减弱氧化应激诱导的细胞凋亡和器官损伤。基于内皮细胞所处的状
态或来源，如健康或损伤情况，成熟内皮细胞或内皮祖细胞，Kal的作用可能有所区别。内皮细胞是参与
肿瘤生长与转移的关键因素已达成共识，但肿瘤新生血管形成的机制尚待确认。Kal可诱导肿瘤内皮细胞
凋亡，抑制肿瘤新生血管生成和肿瘤生长的能力已被证实。临床前研究结果表明，Kal具有多种药理作用，
对氧化应激相关性疾病，特别是肿瘤治疗具有应用前景，但其药理作用的分子机制仍需深入探讨。
关键词：人源性激肽释放酶结合蛋白；氧化应激；内皮细胞；肿瘤
中图分类号：Q513；R730.59；R979.1 文献标志码：A
Kallistatin and endothelial cell activity
XING Yong-Mei, DIAO Yong*
(Institute of Molecular Medicine, Huaqiao University, Quanzhou 362021, China)
Abstract: Kallistatin (Kal) is a negative acute phase endogenous protein which is closely related with a variety of
endothelium associated physiological and pathological processes, such as angiogenesis, blood vessel injury
recovery, heart failure, kidney damage, diabetes and so on. Kal increases endothelial NO synthase expression and
NO production, inhibits endothelial cell apoptosis and organ damage caused by inflammation and oxidative stress,
through activation of KLF4-eNOS, PI3K-AKT-eNOS and AKT-FOXO1 signaling pathways, and prevens TNF-α
mediated endothelial activation. Animal experiments showed increased Kal expression in vivo can reduce oxidative
stress-induced cell apoptosis and organ damage. Kal may play different roles with different kinds of endothelial
cells, depending on their phenotypes and conditions, such as mature or progenitor cells, healthy or diseased. It is
established that tumor growth and metastasis are regulated in part by endothelial cells within the tumor
microenvironment, and yet, the exact mechanisms of neovascularization in tumor are less well understood.
Numerous studies demonstrated that Kal can inhibit tumor angiogenesis, growth and metastasis effectively.
Although the preclinical results suggest that Kal has pleiotropic pharmacological effects and represents a promising
