全 文 ：第 １３卷第 １期
２０１５年 １月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 １
Ｊａｎ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０１􀆰 ０１４
收稿日期：２０１３－０６－０４
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１１ＣＢＡ００８０７）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１２ＡＡ０２２１０１）
作者简介：李文莉（１９８８—），女，江苏徐州人，硕士研究生，研究方向：生物能源；缪冶炼（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙｌｍｉａｏ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
木质素降解物对酿酒酵母的毒性
李文莉１，缪冶炼１，陈介余２，花卫俊１，邵慧丽１，许　 琳３
（１􀆰 南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 ２１１８００； ２􀆰 日本秋田县立大学 生物资源学部，
秋田 ０１０ ０１９５，日本； ３􀆰 南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：木质素降解物是影响木质纤维素水解液乙醇发酵效率的主要原因之一。 为探明木质素降解物对酿酒酵母
的毒性，通过酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＧＭＣＣ ２􀆰 １４２９ 的液体培养，测定木质素制剂及酚类化合物（香草
醛、紫丁香醇和对羟基苯甲醛）对细胞的毒性，同时分析酚类化合物的联合作用类型，最后以果糖 １，６ 二磷酸
（ＦＤＰ）为指标来分析木质素制剂及酚类化合物酵母细胞膜通透性的变化。 结果表明：木质素制剂、紫丁香醇、对羟
基苯甲醛和香草醛的半致死质量浓度分别为 １０􀆰 ９６、５􀆰 ３７、６􀆰 １７ 和 ７􀆰 ０８ ｇ ／ Ｌ。 随着各酚类化合物浓度和种类的增
加，它们对细胞的毒性随之增加，呈正协同作用。 在培养液中，ＦＤＰ 浓度随各酚类化合物浓度的增加呈线性增加，
当各酚类化合物的质量浓度从 １􀆰 ５８ ｇ ／ Ｌ增加到 １０􀆰 ００ ｇ ／ Ｌ时，ＦＤＰ 质量浓度从 ４９􀆰 ７ ｍｇ ／ Ｌ增加到 １３４􀆰 ４ ｍｇ ／ Ｌ。 木
质素降解物对酿酒酵母的毒性作用与细胞膜通透性的改变密切相关。
关键词：生物乙醇；木质素；酿酒酵母；毒性；果糖 １，６ 二磷酸 （ＦＤＰ）
中图分类号：ＴＱ３５２􀆰 ７８　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０１－００８２－０７
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｎｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＬＩ Ｗｅｎｌｉ１，ＭＩＡＯ Ｙｅｌｉａｎ１，ＣＨＥＮ Ｊｉｅｙｕ２，ＨＵＡ Ｗｅｉｊｕｎ１，ＳＨＡＯ Ｈｕｉｌｉ１，ＸＵ Ｌｉｎ３
（１􀆰 Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ；
２􀆰 Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｋｉｔａ Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｋｉｔａ ０１０⁃０１９５，Ｊａｐａｎ；３􀆰 Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｌｉｇｎｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｒｅ ｍａｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｒｅｓｔｒａｉｎ ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ． Ｔｈｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｔｏ ｃｌａｒｉｆｙ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
