全 文 ：第 １３卷第 １期
２０１５年 １月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 １
Ｊａｎ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０１􀆰 ００８
收稿日期：２０１４－０５－１７
基金项目：国家自然科学基金（３１１０００８８）；山东省科技发展计划（２０１３ＧＳＦ１２００６）
作者简介：曲衍洪（１９８８—），女，山东威海人，硕士研究生，研究方向：资源与环境微生物；李　 强（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｑ＿ｕｊｎ＠ １２６􀆰 ｃｏｍ
环氧丙烷皂化废水活性污泥 ＤＮＡ
提取方法的比较与优化
曲衍洪１，田　 琳２，李玉梅３，李　 强３，方嘉碧３，宋冬雪３，王佳佳１，郝大可３，陈中合１
（１􀆰 济南大学 化学化工学院，山东济南 ２５００２２； ２􀆰 中海沥青股份有限公司，山东 滨州 ２５６６０１；
３􀆰 济南大学 生物科学与技术学院，山东 济南 ２５００２２）
摘　 要：探索适宜的环氧丙烷废水中活性污泥微生物总 ＤＮＡ提取的方法并进行优化。 采用 １１种方法提取环氧丙
烷废水中活性污泥微生物总 ＤＮＡ，即 ＮａＣｌ溶液 提取缓冲液 溶菌酶 十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）法、蛋白酶 Ｋ ＳＤＳ
法、ＳＤＳ 反复冻融法、Ｔｒｉｓ ＥＤＴＡ ＮａＣｌ 聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）（ＴＥＮＰ）法和反复冻融 ＳＤＳ 蛋白酶 Ｋ法等。 通
过对这 １１种方法进行比较，以确定最佳试验方案并结合单因素法对最佳方案进行优化。 琼脂糖凝胶电泳结果显
示：ＮａＣｌ溶液 提取缓冲液 溶菌酶 ＳＤＳ法提取 ＤＮＡ亮度高，有大片断 ＤＮＡ的存在且拖带较少，条带集中；酶法所
提取的 ＤＮＡ效果仅次于提取缓冲液 溶菌酶 ＳＤＳ法，其他方案没有提取出 ＤＮＡ。 单因子试验结果表明：１０ ｍｇ ／ ｍＬ
溶菌酶，１００ ｇ ／ ＬＳＤＳ，反应时间为 ３０ ｍｉｎ，反应温度为 ４５ ℃时效果最佳。 ＮａＣｌ溶液 提取缓冲液 溶菌酶 ＳＤＳ提取
法为环氧丙烷废水中微生物群落在分子水平上的研究提供了一种简便、可靠的 ＤＮＡ提取方法。
关键词：活性污泥；环氧丙烷；ＤＮＡ提取；废水
中图分类号：Ｘ７０３􀆰 １；Ｑ９３⁃３３　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０１－００４２－０５
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ
ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｌｕｄｇｅ ｉｎ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ｏｆ ｅｐｏｘｙ ｐｒｏｐａｎｅ ｓａｐｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ＱＵ Ｙａｎｈｏｎｇ１，ＴＩＡＮ Ｌｉｎ２，ＬＩ Ｙｕｍｅｉ３，ＬＩ Ｑｉａｎｇ３，ＦＡＮＧ Ｊｉａｂｉ３，ＳＯＮＧ Ｄｏｎｇｘｕｅ３，
ＷＡＮＧ Ｊｉａｊｉａ１，ＨＡＯ Ｄａｋｅ３，ＣＨＥＮ Ｚｈｏｎｇｈｅ１
（１􀆰 Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｊｉｎａｎ，Ｊｉｎａｎ ２５００２２，Ｃｈｉｎａ； ２􀆰 Ｃｈｉｎａ Ｏｆｆｓｈｏｒｅ Ｂｉｔｕｍｅｎ
Ｃｏ． Ｌｔｄ．， Ｂｉｎｚｈｏｕ ２５６６０１，Ｃｈｉｎａ； ３􀆰 Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｊｉｎａｎ，Ｊｉｎａｎ ２５００２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｐｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ􀆰 Ｅｌｅｖｅｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｌｕｄｇｅ ｓａｍｐｌｅｓ，
ａｎｄ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ⁃ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ⁃ｌｙｓｏｚｙｍｅ⁃ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ），ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