strategy for the treatment of oxidative stress related diseases, especially cancer, detailed molecular mechanism still
needs to be explored before clinic application.
Key words: kallistatin; oxidative stress; endothelial cell; tumor
收稿日期：2011-08-04； 修回日期：2011-08-23
基金项目：国家自然科学基金项目(30973591); 江苏省科技重点项目(BC2009029); 福建省生物医药工程研究生教育创新
基地资助项目(06070205)
*通信作者：E-mail: diaoyong@hqu.edu.cn; Tel: 0595-22692516
生命科学 第24卷26
Kallistatin(Kal)是一种人源性激肽释放酶结合
蛋白 [1]，具有独特的丝氨酸蛋白酶抑制剂 (serpin)
活性 [1-2]，后来发现其参与高血压 [3-4]、心肌梗死 [5-6]、
炎症 [7]、血管生成 [8-9]、肿瘤 [9-16]、纤维化 [17-18]等多
种疾病的发生和发展过程，是一个极具临床应用前
景的蛋白类药物。有关 Kal的研究提示，Kal相关
性疾病均与内皮功能障碍有关。近期研究表明，内
皮细胞不仅仅是构成输送营养和代谢产物管道的内
衬细胞，还形成一种血管生态位 (vascular niche)，
在不同条件下，通过调节各种血管分泌因子(angiocrine
factor)的生成，指导周边组织的生长和损伤修复功
能 [19]。在正常条件下，体内大部分内皮细胞处于静
息状态，所产生的血管分泌因子可维持体内动态平
衡。但在缺氧、炎症等应激压力下，内皮细胞内特
定血管分泌因子表达上调，促进新生血管形成和组
织修复，甚至募集内皮祖细胞 (endothelial progenitor
cells，EPC)的参与。血管内皮细胞所处的独特位置
使其成为针对各种伤害的屏障，而内皮细胞功能损
伤会严重干扰内皮细胞单层的完整性，并启动各种
疾病事件。所以，深入研究 Kal对内皮细胞功能影
响的特点及作用机制，有助于为炎症、感染、心血
管和肿瘤等重大疾病的防治提供新手段。
1　Kal与内皮细胞氧化应激
氧化应激是活性氧物质 (ROS)增加和抗氧化能
力下降引起的氧化还原失衡状态 ,可引起高血压、
动脉粥样硬化、心肌肥厚、心脏衰竭、肾脏损伤、
糖尿病等 [1,20-22]。Kal作为一种抗氧化物质，在维持
体内氧化还原平衡，防止氧化应激引起的内皮细胞
和组织损伤中发挥着重要作用，如长期高盐饮食诱
导大鼠肾脏和血管 NAD(P)H氧化酶活性升高，NO
生成减少，继而发生高血压和肾功能损伤 [23-24]，而
Kal基因治疗则减少了氧化应激引起的大鼠炎症、
肾功能损伤和纤维化 [18]。在心肌缺血再灌注损伤和
慢性心肌梗死动物模型 [5-6]，Kal基因表达也可减轻
氧化应激引起的细胞凋亡、炎症和器官损伤。过表
达 Kal的转基因小鼠耐受内毒素休克的能力大大增
强，死亡率显著降低 [7]。在由胶原蛋白诱导的大鼠
关节炎模型，人 Kal在关节局部表达，可以显著降
低关节肿胀和炎症细胞因子水平 [8]。
1.1　氧化应激抑制Kal的表达
已知氧化应激造成血管内皮功能障碍，导致血
管损伤和炎症，引起高血压、动脉粥样硬化、心肌
肥厚、心脏衰竭、肾脏损伤、糖尿病等多种疾病 [20-22]。
多项动物实验显示氧化应激可抑制 Kal的体内表
达 [4-6,18]，临床研究也发现脓毒症和急性坏死性胰腺
炎患者血液内 Kal浓度显著下降 [25-26]，说明血液
Kal水平与氧化应激呈负相关关系，可作为氧化应
激相关性疾病的生物标志。
近期研究表明，叉头框转录因子 1(forkhead box
O 1, FOXO1)是 Kal表达的负调控因子 [27]。FOXO
