全 文 ：第24卷 第2期
2012年2月
Vol. 24, No. 2
Feb., 2012
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2012)02-0169-05
L-谷氨酸氧化酶的研究进展
毕春元1*，李　玲2，李敬龙2
(1 山东省科学院生物研究所，山东省生物传感器重点实验室，济南 250014；
2 山东轻工业学院食品与生物工程学院，济南 250353)
摘　要：L-谷氨酸氧化酶 (L-glutamate oxidase, GLOD)是一种以 FAD为辅基的黄素蛋白酶类，可以专一性
地氧化谷氨酸生成过氧化氢、氨和 α-酮戊二酸，广泛应用于食品、医药、发酵等领域。从谷氨酸氧化酶的
微生物来源、酶学性质、发酵条件、分离纯化及分析应用等方面进行阐述，并对其研究前景进行展望。
关键词：谷氨酸氧化酶；酶学特性；表达条件；分离纯化；应用；研究前景
中图分类号： Q554+.4 文献标志码：A
Research progress on L-glutamate oxidase
BI Chun-Yuan1*, LI Ling2, LI Jing-Long2
(1 Key Laboratory for Biosensors of Shandong Province, Biology Institute of Shandong Academy of Sciences, Jinan
250014, China; 2 School of Food and Bioengineering, Shandong Institute of Light Industry, Jinan 250353, China)
Abstract: L-glutamate oxidase (GLOD) is a flavin protease with FAD for cofactor, and specifically catalyzes the
reaction that one mole of L-glutamic acid was converted to one mole of hydrogen peroxide, α-ketoglutaric acid and
ammonia with the consumption of one mole of oxygen and water. It has been widely used in the area of food,
medicine, fermentation, etc. In this overview, several research aspects of GLOD are summarized, including
microbial sources, enzymatic properties, fermentation conditions, purification and analytical applications of the
enzyme. In addition, the research prospects of the L-glutamate oxidase are proposed.
Key words: L-glutamate oxidase; enzymatic properties; express conditions; purification; application; research
prospect
收稿日期：2011-08-10； 修回日期：2011-10-09
*通信作者：E-mail：bichunyuan@163.com；Tel：
13065082327
L-谷氨酸氧化酶 (L-glutamate oxidase, GLOD)
是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD)为辅基的黄
素蛋白酶类，可以专一性地氧化谷氨酸生成过氧化
氢、氨和 α-酮戊二酸。GLOD对催化反应底物有
高度的立体异构选择性，催化效率高，反应条件温
和，已被广泛用于食品、轻工、化工、医药、环保、
能源和科研等各个领域。该酶自 20世纪 80年代被
发现以来，一直是工具酶研究的热点之一。现阶段
酶的主要研究集中在，一是借由现代的观察及测定
手段研究酶的结构以及作用机制，二是利用酶的特
性以及工程学的方法研究如何利用酶来服务于人类
的生产、生活。本文对 GLOD的来源、生物学特性、
表达条件及分离纯化的研究现状及其应用进行了综
述，并对其应用前景进行展望。
1　谷氨酸氧化酶的来源及生物学特性
自 20世纪 40年代开始，人们就从鼠肾、蛇毒