Ｋ⁃ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ，ＳＤＳ⁃ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈａｗｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ，Ｔｒｉｓ⁃ＥＤＴＡ⁃ＮａＣｌ⁃ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ（ＴＥＮＰ）
ｍｅｔｈｏｄ，ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈａｗｉｎｇ⁃ＳＤＳ⁃ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ ｍｅｔｈｏｄ， ｅｔｃ􀆰 Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｍｅｔｈｏｄｓ，ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ，ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｔｈｅ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ⁃ｌｙｓｏｚｙｍｅ⁃ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ ｗｈｉｃｈ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ􀆰 Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ⁃
ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｌｅｖｅｌ ｆｏｒ ｅａｃｈ ｆａｃｔｏｒ ｗａｓ １０ ｍｇ ／ ｍＬ ｏｆ ｌｙｓｏｚｙｍｅ，１００ ｇ ／ Ｌ ＳＤＳ，
ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｆｏｒ ３０ ｍｉｎ，ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｔ ４５ ℃． Ｔｈｅｓｅ ｄａｔａ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ⁃ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ⁃ｌｙｓｏｚｙｍｅ⁃ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ ｅｐｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ａｔ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｅｖｅｌ􀆰
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｌｕｄｇｅ；ｅｐｏｘｙ ｐｒｏｐａｎｅ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ
　 　 活性污泥是由以好氧性细菌为主体的微生物
和水中的悬浮物质、胶体物质混杂在一起形成的肉
眼可见的絮状颗粒，它是废水生物处理过程的主
体［１］。 随着每年环氧丙烷工业用量不断地增加，环
氧丙烷皂化废水的有效治理成为国内外研究的重
点。 该废水具有高温（经闪蒸和换热后达 ６０ ～ ８０
℃）、高 ｐＨ （１０ ～ １２）、高盐 （ ＣａＣｌ２的质量分数为
３􀆰 ５％ ～ ４％）、高固体悬浮物 （悬浮物质量分数为
０􀆰 ３％～０􀆰 ５％）的特点，化学需氧量（ＣＯＤ）在 １ ０００～
２ ０００ ｍｇ ／ Ｌ，尽管环氧丙烷皂化废水处理的工程技
术和工艺已较好地发展起来，但对其微生物种群多
样性及其功能相关性的认识目前依然有限，这在很
大程度上制约了废水处理系统效能的提高［２］。 环
氧丙烷皂化废水活性污泥处理污水的能力取决于
生物活性的高低，而微生物菌群的结构和功能直接
影响着生物活性。 因此，为了得到更好的处理效
果，应该更多地了解环氧丙烷皂化废水活性污泥中
生物的多样性，以便更加有效地利用微生物群落的
特性。
目前，关于活性污泥中微生物总 ＤＮＡ的提取方
法已有相关研究报道［３－６］，而尚未有关于环氧丙烷
皂化废水活性污泥中微生物 ＤＮＡ 提取方法的相关
报道。 为此，笔者在综合比较几种污泥总 ＤＮＡ提取
方法的基础上，建立并优化一种快速、高效的环氧
丙烷皂化废水中活性污泥基因组 ＤＮＡ的提取方法，
以期为今后环氧丙烷皂化废水中活性污泥的宏基
因组研究奠定基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 实验材料
１􀆰 １􀆰 １　 污泥样品
活性污泥来自山东滨化集团石化车间；环氧丙
烷废水排放于 ＰＯ工序。
１􀆰 １􀆰 ２　 试剂
ＤＮＡ提取液：１００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ，１００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 乙