通过调节一系列特定的靶基因表达，参与细胞分化
和应激反应等多种细胞反应。对人类 Kal基因启动
子区域的分析表明，在 5侧翼区 -675和 -915 bp处
存在两个共有 FOXO反应元件 (forkhead-responsive
element, FRE)，提示 FOXO1可能通过与 FRE结合
直接调控 Kal的表达。过氧化氢 (H2O2)可以增加细
胞内 ROS的浓度，通常作为氧化应激的诱导剂。
内皮细胞经 H2O2处理后，Kal的表达呈 H2O2剂量
依赖性减少。当采用 siRNA有效敲除 FOXO1的表
达后，在内皮细胞内由氧化应激诱导的 Kal表达降
低被有效抑制，说明 FOXO1确实是负责 Kal负调
控的转录因子 [27]。
c-Jun N 端激酶 (c-Jun N-terminal kinase, JNK)
是丝裂源激活蛋白激酶 (mitogen-activated protein
kinases，MAPK)的家族成员，可被氧化应激和炎
性因子激活，磷酸化程度增加，继而促进 FOXO1
的核内转运 [28-29]。在正常情况下，血管内皮细胞内
大部分 (65％ )FOXO1存在于细胞质。JNK经 H2O2
激活后，FOXO1的核内转运增加，Kal的表达被抑
制 (图 1)。血管内皮细胞经 JNK抑制剂预处理后，
H2O2刺激不再影响 Kal的表达。JNK表达敲除后，
氧化应激也不能引起 Kal的表达抑制。这说明氧化
应激条件下，FOXO1的核转运过程由 JNK调节，
发挥 Kal的表达调节作用 [27]。
动物实验显示，氧化应激会引起糖尿病大鼠视
网膜内 Kal水平的降低 [30-31]，但 1型糖尿病患者体
内 Kal的水平却高于正常人，且与炎症或氧化应激
没有相关性 [32]。在类风湿关节炎 (炎症 )患者，血
浆和关节内Kal水平较人骨关节炎患者相对增加 [33]。
提示 Kal是一种负急性期反应蛋白，炎症或氧化应
激的慢性刺激也可能会引起患者体内的代偿性增
加，其临床指标意义应根据病种和病情灵活掌握。
1.2　Kal的抗炎作用
肿瘤坏死因子 -α (TNF-α)与细胞表面的 TNF-α
受体 1 (TNFR1)结合后可引起炎性级联反应。Kal
通过与 TNF-α竞争结合 TNFR1抑制内皮细胞的激
活、黏附和渗透性增加等炎性反应 [39]。内皮细胞经
邢永梅，等：人源性激肽释放酶结合蛋白与内皮细胞功能第1期 27
Kal处理后，TNFR相关死亡域蛋白 (TNFR-associated
death domain protein, TRADD)水平降低，不能有效
招募 TNFR相关因子 (TNF receptor associated factors,
TRAF)和受体相互作用蛋白 (receptor interact-ing
protein, RIP)形成三聚体，NF-κB抑制蛋白 (IκB-α)
磷酸化程度降低而与 NF-κB的 p65与 p50亚基持续
结合，抑制 NF-κB p65亚基的入核，其下游基因的
表达不能被激活。另外，Kal还抑制 TNF-α引起的
有丝分裂原激活蛋白激酶 (p38 MAPK)的磷酸化，
抑制血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecular
1, VCAM-1)、细胞间黏附因子 1 (intercellular adhes-
ion molecular 1, ICAM-1)和单核细胞趋化蛋白 1
(monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1)的表达
(图 2)。
1.3　Kal的抗氧化作用
血管内皮功能障碍往往与胞内 ROS数量增加
有关 [34-35]。ROS水平上升，促进血管炎症和细胞
凋亡，继而加重血管内皮功能障碍 [34-36]。细胞因子，
如 TNF-α 等炎性因子通过激活内皮细胞表面
NAD(P)H氧化酶，激发细胞内超氧化物生成。在
炎性血管中，NO缺乏是 ROS增加的主要原因。