ｏｆ ｌｉｇｎｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｔｈｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｌｉｇｎｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｌｉｃ
ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｖａｎｉｌｌａ ａｌｄｅｈｙｄｅ，ｌｉｌａｃ ａｌｃｏｈｏｌ，ａｎｄ ｐ⁃ｈｙｄｒｏｘｙ ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＧＭＣＣ ２􀆰 １４２９． Ｔｈｅｎ，ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ
ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｕｃｔｏｓｅ⁃１，６⁃ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ （ＦＤＰ）． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｔｈｅ ５０％ ｌｅｔｈａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（ＬＣ５０） ｏｆ ｌｉｇｎｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｖａｎｉｌｌａ ａｌｄｅｈｙｄｅ， ｌｉｌａｃ ａｌｃｏｈｏｌ，ａｎｄ ｐ⁃ｈｙｄｒｏｘｙ ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ ｗａｓ １０􀆰 ９６，
５􀆰 ３７，６􀆰 １７ ａｎｄ ７􀆰 ０８ ｇ ／ Ｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ａｌｌ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｃｔｅｄ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｏｎ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ．
Ｆｒｕｃｔｏｓｅ⁃１，６⁃ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ （ ＦＤＰ） ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｌｉｎｅａｒｌｙ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ
ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｃｈ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ． Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｃｈ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ
ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ １􀆰 ５８ ｇ ／ Ｌ ｔｏ １０􀆰 ００ ｇ ／ Ｌ，ＦＤＰ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ４９􀆰 ７ ｍｇ ／ Ｌ ｔｏ １３４􀆰 ４ ｍｇ ／ Ｌ．
Ｔｈｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｌｉｇｎｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｃｅｌｌ
ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｅｔｈａｎｏｌ；ｌｉｇｎｉｎ； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；ｔｏｘｉｃｉｔｙ；ｆｒｕｃｔｏｓｅ⁃１，６⁃ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ （ＦＤＰ）
　 　 农业秸秆、废弃木材等木质纤维素材料来源广
泛、成本低廉、可以再生，因此，以木质纤维素材料
为原料的生物乙醇生产技术具有巨大的产业化发
展潜力［１］。
以木质纤维素材料为原料的生物乙醇生产过
程一般包括原料预处理、酶解、乙醇发酵和乙醇精
制等主要步骤［２］。 在预处理以及酶解过程中，木质
素会降解成相对分子质量不同的物质，其一部分残
留在酶解液中。 木质素降解产物主要有阿魏酸、香
草酸、对羟基苯甲醛及香草醛等酚类化合物［３］。 当
发酵液中各酚类化合物的质量浓度为 １􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ 时，
阿魏酸对假丝酵母（Ｃ􀆰 ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）ＢＡ１０的致死率为
７０％，香草酸为 ６４％，对羟基苯甲醛为 ６６％，香草醛
为 ２２％。 当阿魏酸的质量浓度为 ０􀆰 ３ ｇ ／ Ｌ 时，假丝
酵母（Ｃ􀆰 ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）ＢＡ１０发酵过程中只产生很少量
的丙酮丁醇乙醇（ＡＢＥ），甚至不产生 ＡＢＥ［４］。 由此
可知，酚类化合物对微生物的毒性是影响木质纤维
素水解液发酵的主要原因之一［３－６］。 去除木质素降
解物毒性的方法有 ２ 种：一是对木质纤维素水解液
进行脱毒处理，二是培育木质素耐受性菌株。 酚类
化合物对微生物，特别是对酿酒酵母的毒性大小及
其作用机制目前尚不清楚。
木质素是由愈创木基结构、紫丁香基结构和
对羟苯基结构等 ３ 种单体组成的 ［７］ 。 在木质纤
维素预处理及酶解过程中，木质素会分解成由 ３
种单体组成、相对分子质量不同的化合物。 因为
香草醛、紫丁香醇、对羟基苯甲醛分别与 ３ 种木
质素组成单体的结构相类似，所以本研究中笔者
选用紫丁香醇、对羟基苯甲醛及香草醛作为模型
酚类化合物来研究木质素降解物对酵母细胞的
毒性。 图 １ 为紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛
的结构。
图 １　 紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛的结构示意
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ｌｉｌａｃ ａｌｃｏｈｏｌ，ｐ⁃ｈｙｄｒｏｘｙ ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ ａｎｄ ｖａｎｉｌｌａ ａｌｄｅｈｙｄｅ
　 　 本文旨在探明木质素降解物对酿酒酵母的毒性及
作用机制，为开发木质素脱毒技术以及培育木质素耐
受酵母提供理论和技术依据。 通过酿酒酵母
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＧＭＣＣ ２􀆰 １４２９的液体培养，
测定木质素制剂及酚类化合物（香草醛、紫丁香醇、对
羟基苯甲醛）的毒性，分析酚类化合物的联合作用类
型。 然后在此基础上，讨论酵母细胞膜通透性的变化。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌种
酿酒酵母 （ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ） ＣＧＭＣＣ
２􀆰 １４２９ 购自中国普通微生物保藏中心。 菌种的活
化方法：用无菌水溶解冻干菌种制成菌悬液，接种
至平板活化培养基（葡萄糖 １０ ｇ ／ Ｌ、蛋白胨 １０ ｇ ／ Ｌ、
酵母提取物 ５ ｇ ／ Ｌ、琼脂 ２０ ｇ ／ Ｌ，自然 ｐＨ），在 ３０ ℃、
１８０ ｒ ／ ｍｉｎ下培养 １２ ｈ。
１􀆰 ２　 培养基
培养基（ ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 １０，酵母膏 ８􀆰 ５，ＮＨ４ Ｃｌ
１􀆰 ３，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 １，ＣａＣｌ２ ０􀆰 ０６；ｐＨ ４􀆰 ８。