二胺四乙酸二钠（Ｎａ２ＥＤＴＡ），１００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｎａ３ＰＯ４，
１􀆰 ５ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ， １％ 十六烷基三甲基溴化铵
（ＣＴＡＢ）；ｐＨ ８。
提取缓冲液：１００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ，１００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 乙二
胺四乙酸（ＥＤＴＡ），２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ，１％ 聚乙烯吡
咯烷酮（ＰＶＰ Ｋ３０），２％ ＣＴＡＢ；ｐＨ ８。
ＴＥＮＰ 缓冲液： ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ， ２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＥＤＴＡ，１００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ， ０􀆰 ０１ ｇ ／ ｍＬ ＰＶＰ Ｋ３０；
ｐＨ １０。
磷酸缓冲液（ＰＢＳ）：１３７ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ，２􀆰 ７ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＫＣｌ，１０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４，２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＫＨ２ＰＯ；ｐＨ ７􀆰 ４。
ＴＥ 缓冲液： １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ， １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＥＤＴＡ；
ｐＨ ８。
Ｔｒｉｓ（优级纯），济南朋远生物科技有限公司；
ＰＶＰ Ｋ３０（医药级），Ｆｌｕｋａ 生化试剂公司；十二烷
基磺酸钠（ＳＤＳ）、ＣＴＡＢ（超纯），博美生物科技责任
公司；ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ （分析纯），天津市大茂化学试
剂厂。
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 方法比较
在 １􀆰 ５ｍＬ ＥＰ 管里加湿质量为 ０􀆰 ５ ｇ 的活性污
泥，１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １ ｍｉｎ 后，取沉淀。 每种方法
做 ２个平行样。
ＳＤＳ法：加 ３００ μＬ ＤＮＡ提取液，混匀，３７ ℃、３０
ｍｉｎ；加 ３０ μＬ ２００ ｇ ／ Ｌ ＳＤＳ溶液，涡旋至混匀，６５ ℃
水浴 ２ ｈ，１５～２０ ｍｉｎ间隔轻摇；６ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０
ｍｉｎ，转移上清至新 ＥＰ 管；沉淀中加 ９０ μＬ ＤＮＡ 提
取液，１０ μＬ ２００ ｇ ／ Ｌ ＳＤＳ 溶液，涡旋；６５ ℃水浴 １０
ｍｉｎ，６ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ，混合 ２ 次所得上清液
进行纯化、沉淀 ＤＮＡ［７］。
Ｔｒｉｓ ＥＤＴＡ ＮａＣｌ ＰＶＰ（ＴＥＮＰ）法：加 ４００ μＬ
ＴＥＮＰ 缓冲液，加玻璃珠混匀，４ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ２０
ｍｉｎ，弃上清，重复 １ 次；加 ４００ μＬ ＰＢＳ 溶液，混匀，
４ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ２０ ｍｉｎ，弃上清；沉淀悬浮于 ５００ μＬ
无菌水中， ２０ ℃、１ ｈ，沸水 １０ ｍｉｎ， ２０ ℃１０ ｍｉｎ，沸
水 １０ ｍｉｎ 反复冻融；４ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ２０ ｍｉｎ，弃上
清；加 １ ｍＬ 提取缓冲液，涡旋 ５ ｍｉｎ；４ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心
２０ ｍｉｎ，取上清液进行纯化、沉淀 ＤＮＡ［８］。
ＮａＣｌ溶液 提取缓冲液 溶菌酶 ＳＤＳ 法：加入
０􀆰 ９％的 ＮａＣｌ溶液 ５ ｍＬ洗涤 １ ｍｉｎ，１０ ０００ ｇ离心 １
ｍｉｎ，加 ６００ μＬ 提取缓冲液，２０ μＬ 溶菌酶溶液，涡
旋至混匀；３７ ℃水浴 ３０ ｍｉｎ，加 ２００ μＬ １００ ｇ ／ Ｌ ＳＤＳ