NO通过抑制 NAD(P)H氧化酶活性或中和有毒的氧
自由基而发挥保护内皮细胞的功能。内皮细胞内
NO水平由组成性表达的内皮细胞一氧化氮合酶
(eNOS)控制。eNOS缺陷小鼠一般表现为高血压，
缺乏内皮依赖性血管舒张功能，对炎性刺激敏感，
容易形成动脉粥样硬化病变 [37]。Kal分别通过
KLF4-eNOS、PI3K-Akt-eNOS 和 Akt-FOXO1 等 多
条信号通路 (图 3)，调节胞内 NO水平，抑制内皮
细胞损伤。
1.3.1　KLF4-eNOS信号通路
Hamik等 [37]首次证明Kruppel样因子 4 (kruppel-
like factor 4, KLF4)对 eNOS表达具有促进作用。
KLF4是 Sp1/KLF锌指转录因子家族的一员，是上
皮细胞内富含的一种转录因子，各种动脉和静脉腔
内的内皮细胞也表达 KLF4。Shen等 [38]的研究确
图1 在氧化胁迫条件下通过JNK-FOXO1途径抑制Kal
表达
图2 Kallistatin与TNF-α竞争结合TNFR1，抑制内皮
细胞炎症
图3 Kallistatin介导的内皮细胞信号通路
生命科学 第24卷28
认 KLF4是 Kal的结合蛋白，血管内皮细胞表面的
KLF4与 Kal结合后，将 Kal转运入细胞内部，从而
促进 eNOS的合成和 NO的生成增加。在体外培养
的内皮细胞，Kal以剂量依赖的方式增加 eNOS的
表达。当 KLF4的表达被抑制后，Kal则失去了对
eNOS的表达促进效果，说明 Kal对 eNOS表达的
诱导作用确由 KLF4所介导。
除促进 eNOS的表达外，Kal与 KLF4的结合
还有助于减轻 TNF-α诱导的 NF-κB活化，降低黏
附分子MCP-1和 VCAM-1的表达，抑制白细胞与
血管内皮细胞黏附 [38]。在生理条件下，MCP-1和
VCAM-1在内皮细胞内的表达水平非常低，但在细
胞因子 TNF-α作用下则迅速升高。内皮细胞表面黏
附分子的表达上调可启动病理性白细胞 -内皮细胞
相互作用，最终将血管壁及周围组织暴露于激活的
白细胞，并导致血管内皮功能障碍。
1.3.2　PI3K-Akt-eNOS信号通路
Kal处理内皮细胞后，可抑制 TNF-α、血管紧
张素Ⅱ、低氧 /氧再灌注等引起的 ROS形成。采用
PI3K抑制剂 LY-294002、功能缺失型 Akt和 NOS
抑制剂 L-NAME处理后，Kal不再发挥抑制作用，
说明 Kal是通过激活 PI3K-Akt-eNOS信号通路发挥
保护作用 [4]。内皮细胞经 Kal短暂处理 (15~30 min)
后，Akt、eNOS和 FOXO1的磷酸化程度均明显增加。
eNOS的磷酸化程度增加，意味着其合成 NO的效
率显著提高。下述 FOXO1对 eNOS表达负调控的
解除，则有利于提高 eNOS表达水平，说明通过
PI3K-Akt-eNOS信号通路，Kal不仅可以增加 eNOS
的比活性，还可以促进 eNOS的表达。
1.3.3　Akt-FOXO1信号通路
前凋亡蛋白 Bim是 FOXO1的重要靶基因，氧
化应激可促进 Bim的表达，诱导内皮细胞的凋亡。
当 FOXO1表达被敲除后，氧化应激诱导的内皮细
胞凋亡得以抑制，说明 FOXO1参与了 Bim介导的
细胞凋亡。内皮细胞经 Kal短暂处理，FOXO1的
磷酸化程度明显增加，而 PI3K活性抑制则阻断了
FOXO1的磷酸化，说明 PI3K和 Akt参与了 FOXO1
的磷酸化。Kal经 PI3K-Akt-FOXO1通路诱导 FOXO1
磷酸化，FOXO1因磷酸化失活而不能入核，FOXO1
依赖性 Bim表达降低，因此，氧化应激不能诱导内
皮细胞凋亡。在蛋白质和 mRNA水平的检测也证
明 Kal可有效抑制 H2O2诱导的 Bim表达，从而对
内皮细胞实施保护作用 [4]。
FOXO1是成熟内皮细胞内表达最高的 FOXO
转录因子，其过度表达显著抑制内皮细胞管道形成
和迁移，而表达沉默则显著增加内皮细胞管形成和
迁移，表明 FOXO转录因子在调节血管形成和成熟