１􀆰 ３　 木质素制剂及酚类化合物
木质素制剂，日本关东化学株式会社；对羟基
苯甲醛（纯度＞９８％）、香草醛（纯度＞９８％），阿拉丁
化学有限公司；紫丁香醇（纯度＞９８％），东京化成工
业株式会社。
３８　 第 １期 李文莉等：木质素降解物对酿酒酵母的毒性
１􀆰 ４　 试剂与仪器
醋酸钡（纯度＞９９％），上海泗联化工有限公司；
间苯二酚（纯度＞９９􀆰 ５％）、硫脲（纯度＞９９％）、冰醋
酸（纯度＞９９􀆰 ５％）、ＦＤＰ（纯度＞９９􀆰 ５％），阿拉丁化
学有限公司；其他化学试剂均为分析纯。
７５２Ｓ型紫外可见分光光度计，上海棱光技术有
限公司；ＢＭＸ ３０Ｒ型高压蒸汽灭菌锅，上海博讯实
业有限公司医疗设备厂；ＴＨＺ Ｄ 型恒温振荡器，太
仓市实验设备厂；ＤＬＬ􀆰 ２０３ＸＰ 型透射式偏光显微
镜，南京市东利来光电有限责任公司；ＴＧＬ １８Ｃ Ｃ
型高速离心机，上海安亭科学仪器有限公司。
１􀆰 ５　 木质素制剂及酚类化合物的毒性测定
１􀆰 ５􀆰 １　 木质素制剂及单一酚类化合物的毒性测定
将活化后的菌株接入 １００ ｍＬ培养基中，３０ ℃、
１８０ ｒ ／ ｍｉｎ培养 ２０ ｈ至细胞生长稳定期。 取 ０􀆰 １ ｍＬ
的培养液，稀释 ４０ 倍，用血球计数板测定培养液中
的活菌数 Ａ。 然后，分别加入一定浓度的木质素制
剂、紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛，继续培养 ２４
ｈ，测定活菌数 Ａ∗。 按照式（１）计算细胞死亡率 Ｄ。
Ｄ＝ １－Ａ∗ ／ Ａ （１）
木质素制剂、紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草
醛的质量浓度按照对数间距设定为 １００􀆰 ２、 １００􀆰 ４、
１００􀆰 ６、１００􀆰 ８、１０１􀆰 ０和 １０１􀆰 １ ｇ ／ Ｌ。 每个浓度设置 ２ 个平
行组，每个样品测定 ３次，取平均值。 在本实验的浓
度范围内，木质素制剂、紫丁香醇、对羟基苯甲醛和
香草醛都是可溶的。
１􀆰 ５􀆰 ２　 混合酚类化合物的毒性测定
根据预实验结果，按照等质量浓度比配将紫丁
香醇、对羟基苯甲醛和香草醛制成三组二元混合物
和一组三元混合物，溶解在培养基中。 各成分的质
量浓度设定为 １００􀆰 １、１００􀆰 ２、１００􀆰 ４、１００􀆰 ６和 １００􀆰 ８ ｇ ／ Ｌ。
每个浓度设置 ２个平行组，每个样品测定 ３次，取平
均值。
１􀆰 ６　 培养液中果糖 １，６ 二磷酸（ＦＤＰ）的测定
培养液中果糖 １，６ 二磷酸（ＦＤＰ）浓度采用间
苯二酚法［８］测定。 按照混合酚类化合物毒性测定
方法培养酵母细胞。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 木质素制剂的毒性
通过凝胶渗透色谱法测定得知：该木质素制剂
的相对分子质量分布为 ３５０～３４ ０００，相对分子质量
５ ０００ 的累积质量分数为 ５０􀆰 ３％［９］。 木质素制剂中
的小分子为单一酚类化合物，如阿魏酸、对香豆
酸［４］、香草醛［１０］、对羟基苯甲醛、丁香醛（３，５ 二甲
氧基 ４ 羟基苯甲酸）和紫丁香醇［１１］等。 木质素制
剂中的大分子为这些酚类化合物的聚合物。
图 ２表示细胞死亡率随培养液中木质素制剂浓
度的变化。 细胞死亡率（Ｄ）随木质素制剂浓度的增
加呈线性增加，其回归方程式见式（２）。
Ｄ＝ ０􀆰 ５１ｌｇ ρＬ－０􀆰 ０３０　 （Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９９８） （２）
式中：ρＬ为木质素制剂质量浓度，ｇ ／ Ｌ。
当木质素制剂质量浓度从 １􀆰 ５８ ｇ ／ Ｌ 增加到
１２􀆰 ５９ ｇ ／ Ｌ时，细胞死亡率从 ７􀆰 ８％上升到 ５３􀆰 ２％。
从回归方程式（２）可知，当细胞死亡率为 ５０％时，
ｌｇ［ρＬ ／ （ｇ·Ｌ
－１）］ ＝ １􀆰 ０４，即木质素制剂的半致死质
量浓度（ＬＣ５０）为 １０􀆰 ９６ ｇ ／ Ｌ。 由此可知，木质素降解
物对酵母细胞的毒性作用是多种单一酚类化合物
及其聚合物共同作用的结果。
图 ２　 细胞死亡率随培养液中木质素制剂质量浓度的变化
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｒａｔｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍａｓｓ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｎｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｉｎ
ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ
２􀆰 ２　 单一酚类化合物的毒性
图 ３为细胞死亡率随培养液中紫丁香醇、对羟基
苯甲醛和香草醛浓度的变化。 图 ３中培养液仅仅含
有单一酚类化合物。 细胞死亡率随培养液中紫丁香
醇、对羟基苯甲醛和香草醛浓度的增加呈线性增加，
其回归方程式分别如下见式（３） ～式（５）。
ＤＬＡ ＝ ０􀆰 ６９０ｌｇ ρＬＡ－０􀆰 ００２ （Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９６４） （３）
ＤＨＢ ＝ ０􀆰 ７２５ｌｇ ρＨＢ－０􀆰 ０７３ （Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９２８） （４）
ＤＶＡ ＝ ０􀆰 ６５７ｌｇ ρＶＡ－０􀆰 ０５７ （Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９８５） （５）
式中：ＤＬＡ、ＤＨＢ和 ＤＶＡ分别表示培养液中紫丁香醇、
４８ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
对羟基苯甲醛和香草醛对应的细胞死亡率； ρＬＡ、ρＨＢ
和 ρＶＡ分别为紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛的
质量浓度，ｇ ／ Ｌ。
图 ３　 细胞死亡率随培养液中紫丁香醇、对羟基
苯甲醛和香草醛质量浓度的变化
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｒａｔｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍａｓｓ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｌａｃ ａｌｃｏｈｏｌ，ｐ⁃ｈｙｄｒｏｘｙ
ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ ａｎｄ ｖａｎｉｌｌａ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｉｎ
ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ
当紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛质量浓度
从 １􀆰 ５８ ｇ ／ Ｌ增加到 １０􀆰 ００ ｇ ／ Ｌ 时，紫丁香醇使得细
胞的死亡率从 １３􀆰 ８％上升到 ６８􀆰 ８％，对羟基苯甲醛
使得细胞的死亡率从 ７􀆰 ２％上升到 ６５􀆰 ２％，香草醛
使得细胞的死亡率从 ７􀆰 ４％上升到 ５９􀆰 ９％。 此外，
从回归方程式（３） ～ （５）可知，当细胞死亡率 Ｄ ＝
５０％时，ｌｇ ρＬＡ ＝ ０􀆰 ７３，ｌｇ ρＨＢ ＝ ０􀆰 ７９，ｌｇ ρＶＡ ＝ ０􀆰 ８５，即
紫丁香醇、对羟基苯甲醛、香草醛的半致死质量浓
度（ＬＣ５０）分别为 ５􀆰 ３７、６􀆰 １７ 和 ７􀆰 ０８ ｇ ／ Ｌ。 ３ 种酚类
化合物中，紫丁香醇对酵母的毒性最大，对羟基苯
甲醛次之，香草醛最弱。
决定酚类化合物毒性的主要因素有 ２ 个。 首
先，酚类化合物对酵母细胞的毒性与其自身的疏水
性密切相关［１２－１３］。 酚类化合物的疏水基团与细胞
膜的疏水成分相互作用，从而改变了细胞膜中各成
分比例，破坏细胞膜的完整性，这是其对细胞产生
毒性的主要原因。 另外，酵母细胞自身对酚类化合
物的分解作用也是决定其毒性大小的重要因素。
在一定的浓度范围内，酵母细胞可以将酚类化合物
分解为毒性较弱酸或醇［１４－１５］。 有些酵母细胞中还
含有芳香酸脱羧酶（ＰＡＤ），它可以将对香豆酸、肉
桂酸、阿魏酸等酚类化合物分解，从而降低它们的
毒性［１６］。
由于醛基是亲水性基团，因此不含醛基的酚类
化合物的疏水性比含醛基的酚类化合物的疏水性
强［１７］。 疏水性较强的酚类化合物更容易与酵母细
胞膜结合，并与细胞膜上的疏水性成分相互作用，
从而更大程度上破坏细胞膜的完整性。 香草醛和
对羟基苯甲醛的分子结构中都有醛基连接在苯环