溶液，涡旋；１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ，取上清液进
３４　 第 １期 曲衍洪等：环氧丙烷皂化废水活性污泥 ＤＮＡ提取方法的比较与优化
行沉淀、纯化 ＤＮＡ［９］。
蛋白酶 Ｋ ＳＤＳ 法：加 ３００ μＬ 提取缓冲液，
２０ μＬ蛋白酶 Ｋ 溶液，涡旋振荡混匀；３７ ℃水浴
３０ ｍｉｎ，加 ８０ μＬ １００ ｇ ／ Ｌ ＳＤＳ 溶液，６５ ℃水浴 １ ｈ；
１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ，取上清液进行纯化、沉
淀 ＤＮＡ［９］。
酶法：加 ３００ μＬ 提取缓冲液，２０ μＬ 溶菌酶溶
液，涡旋振荡混匀；３７ ℃水浴 ３０ ｍｉｎ，加 ８０ μＬ １００
ｇ ／ Ｌ ＳＤＳ溶液，６５ ℃水浴 １ ｈ；１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０
ｍｉｎ，取上清液进行纯化、沉淀 ＤＮＡ［９］。
提取缓冲液 ＳＤＳ 法：加 ４００ μＬ 提取缓冲液，涡
旋至混匀；加入 ２００ μＬ ２０ ｇ ／ Ｌ ＳＤＳ溶液，上下颠倒混
匀；加入 ７５０ ｍｇ细玻璃珠，涡旋振荡；１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离
心５ ｍｉｎ，取上清液进行纯化、沉淀 ＤＮＡ［１０］。
ＴＥＮＰ 冻融 溶菌酶法：加 ７００ μＬ ＴＥＮＰ 缓冲
液，－ ２０ ℃ １５ ｍｉｎ、 ６５ ℃ ３ ｍｉｎ，反复冻融 ３ 次；
１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ，取上清液①４ ℃保存；将
沉淀悬浮于 １ ｍＬ 溶菌酶溶液，３７ ℃水浴 ２ ｈ；加
７００ μＬ １００ ｇ ／ Ｌ ＳＤＳ溶液，反复颠倒 １ ｍｉｎ 至混匀；
１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ，取上清液②；混合上清液
①②，进行纯化、沉淀 ＤＮＡ［１０］。
提取缓冲液 冻融 溶菌酶法：加 ５００ μＬ 提取缓
冲液，７５０ ｍｇ玻璃珠，涡旋；１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎ，
弃上清；加 ３００ μＬ ＴＥＮＰ 溶液；－２０ ℃、１５ ｍｉｎ、５０ ℃、
２ ｍｉｎ，反复冻融 ３ 次；１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎ，保留
沉淀，上清液①４ ℃保存；向沉淀加４００ μＬ溶菌酶溶
液，涡旋，３７ ℃水浴 ３０ ｍｉｎ；加１５０ μＬ １００ ｇ ／ Ｌ ＳＤＳ溶
液，涡旋；１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取上清液②；混合
上清液①②，进行纯化、沉淀 ＤＮＡ［１０－１１］。
溶菌酶 蛋白酶 Ｋ ＳＤＳ 法：加 ７００ μＬ ＴＥ 缓冲
液，悬浮，加 ３００ μＬ 溶菌酶溶液（５０ ｇ ／ Ｌ）；３７ ℃水
浴，１ ｈ；４ μＬ 蛋白酶 Ｋ 溶液（２０ ｇ ／ Ｌ），６０ μＬ １００
ｇ ／ Ｌ ＳＤＳ溶液，５５ ℃水浴 ３０ ｍｉｎ；１３ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心
１０ ｍｉｎ，取上清液进行纯化、沉淀 ＤＮＡ［１２］。
ＴＥ 超声波法：加 １ ｍＬ ＴＥ 缓冲液，混匀静置
１ ｍｉｎ；超声波功率 ５０ Ｈｚ，时间 ２７ ｓ，间隔 ５ ｓ，重复
５次，冰浴进行裂解；１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３ ｍｉｎ，取上
清液进行纯化、沉淀 ＤＮＡ［１３］。
提取缓冲液 超声波法：加 ６００ μＬ 提取缓冲液，
封口膜密封，涡旋 ５ ｍｉｎ； １００％功率，超声处理
１０ ｍｉｎ；１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３ ｍｉｎ 取上清液进行纯
化、沉淀 ＤＮＡ［１４］。
加与上清液等体积 Ｔｒｉｓ 饱和酚，抽提 ２ 次；加
酚 氯仿 异戊醇（体积比 ２５ ∶２４ ∶１）溶液抽提 １ 次；
加氯仿 异戊醇（体积比 ２４ ∶ １）溶液抽提 １ 次；加
１ ／ １０体积乙酸钠溶液，２倍体积无水乙醇，冰浴沉淀
ＤＮＡ；１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ；５００ μＬ ７０％乙醇洗
涤沉淀 ２次；无水乙醇洗涤沉淀 １次；室温干燥后溶
于 ５０～１００ μＬ ＴＥ缓冲液，加 ３ μＬ ＲＮａｓｅ Ａ溶液，于
２０ ℃下保存所得样品。
１􀆰 ２􀆰 ２　 单因素试验
优化方法：经过以上方法比对所得效果较好的
细胞裂解方法是溶菌酶 蛋白酶 Ｋ ＳＤＳ 法，比较电
泳结果见图 １。 其中，影响其裂解效果的因素有溶
菌酶溶液浓度、ＳＤＳ 溶液浓度、反应时间和反应温
度，以此可进行单因素设计实验，并通过紫外分光