液、无脊椎动物和微生物等不同来源中分离得到 L-
氨基酸氧化酶，它们能使多种氨基酸脱氨，却几乎
不作用于 L-谷氨酸。
1974年，Jurtshuk和 McManus从维涅兰德固
氮菌的膜制备物中观察到了 GLOD活性，但他们得
到的粗提酶除能作用于 L-谷氨酸外，还能催化其
他几种 D-氨基酸，因此该酶根本不属于 GLOD的
生命科学 第24卷170
范畴 [1]。真正意义上的 GLOD是在 1983年由 Kamei
等 [2]发现，他们在浅紫链霉菌发酵上清液中发现了
一种能专一催化谷氨酸产生 α-酮戊二酸、氨和过
氧化氢的 GLOD，经进一步研究表明，该酶相对分
子质量约为 60 000，具有黄素蛋白的特征吸收光谱，
并且不需要外源性辅助因子参与作用，但该酶对 L-
谷氨酸、L-谷氨酰胺和 L-组氨酸均有作用，专一
性不强。
同时代的 Kusakabe等 [3]从链霉菌 X-119-6菌
株中分离出另一种特异性更好的 GLOD，研究显
示，它除能催化 L-谷氨酸外，仅对 L-天冬氨酸有
微弱的催化作用。当以 L-谷氨酸为底物时，其 Km
值为 2.1 × 10-4 mol/L，相对分子质量为 140 000，等
电点 (pI)为 5.2。该酶耐热，在 pH = 5.5的条件下，
65 ℃加热 15 min不失活；85 ℃加热 15 min，活性
仍能保留 47%。
随后，Böhmer等 [4]从内涂链霉菌中首次分离
纯化得到对 L-谷氨酸完全特异的 GLOD，并对其
生物学特性做了初步的研究，其相对分子质量为
90 000，由两个亚基构成，每个亚基含有一个非共
价结合的 FAD。以 L-谷氨酸为底物时，其 Km值为
1.1 × 10-3 mol/L，等电点为 6.2，Ag+和 Hg2+可抑制
该酶的活性。
近年来，国内外科学家先后分别从土壤中分离
到能产生 GLOD的链霉菌、放线菌，并建立了较完
善的液体发酵产酶体系，制备了 GLOD粗品，通过
对其酶学性质进行研究，纯化得到的该酶都具有以
下特性：能专一性地催化 L-谷氨酸生成过氧化氢、
氨和 α-酮戊二酸 [5]，反应方程式如图 1所示：
耐热，Ag+、Hg2+可抑制该酶的活性。
综上所述，自然界中许多微生物都有产 GLOD
的能力，但产酶能力相差较大，经研究显示，其中
链霉菌产酶能力最高，更适合工业生产。目前，
Sigma公司已利用基因工程的方法，将 GLOD的表
达基因转入大肠杆菌中并得到了高效表达，这极大
地提高了 GLOD的产酶水平，为其深入研究及应用
创造了条件。
2　谷氨酸氧化酶发酵条件及分离纯化的研究
发酵生产 GLOD受很多因素影响。除了发酵
菌种选育优良菌株，不可忽视的就是发酵培养基、
发酵工艺条件和参数的优选确定、提取纯化方法以
及设备的选择和确定。近年来，国内外在两方面都
作过积极地研究。
2.1　谷氨酸氧化酶发酵条件的研究
目前，GLOD发酵生产距工业化生产还有很大
距离，这在很大程度上限制了其应用。因此需要进
一步研究其发酵工艺，通过工艺优化，改进发酵培
养基成分和发酵条件，创造适合菌体生长和生物代
谢的最佳条件，充分发挥菌种的生产潜力，显著提
高发酵产量。
优化发酵培养基组成是提高 GLOD产量的首
要步骤。早在 1993年李青山等 [7]就利用静息细胞
培养研究过酶生物合成的影响因素。他们通过正交
试验最终确定了 GLOD液体发酵的最佳产酶条件：
3.0%蔗糖、1.5%淀粉、0.4%硫酸铵、0.4%玉米浆、
0.12%氯化镁、0.05%谷氨酸或 0.1% α-酮戊二酸，
在这一优化发酵培养基中酶产量最高达到 14.6~
14.84 U/mL，比当时国外报道的最好水平还要高很
多。后徐水清和李友荣 [8]相继研究了影响 GOLD
产量的其他因素，如：培养基中添加 0.2%的谷氨
酸时酶生成量最高，三角瓶中含水量为 100%时最
有利于产酶，选用 28 ℃为最适培养温度；在此基
础上其余条件相同培养时间不同，培养到 6 d时酶
活力最高，当继续培养到 8 d时，酶活力显著下降；
此外，Mg2+和 Ca2+能使酶活力比不添加任何无机
盐的培养基增加约 30%。目前。发酵生产 GLOD
的培养条件研究已基本成熟，前人在这方面做的贡
献为该酶的进一步深入研究打下了坚实的基础。
目前，山东省科学院生物研究所利用 Strepto-
myces sp.作为 GLOD的产生菌，优化得到一种新
的发酵培养基：葡萄糖 1.5%、蔗糖 1.5%、硫酸铵
0.6%、氯化镁 0.1%、氯化钾 0.1%、玉米浆 1.0%、
图1 L-谷氨酸氧化酶催化反应方程式
这个反应具有立体异构专一性。当反应体系中
同时存在 D型和 L型谷氨酸时，它只作用于 L型