方面具有重要作用。Potente等 [40]的研究显示，内
皮细胞敲除 FOXO1后，eNOS蛋白表达显著上调，
说明对血管内皮功能和产后血管形成至关重要的
eNOS也是 FOXO的靶基因之一。对 eNOS的启动
子进行分析，发现其中含有一个保守的 FRE元件，
位于起始密码子上游 2 753 bp处。染色质免疫沉淀
分析表明，FOXO1和 FOXO3a与 eNOS的启动子
区域结合，可抑制 eNOS的转录。Kal经 PI3K-Akt
通路诱导的 FOXO1磷酸化失活，不仅仅降低 Bim
表达，还可能通过调控 eNOS以及 Ang2和 ELK-3
等其他细胞因子，共同发挥血管功能调控活性 [40]。
2　Kal与肿瘤血管形成
血管形成主要存在两种方式，即血管新生
(vasculogenesis)和血管生成 (angiogenesis)。血管新
生是从头开始形成血管的过程，需要原始祖细胞分
化为成熟的内皮细胞，一般认为只发生在胚胎发育
期。血管生成则是在预先存在的血管基础上产生新
的血管，在胚胎发育期和出生后均可发生。长期以
来学界一直认为肿瘤血管形成仅来自分化的成熟内
皮细胞，即血管生成。
2.1　Kal抑制肿瘤血管生成
Folkman[41]首先提出血管生成是肿瘤生长、侵
袭和转移的必要条件，为抗肿瘤新药研究指出了新
方向。肿瘤的最初生长依赖于周围组织中的氧气和
营养物质的扩散，不需要一个新的血液供应。但在
肿瘤长到 1~2 mm3大小后，其日益增加的营养与代
谢需求必须由新生血管来满足。肿瘤新生成的血管
通常表现为泄漏、扩张和曲折的畸形状态，血管结
构和功能的异常为肿瘤提供了缺氧和酸性的微环
境，反过来又进一步刺激肿瘤血管生成。抗血管生
成治疗通过抑制肿瘤异常血管的萌芽和组装，限制
了肿瘤细胞获取氧气及其他营养物质的能力，某些
血管生成依赖性肿瘤得以转归或生长停滞 [41-43]。大
部分抗血管生成药物在动物肿瘤模型中可有效阻断
肿瘤的侵袭和发展，佐证了 Folkman假说的合理性。
Miao等 [9]首先发现 Kal的血管形成抑制作用，
并证明 Kal通过竞争结合内皮细胞表面的乙酰肝素
蛋白聚糖 (heparan sulfate proteoglycan，HSPG)受体，
抑制VEGF和 βFGF诱导的血管生成信号级联反应。
以病毒载体介导的 Kal基因治疗，不仅可有效降低
邢永梅，等：人源性激肽释放酶结合蛋白与内皮细胞功能第1期 29
肿瘤的血管密度和生长速率，而且可以抑制肿瘤细
胞的侵袭与转移。Kal的抗肿瘤血管形成活性已被
多篇研究报告所证实，涉及的肿瘤包括乳腺癌、结
肠癌、肝癌、胃癌和肺癌等 [9-16]。Kal通过诱导内
皮细胞凋亡 [12]，从而抑制肿瘤内血管形成的结果，
似乎与前述 Kal对内皮细胞损伤的保护作用相互矛
盾。我们推测，肿瘤内皮细胞所处的环境及其本身
的性质，可能有别于正常内皮细胞，肿瘤血管形成
可能还包括了血管新生机制，Kal对肿瘤血管形成
影响的机制尚存在深入探索的空间。
2.2　内皮细胞对肿瘤作用的两面性
尽管抗肿瘤血管生成药物在动物模型取得了极
好的疗效，但临床研究结果却让人大失所望。虽然
治疗后患者肿瘤负荷明显减少 [44- 45]，但长期生存率
并没有显著延长 [46-47]，肿瘤细胞甚至出现侵袭和转
移倾向增加 [48-49]。最近研究发现，抑制特定的血管
生成通路会导致一些促进组织修复的新生血管的衰
退，会导致其他血管生成途径的代偿性替代，有可
能因此加剧血管生成，并增强肿瘤的侵袭能力 [48-49]，
说明血管生成抑制的后果并不像预计的那样简单。
近期研究表明，内皮细胞不仅为肿瘤建立输送
氧气和营养物质的管道，还可以通过释放血管分泌
因子，直接调节肿瘤生长，其调节作用对肿瘤细胞
具有两面性。健康哺乳动物体内大部分内皮细胞处
于静态状态，所产生的血管分泌因子维持体内动态
平衡，使肿瘤处于休眠状态 [50]。在缺氧、炎症等应
激压力下，以及癌基因诱导的肿瘤细胞恶性转化期，
内皮细胞内特定血管分泌因子表达上调，反而刺激