上，而紫丁香醇的苯环结构上没有醛基，也就是说
在 ３种酚类化合物中，紫丁香醇的疏水性最强，毒性
也最大。 这与实验值相一致。
另外，与香草醛相比，对羟基苯甲醛毒性较大
的原因可能是由于酵母细胞分解香草醛的能力较
强，而分解对羟基苯甲醛的能力较弱。 将一定浓度
的香草醛、对羟基苯甲醛加入到含有假丝酵母
Ｃ􀆰 ａｔｈｅｎｓｅｎｓｉｓ ＳＢ１８ 的液体培养基中，在 ３０ ℃、１５０
ｒ ／ ｍｉｎ下培养 ４８ ｈ，定时取样来测定培养液中香草
醛、对羟基苯甲醛的残留量。 当香草醛、对羟基苯
甲醛的初始质量浓度为 ０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ 时，连续培养 ３９ ｈ
后，对羟基苯甲醛和香草醛几乎完全被假丝酵母分
解掉，但是酵母细胞分解对羟基苯甲醛的速度小于
分解香草醛的速度［１８］。 因此，在相同时间内，对羟
基苯甲醛首先在细胞内部积累，并且积累量大于香
草醛，从而使得对羟基苯甲醛对酵母细胞的毒性大
于香草醛。
２􀆰 ３　 混合酚类化合物的联合作用
图 ４ 表示培养液含有二元酚类化合物时细胞
死亡率随各酚类化合物浓度的变化。 图 ５ 表示培
养液含有三元酚类化合物时细胞死亡率随各酚类
化合物浓度的变化。 细胞死亡率随各酚类化合物
浓度的增加呈线性增加，其回归方程式见式（６） ～
式（９）。
ＤＬＨ ＝ ０􀆰 ７６２ｌｇ ρＬＨ＋０􀆰 ２７７　 （Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９８８） （６）
ＤＬＶ ＝ ０􀆰 ７５９ｌｇ ρＬＶ＋０􀆰 ２３５　 （Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９８１） （７）
ＤＨＶ ＝ ０􀆰 ７０３ｌｇ ρＨＶ＋０􀆰 １９７　 （Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９９５） （８）
ＤＬＨＶ ＝ ０􀆰 ８４９ｌｇ ρＬＨＶ＋０􀆰 ３６６ （Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９５３） （９）
式中：ＤＬＨ表示含有紫丁香醇和对羟基苯甲醛的培
养液对应的细胞死亡率；ρＬＨ表示含有紫丁香醇和
对羟基苯甲醛的培养液中各酚类化合物的质量浓
度，ｇ ／ Ｌ；ＤＬＶ表示含有紫丁香醇和香草醛的培养液
对应的细胞死亡率；ρＬＶ表示含有紫丁香醇和香草
醛的培养液中各酚类化合物的质量浓度，ｇ ／ Ｌ；ＤＨＶ
表示含有对羟基苯甲醛和香草醛的培养液对应的
细胞死亡率；ρＨＶ表示含有对羟基苯甲醛和香草醛
５８　 第 １期 李文莉等：木质素降解物对酿酒酵母的毒性
的培养液中各酚类化合物的质量浓度，ｇ ／ Ｌ；ＤＬＨＶ
表示含有紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛的培
养液对应的细胞死亡率；ρＬＨＶ表示含有紫丁香醇、
对羟基苯甲醛和香草醛的培养液中各酚类化合物
的质量浓度，ｇ ／ Ｌ。
图 ４　 培养液含有二元酚类化合物时细胞死亡率
随各酚类化合物质量浓度的变化
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｒａｔｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔ⁃
ｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｃｈ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅ
ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｔｗｏ ｐｈｅｎｏｌｉｃ
ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ
图 ５　 培养液含有三元酚类化合物时细胞死亡率
随各酚类化合物质量浓度的变化
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｒａｔｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍａｓｓ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｃｈ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ
ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｔｈｒｅｅ
ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ
各酚类化合物质量浓度从 １􀆰 ００ ｇ ／ Ｌ 增加到
６􀆰 ３１ ｇ ／ Ｌ时，含有紫丁香醇和对羟基苯甲醛的培养
液中，细胞死亡率从 ３５􀆰 ３％上升到 ８８􀆰 ７％，含有紫
丁香醇和香草醛、对羟基苯甲醛和香草醛的培养液
中，细胞死亡率分别从 ３１􀆰 １％、 ２６􀆰 ７％ 上升到
８４􀆰 ２％、７５􀆰 ９％；含有三元混合物的培养液中，细胞
死亡率从 ４５􀆰 １％上升到 １００％。 从回归方程式
（６） ～ （９）可知，细胞死亡率为 ５０％时，ｌｇ ρＬＨ ＝ ０􀆰 ２９，
ｌｇ ρＬＶ ＝ ０􀆰 ３５，ｌｇ ρＨＶ ＝ ０􀆰 ４３，ｌｇ ρＬＨＶ ＝ ０􀆰 １６，含有紫丁
香醇和对羟基苯甲醛、紫丁香醇和香草醛、对羟基
苯甲醛和香草醛的培养液中，各酚类化合物的半致
死质量浓度（ＬＣ５０）分别为 １􀆰 ９５、２􀆰 ２４ 和 ２􀆰 ６９ ｇ ／ Ｌ；
含有三元混合物的培养液中，各酚类化合物的半致
死质量浓度（ＬＣ５０）为 １􀆰 ４４ ｇ ／ Ｌ。
培养液中酚类化合物的联合作用类型采用相
加指数法（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ，ＡＩ）进行判别 ［１９－２０］
Ｓ ＝
Ａｍ
Ａｉ
＋
Ｂｍ
Ｂ ｉ
＋
Ｃｍ
Ｃ ｉ
（１０）
式中：Ａｍ、Ｂｍ和 Ｃｍ分别表示培养液中各酚类化合物
联合作用时的 ＬＣ５０（等浓度配比时，Ａｍ ＝ Ｂｍ ＝ Ｃｍ）；
Ａｉ、Ｂ ｉ和 Ｃ ｉ分别表示不同酚类化合物单独作用时的
ＬＣ５０；Ｓ表示毒性相加作用。
由 Ｓ来求相加指数 ＡＩ：当 Ｓ≥１ 时，ＡＩ ＝ －Ｓ＋１；
当 Ｓ＜１时，ＡＩ＝ １ ／ Ｓ－１。
根据 ＡＩ的值来判别混合酚类化合物的作用类
型：ＡＩ＞ ０ 时，联合作用的类型为协同作用；ＡＩ ＝ ０
时，为简单相加作用；ＡＩ＜０时，为拮抗作用。
表 １ 表示培养液中酚类化合物的联合作用类
型。 紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛单独作用
时的半致死质量浓度分别为 ５􀆰 ３７、６􀆰 １７ 和 ７􀆰 ０８
ｇ ／ Ｌ；含有紫丁香醇和对羟基苯甲醛、紫丁香醇和
香草醛、对羟基苯甲醛和香草醛组的培养液中各
酚类化合物的半致死质量浓度分别为 １􀆰 ９５、２􀆰 ２４
和 ２􀆰 ６９ ｇ ／ Ｌ；含有紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草
醛的培养液中各酚类化合物的半致死质量浓度为
１􀆰 ４４ ｇ ／ Ｌ。 半致死浓度越小，表示该酚类化合物的
毒性越大。 由此可知，各酚类化合物在联合作用
时的毒性比在单独作用时要大得多。 含有紫丁香
醇与对羟基苯甲醛、紫丁香醇与香草醛、对羟基苯
甲醛与香草醛的培养液 ＡＩ 值分别为 ０􀆰 ４７、０􀆰 ３７
和 ０􀆰 ２２，由上述判定方法可知，其联合毒性的作用
类型均为协同作用。 此外，含有紫丁香醇、对羟基
苯甲醛和香草醛的培养液 ＡＩ 值为 ０􀆰 ４３，其联合作
用类型也是协同作用。 目前，关于酚类化合物毒
性的研究大都只分析了其单独作用时的毒性，本
文中笔者对培养液中混合酚类化合物联合毒性类
型进行了判别，为开发木质纤维素水解液的高效
脱毒技术和木质素耐受菌株的诱变与筛选提供了
依据。
６８ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
表 １　 培养液中酚类化合物的联合作用类型
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ
ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ
混合物成分
ＬＣ５０ ／
（ｇ·Ｌ－１）
Ｓ ＡＩ 联合作用类型
紫 ５􀆰 ３７
对 ６􀆰 １７
香 ７􀆰 ０８
紫＋对 １􀆰 ９５ ０􀆰 ６８ ０􀆰 ４７ 协同作用
紫＋香 ２􀆰 ２４ ０􀆰 ７３ ０􀆰 ３７ 协同作用
对＋香 ２􀆰 ６９ ０􀆰 ８２ ０􀆰 ２２ 协同作用
紫＋对＋香 １􀆰 ４４ ０􀆰 ７０ ０􀆰 ４３ 协同作用