谷氨酸；等电点为 4.3，以 L-谷氨酸为底物时，其
Km值为 5.6×10
-4 mol/L，最适 pH为 4.5~7.5，最适
宜温度为 50 ℃；在 70 ℃条件下作用 60 min全部失
活；酶活不受 FAD和 FMN的影响。
日本的 Ishikawa等 [6]通过 DNA重组技术构建
编码 GLOD的基因。高效表达产生的 GLOD同样
具有底物专一性，它是一种典型的氧化酶而不是脱
氢酶，NAD+、NADP+不能作为该酶的电子受体。
每个酶分子结合大约1~2个FAD，最适pH在6.0~8.5，
毕春元，等：L-谷氨酸氧化酶的研究进展第1期 171
磷酸二氢钠 0.09%、pH 6.7，每个锥形瓶里添加 3%
的固体碳酸钙。28℃，180 rpm/min，培养 48 h，得
到了理想的发酵结果。
2.2　谷氨酸氧化酶分离纯化的研究
GLOD作为一种十分有用的工具酶，近几十年
来受到人们越来越多的重视。但至今国内使用的
GLOD主要是由国外几家公司生产，价格非常昂贵，
主要是该酶的分离纯化问题还未从根本上得到解
决，因而使其应用也受到了限制。
目前为止，GLOD 的分离纯化多采用凝胶
过滤层析、离子交换层析、亲和层析、高压液相
层析等常规柱层析技术。例如 Kusakabe等 [3]用
Streptomyces sp.X-119-6发酵液分离纯化 GLOD，其
纯化步骤依次是硫酸铵沉淀、DEAE纤维素柱层
析、DEAE-Sepharose CL-6B层析及 Sephadex G-200
层析。采用此步骤分离纯化 GLOD的纯化倍数可
达到 984倍，产率为 15.3%。Wachiratianchai等 [9]
从 Strepto-myces sp.18G发酵提取物中分离纯化 GLOD
的步骤依次是硫酸铵分级沉淀、SP-SepharoseFF和
Q- SepharoseFF液相色谱柱、Superdex 200离子交
换层析。纯化倍数达到 990倍，产率为 16.65%，酶
活可达到 152.35 U/mg。
表 1列举了文献中纯化前后酶活与纯化倍数较
高的菌的一些相关数据。目前这方面的研究仍是一
大研究热点。
3　谷氨酸氧化酶的应用
3.1　谷氨酸氧化酶在临床生化检验中的应用
随着研究的深入，人们发现在脑液中谷氨酸是
重要的神经传递物质，其含量在医学上与一些疾病
有关，如谷氨酸含量略高或略低会导致神经系统损
坏。另外，在耳朵的发育过程中，谷氨酸含量与内
耳的发育有一定的关系，谷氨酸含量的不同造成不
同程度的损害。因此，利用 GLOD的以上作用制造
生化检测仪或试剂盒来测定谷氨酸含量，这具有重
要的意义。
血清丙氨酸氨基转氨酶 (ALT)和天冬氨酸氨基
转氨酶 (AST)活性是临床常用的生化检验指标。早
在 1986年，Kamei等 [2]就利用 GLOD为工具酶测
定 Alt和 Ast的荧光分析法，酶促反应原理 [11]如下：
表1 不同来源菌分离纯化前后酶活参数对比
来源菌 纯化前酶活/(U·mg-1) 纯化后酶活/(U·mg-1) 纯化倍数 回收率/% 文献
内涂链霉菌(Streptomyces endus) 0.0024 6.00 2500 21 [4]
X-119-6链霉菌(Streptomyces sp. X-119-6) 0.056 55.10 984 15.3 [3]
18G链霉菌(Streptomyces sp.18G) 0.15 152.36 990 16.65 [9]
浅紫链霉菌(Streptomyces violascens) 0.066 60.3 914 27.5 [10]
该指示反应中以高香草酸为色原，在过氧化物
酶的催化下，H2O2与高香草酸反应形成荧光物质，
在激发波长 315 nm、发射波长 415 nm下测定荧光
强度而得酶活。
李青山等用 GLOD粗品建立了测定 ALT和
AST的分光光度法，指示反应为经典的 Trinder反
应 [12]，即 H2O2与 4-氨基安替比林偶联酚在过氧化
物酶催化下生成红色化合物，比色测定求得 ALT
和 AST活性。另外，在临床生化检测上，GLOD
可以用于测定丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转
移酶和 γ-谷氨酰基转移酶等的活性以及肌酐等的浓
度。20世纪 80年代，冯德荣等利用固定化 GLOD
和过氧化氢电极，研制出测定转氨酶活性的生物
传感分析仪，可分别测定ALT和AST，与美国ABROTT
公司生产的 CLX全自动生化分析仪 [13]测定结果相
比较，相关系数分别为 0.9913和 0.9620。
在医药工业上，GLOD用于测定谷氨酸钠注射
液中谷氨酸钠的含量，使得临床生化检验变的简单