光度法测定 ＤＮＡ 样品的含量。 在进行某个单因素
设计实验时，其余因素均按照原实验设计进行。
Ｍ—ＤＬ２０００ 标准 ＤＮＡ；１—ＳＤＳ法；２—ＴＥＮＰ 法；３—ＮａＣｌ溶液 提取缓冲液 溶菌酶 ＳＤＳ法；４—蛋白酶 Ｋ ＳＤＳ法；５—酶法；
６—提取缓冲液 ＳＤＳ法；７—ＴＥＮＰ 冻融 溶菌酶法；８—提取缓冲液 冻融 溶菌酶法；９—溶菌酶 蛋白酶 Ｋ ＳＤＳ法；１０—ＴＥ 超声波法；
１１—提取缓冲液 超声波法
图 １　 １１种方法获得环氧丙烷皂化废水活性污泥基因组 ＤＮＡ凝胶电泳分析
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｓｌｕｄｇｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ １１ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ ｅｐｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ ｓａｐｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ
４４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 １１种方法提取 ＤＮＡ结果
１１种方法所得的 ＤＮＡ 琼脂糖凝胶电泳结果见
图 １。 由图 １可知：ＮａＣｌ溶液 提取缓冲液 溶菌酶
ＳＤＳ法、酶法、提取缓冲液 ＳＤＳ 法能够提取出基因
组 ＤＮＡ，而仅有提取缓冲液 溶菌酶 ＳＤＳ 法、酶法
电泳结果较为理想，出现宏基因组的亮带，其余方
法没有提取出 ＤＮＡ 或者提取的量过低以至于无法
出现亮带。 其中提取缓冲液 溶菌酶 ＳＤＳ 法获得
的基因组 ＤＮＡ的电泳条带亮且弥散程度低，说明提
取的效果较好；而酶法虽然也得到基因组 ＤＮＡ，但
是电泳存在明显的弥散现象。 于是选取提取缓冲
液 溶菌酶 ＳＤＳ法作为进一步优化的对象。
２􀆰 ２　 单因素试验结果
针对溶菌酶溶液质量浓度、ＳＤＳ溶液质量浓度、
反应时间和反应温度 ４ 个因素进行单因素试验，每
个影响因素 ４ 个水平。 紫外分光光度法测 ＤＮＡ 样
品在 ２６０ ｎｍ 波长处的吸光度，以蒸馏水作为参考
物［１５］。 由表 １ 可知：当溶菌酶 １０ ｍｇ ／ ｍＬ、ＳＤＳ １００
ｇ ／ Ｌ、溶菌酶作用时间 ３０ ｍｉｎ 和反应温度 ４５ ℃时，
提取出的总 ＤＮＡ的量最多。
表 １　 不同影响因素设计及结果
Ｔａｂｌｅ １　 Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｆａｃｔｏｒｓ
因素 水平 ＯＤ２６０
ρ（溶菌酶） ／ （ｍｇ·ｍＬ－１）
１０ ０􀆰 ２４１
１５ ０􀆰 １６４
２０ ０􀆰 １８１
２５ ０􀆰 ２１６
ρ（ＳＤＳ） ／ （ｇ·Ｌ－１）
２０ ０􀆰 ０９５
５０ ０􀆰 ０８７
１００ ０􀆰 ２２７
２００ ０􀆰 １１６
反应时间 ／ ｍｉｎ
１５ ０􀆰 １５３
３０ ０􀆰 １７９
４５ ０􀆰 １５１
６０ ０􀆰 １５９
反应温度 ／ ℃
３５ ０􀆰 １５５
４０ ０􀆰 １５７
４５ ０􀆰 １６４
５０ ０􀆰 １３２
２􀆰 ３　 最佳提取条件下提取总 ＤＮＡ
综合单因素试验结果得出：溶菌酶质量浓度为
１０ ｍｇ ／ ｍＬ、ＳＤＳ １００ ｇ ／ Ｌ、溶菌酶作用时间为 ３０ ｍｉｎ、
反应温度为 ４５ ℃是提取环氧丙烷皂化废水中活性
污泥微生物总 ＤＮＡ的最佳条件，在此条件下提取获
得基因组 ＤＮＡ，其琼脂糖凝胶电泳结果如图 ２
所示。
Ｍ—ＤＬ２ ０００标准 ＤＮＡ；１—样品
图 ２　 最佳条件下提取的基因组 ＤＮＡ凝胶电泳图
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ
ｂｙ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
以上实验结果，为提取环氧丙烷皂化废水的活
性污泥总 ＤＮＡ提供了可靠的方案，为今后环氧丙烷
皂化废水中活性污泥的宏基因组研究奠定基础［１６］。
３　 结论
从环氧丙烷皂化废水的活性污泥中提取 ＤＮＡ
的各种方法的差别在于细胞破壁的方式不同。 通
过对 １１种不同细胞破壁方法的比较，获得了提取环
氧丙烷皂化废水活性污泥总 ＤＮＡ 的最佳方案，即
ＮａＣｌ溶液 提取缓冲液 溶菌酶 ＳＤＳ 法。 单因子试
验结果表明：溶菌酶 １０ ｍｇ ／ ｍＬ、ＳＤＳ １００ ｇ ／ Ｌ，反应
时间 ３０ ｍｉｎ、反应温度 ４５ ℃，提取的环氧丙烷皂化
废水的活性污泥细菌 ＤＮＡ的量最多，电泳图显示有
大片 ＤＮＡ片段存在且拖带较少。
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（责任编辑　 荀志金）
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（责任编辑　 荀志金）
６４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