　 注：紫表示紫丁香醇，对表示对羟基苯甲醛，香表示香草醛。
２􀆰 ４　 木质素降解物对酵母的毒性作用机制
图 ６表示细胞死亡率、培养液中胞内果糖 １，
６ 二磷酸（ＦＤＰ）浓度随各酚类化合物浓度的变化。
在含有紫丁香醇、对羟基苯甲醛、香草醛的培养液
中，当各酚类化合物的质量浓度在 １􀆰 ５８ ～ ６􀆰 ３１ ｇ ／ Ｌ
时，细胞死亡率和培养液中 ＦＤＰ 浓度均随其浓度呈
线性增加。 当各酚类化合物的质量浓度为 １􀆰 ５８ ｇ ／ Ｌ
时，细胞死亡率、ＦＤＰ 的质量浓度分别为 ５２􀆰 ７％和
４９􀆰 ７ ｍｇ ／ Ｌ；当各酚类化合物质量浓度为 ６􀆰 ３１ ｇ ／ Ｌ
时，细胞死亡率达到 １００％，ＦＤＰ 的质量浓度增加到
１１２􀆰 ２ ｍｇ ／ Ｌ。 此外，当各酚类化合物的质量浓度从
６􀆰 ３１ ｇ ／ Ｌ增加到 １０􀆰 ００ ｇ ／ Ｌ 时，细胞死亡率维持在
１００％，而 ＦＤＰ 的质量浓度从 １１２􀆰 ２ ｍｇ ／ Ｌ 进一步增
加到了 １３４􀆰 ４ ｍｇ ／ Ｌ。
图 ６　 细胞死亡率和培养液中 ＦＤＰ质量浓度随
各酚类化合物质量浓度的变化
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｒａｔｅ ａｎｄ ＦＤＰ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ
ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆ ｅａｃｈ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ
细胞死亡的原因有 ２ 种。 一是细胞坏死，它是
指细胞受到环境因素的影响，导致细胞死亡的过
程。 二是细胞凋亡，即细胞发生主动的、由基因控
制的自我消亡过程。 细胞死亡伴随着细胞膜通透
性改变、代谢停止、结构破坏和功能丧失等不可逆
性变化。 本研究中酵母细胞的液体培养时间为 ４４
ｈ，酵母细胞生长处于稳定期，并且针对含有毒性成
分的培养液设定了对照组，避免了细胞凋亡，因此
可以认为细胞死亡是由于木质素降解物对细胞的
毒性作用而导致的。
正常的酵母细胞中，果糖 １，６ 二磷酸（ＦＤＰ）
不断参与代谢反应，并且由于细胞膜的选择透过
性，ＦＤＰ 不能渗透到细胞外。 然而，当细胞膜的通
透性发生改变，或者细胞膜被破坏时，ＦＤＰ 会流到
细胞外，从而使得培养液中 ＦＤＰ 的浓度升高［２１］。
卢群等［２２］在研究超声波对酵母细胞膜通透性的影
响时，用 ＦＤＰ 浓度的增加量来直观反映细胞膜通透
性的改变。 实验过程中利用不同强度的超声波对
发酵液进行处理，测定细胞死亡率及 ＦＤＰ 浓度的增
加量。 ４００、５００和 ６００ Ｗ 超声波处理 ２２５ ｓ后，细胞
死亡率分别为 １２％、１５％和 ３６％，ＦＤＰ 的浓度分别
增加了 ３０％、５５％和 １２０％。 随着酵母细胞死亡率的
增加，培养液中 ＦＤＰ 的浓度也逐渐增加，即细胞膜
的通透性逐渐增大。 本研究中，从图 ６可以看出，培
养液中 ＦＤＰ 的浓度与细胞死亡率呈正相关。 这表
明，木质素降解物对酵母细胞的毒性作用与细胞膜
通透性的改变密切相关。
３　 结论
通过酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，ＣＧＭＣＣ
２􀆰 １４２９）的液体培养，测定了木质素制剂及酚类化
合物（香草醛、紫丁香醇和对羟基苯甲醛）对酵母细
胞的毒性，分析了酚类化合物的联合作用类型，讨
论了细胞膜通透性的改变。 木质素制剂、紫丁香
醇、对羟基苯甲醛和香草醛的半致死质量浓度分别
为 １０􀆰 ９６、５􀆰 ３７、６􀆰 １７和 ７􀆰 ０８ ｇ ／ Ｌ。 酚类化合物具有
协同作用。 培养液中，果糖 １，６ 二磷酸（ＦＤＰ）浓
度随酚类化合物浓度的增加呈线性增加。 当各酚
类化合物的质量浓度从 １􀆰 ５８ ｇ ／ Ｌ增加到 １０􀆰 ００ ｇ ／ Ｌ
时， ＦＤＰ 质量浓度从 ４９􀆰 ７ ｍｇ ／ Ｌ 增加到 １３４􀆰 ４
ｍｇ ／ Ｌ。 木质素降解物对酿酒酵母的毒性作用与细
胞膜通透性的改变密切相关。
７８　 第 １期 李文莉等：木质素降解物对酿酒酵母的毒性
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（责任编辑　 管　 珺）
８８ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