易行，大大节省了人力、物力的消耗。
3.2　谷氨酸氧化酶在生物传感器的应用
从 1962年 Clark和 Lyons最先提出生物传感
器的设想，近 50年来生物传感器技术已成为研究
和工程技术领域一个非常活跃的课题 , 据报道利用
各种酶已成功研制出多种 L-谷氨酸生物传感器，
例如 L-谷氨酸氧化酶、L-谷氨酸脱氢酶、嗜热 L-
谷氨酸脱氢酶等 [14-17]。近年来利用 GLOD作为传感
元件制成酶电极测定谷氨酸在国外已引起广泛关
注。
1995年，Ye等 [18]就使用电子媒介体以及固定
谷氨酸氧化酶研制出微小酶电极，在流体注射分
生命科学 第24卷172
析系统测定 L-谷氨酸显示出较高的准确性和稳定
性。德国的 Scheller等 [19]研制出了基于 GLOD的
酶电极，响应时间短，选择性好，但其线性范围窄，
仅达到 0.8 mmol/L，使其推广应用受到限制；日本
的 Karabe应用集成电路技术研制出 GLOD电极，
线性范围在 5~50 mmol/L，但响应时间长 [20]；李华
清等 [21]以聚乙二醇二缩水甘油醚为交联剂固定辣
根过氧化物酶 (HRP)和 GLOD，制得双酶电流型谷
氨酸传感器；1991年，Vahjen等 [22]利用固定化链
霉菌中的 GLOD，开发了在多种食品原料中测定谷
氨酸的介体酶电极，其线性范围 0.2~2 mmol/L；Chen
等 [23]以 1,12-二氨十二烷为载体、戊二醛为交联剂
将 GLOD共价固定在三醋酸纤维素膜上，与氧电极
组合测定 L-谷氨酸，响应时间少于 3 min，线性范
围在 1.2~8.5 μmol/L；山东省科学院生物研究所利
用固定化 GLOD为作用酶，并以 H2O2电极复合传
感器为关键元件研制的 SBA系列生物传感器，分
辨率为 0.01 mmol/L，测定结果准确，误差小于 2％，
操作方便，分析速度快 [24]。目前以谷氨酰胺水解
酶 -谷氨酸氧化酶复合酶为基础的谷氨酰胺传感
器也已研制成功，这大大拓宽了 GLOD的应用范
围 [24]。近年来有研究发现利用纳米金极佳的比表面
积，高表面自由能，将酶固定在纳米金颗粒表面，
能大大增加固定酶的分子数量，实现信号的放大，
这为谷氨酸传感器的研究提供了一条新的思路 [25]。
目前，生物传感器在发酵工艺、环境监测、食
品工程、临床医学、军事及军事医学等方面得到了
高度重视和广泛应用。例如，味精发酵中采用谷氨
酸传感器测定发酵过程中谷氨酸含量已取代了传统
的分析方法——华勃式呼吸器测定法 [26]，使谷氨酸
分析速度从半小时缩短到一分钟，同时解决了谷氨
酸发酵过程中发酵液及离子交换上清液要求快速测
定谷氨酸含量的问题，稳定了发酵生产，大大提高
了收率。据实验证实使用生物传感分析可以使离交
回收率提高 30%~50%，由此产生的效益相当于使
工厂净增收益 4％ [27]。另外，利用生物传感器测定
酱油制备和食品发酵过程中谷氨酸含量、谷氨酰胺
酶和亮氨酸氨基肽酶活性等指标，达到了节约原酶
和连续监测的目的 [28]。
在最初 15年里，生物传感器主要是以研制酶
电极制作的生物传感器为主，但是由于酶存在稳定
性差且提取困难等弱点，以酶作为敏感材料的传感
器的应用受到一定的限制。随着微生物固定化技术
的不断发展，产生了以微生物活体作为分子识别元
件的微生物电极。
随着在精神疾病及癌症治疗方面的研究越来越
深入，生物传感器在医学方面的应用也逐步被人们
认识，生物医用纳米传感器正成为新的研究热点。
4　前景与展望
酶制剂产业现已成为一个朝气蓬勃的高新技术
产业，特别是进入 21世纪以来，工业酶制剂产业
作为生物技术中最重要的部分得到迅猛发展，目前
国际酶制剂市场保持着 9％的增长速度，我国酶制
剂产业在近 20年发展速度更快。2010年，我国各
种工业酶制剂总产量60多万吨，应用覆盖了洗涤剂、
纺织、酒精、啤酒、味精、有机酸、淀粉糖、制药、
饲料、造纸等诸多工业领域，创造工业附加值数千
亿元。
进入 21世纪后，以基因工程和蛋白质工程为
代表的分子生物学技术不断完善，以及物理学、化
学等多个学科的引入，使酶制剂产业进入了一个崭
新的发展阶段。人们已意识到 GLOD是一种非常有
用的工具酶，但目前其生物学作用机制还不是很清
楚，希望在不久的将来，运用分子生物学方法，对
该酶基因进行克隆、表达及通过结构分析或定点突
变等方法明确其催化机理并进行合理改造，以获得
更符合生理研究和生产应用要求的酶蛋白，能够进
行更深入更广泛的学术研究，在各个领域发挥更新
的用途，也将为工业化生产提供更有利条件。
[参　考　文　献]
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