肿瘤的生长。内皮细胞表型的微小变化都可能对肿
瘤细胞的命运产生深远影响 [51]。Franses等 [52]的研
究显示，正常内皮细胞释放的因子可抑制肿瘤细胞
的增殖和侵袭。在小鼠的移植瘤附近植入正常内皮
细胞后，原发性肿瘤生长速率和转移倾向得以抑制。
敲除内皮细胞表面 HSPG受体后，内皮细胞对肿瘤
细胞的调控作用发生改变，抑制肿瘤增殖的能力略
微增加，但抑制肿瘤侵袭的能力则丧失。
基于内皮细胞对肿瘤细胞影响的两面性，
Butler等 [19]提出在不破坏血管正常功能的情况下，
选择性抑制血管分泌因子有可能既阻止肿瘤的生
长，又可以避免血管生成抑制对血管潜在的毒副作
用。内皮细胞产生的对肿瘤细胞具有潜在作用的血
管分泌因子包括 VEGF、FGF2、NO等生长因子；
ICAM1、VCAM1、E-选择素等黏附分子；白细胞
介素 8(IL-8)、MCP1等趋化因子。现有研究表明，
Kal对内皮细胞多种血管分泌因子具有调节作用，
其中既可以与 VEGF和 FGF2竞争性结合内皮细胞
表面的 HSPG受体 [9]，又可以调节氧化应激及炎症
状态下内皮细胞内的 NO水平 [4,18,38]，还可以抑制
TNF-α诱导的 NF-κB活化，降低MCP-1和 VCAM-1
的表达 [39]，抑制白细胞与内皮细胞黏附等。Kal很
有可能通过对肿瘤内环境中内皮细胞各种血管分泌
因子的调控，抑制肿瘤的生长。
2.3　内皮祖细胞
除血管生成外，由 EPC主导的血管新生也参
与了肿瘤血管形成 [53-54]。EPC既可以直接参与肿
瘤新生血管形成 [55]，还可以在肿瘤附近通过旁分
泌作用分泌血管分泌因子刺激血管生成。Arbab等 [56]
的研究显示，EPC对肿瘤血管新生的作用与肿瘤生
长阶段有关系。直径为 0.5~1.0 cm大小的肿瘤外围
血管主要由 EPC构成，随着肿瘤继续长大到超过 1.0
cm，肿瘤外周血管内 EPC的比例显著下降。可能
在肿瘤生长的早期，血管形成以血管新生为主，在
肿瘤达到一定体积后，则由内皮细胞参与的血管生
成逐渐占据了上风。
与成熟的内皮细胞相比，EPC对氧化应激不敏
感 [57]，但对血管抑素诱导的凋亡却更敏感 [58]，提
示两者在性质上存在明显的差异。此外，EPC和内
皮细胞之间基因表达谱也有显著差异。以对内皮细
胞功能有重要影响的 FOXO为例，FOXO4在造血
细胞源性的 EPC中高度表达，而 FOXO1和 FOXO3a
则是成熟内皮细胞内表达最高的 FOXO亚型 [59]。
FOXO1和 FOXO3a过度表达可抑制内皮细胞的迁
移活性和成管能力，而 FOXO4的表达则无显著影
响 [40]。FOXO4过度表达可激活 Bim启动子，Bim
的表达引起 EPC凋亡 [60]。
迄今为止，尚未见 Kal对 EPC作用的任何研
究报道。已知 VEGF在体外和体内都能促进 EPC
的增殖 ,推测 Kal至少可以通过竞争结合，抑制
VEGF对 EPC的作用。另外，鉴于 PI3K-Akt信号
通路对 EPC的重要作用，以及 Kal对 PI3K-Akt信
号通路的调控作用，相信 Kal与 EPC的相互关系研
究值得探索。
3　总结
起初 Kal是以激肽释放酶结合蛋白的形式被发
现，被认为是一种特异性组织激肽释放酶抑制剂，
通过与激肽系统的相互作用参与血管舒张和局部血
流调节。之后发现，除了对组织激肽释放酶的抑制
生命科学 第24卷30
作用外，Kal还有其他重要功能，如抗炎、抗氧化、
抑制新生血管形成等。近年来又发现，Kal通过减
少氧化应激引起的内皮损伤，对心脏、肾脏等重要
器官具有保护作用。更有意义的是，Kal对多种肿
瘤的生长及转移具有很好的抑制作用。已有的研究
结果显示，Kal是一种非常值得开发的蛋白质药物，
可用于多种重大疾病的治疗。希望随着对 Kal药理
作用及分子机制更广泛和深入的研究，以蛋白质或
基因治疗形式出现的 Kal药物可以真正为人类健康
作出应有贡献。
[参　考　文　献]
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