全 文 ：第 １４卷第 ４期
２０１６年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ． ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０４􀆰 ００５
收稿日期：２０１６－０１－１３
基金项目：江苏省博士后基金（１３０１０３７Ｃ）
作者简介：张岩岩（１９９０—），女，山东聊城人，研究方向：酶固定化与酶催化；韩萍芳（联系人），研究员，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｐｆ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
凹土介孔材料的制备及其固载猪胰脂肪酶
张岩岩，唐　 雷，赵　 萌，李　 亚，韩萍芳
（南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：通过高温加热法，以天然凹土、硅酸钠、氯化铝为原料，十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）为模板剂，在碱性条
件下制备凹土介孔材料，并将其用于固载猪胰脂肪酶（ＰＰＬ）。 通过扫描电子显微镜（ＳＥＭ）、Ｎ２吸附脱附分析仪
（ＢＥＴ）、傅里叶红外光谱（ＦＴ ＩＲ）等手段表征制备的介孔材料。 结果表明：合成的样品具有典型的介孔结构，凹土
表面呈现较大孔径。 凹土介孔材料的比表面积为 １０２􀆰 ２７ ｍ２ ／ ｇ。 实验表明脂肪酶固定化的最适温度为 ２５ ℃，最适
ｐＨ为 ６􀆰 ０，固载 ４ ｈ后固定化脂肪酶的热稳定性、ｐＨ稳定性均优于游离酶。
关键词：凹土；介孔；固载；猪胰脂肪酶
中图分类号：Ｑ８１４􀆰 ２　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０４－００２４－０５
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ
ＺＨＡＮＧ Ｙａｎｙａｎ，ＴＡＮＧ Ｌｅｉ，ＺＨＡＯ Ｍｅｎｇ，ＬＩ Ｙａ，ＨＡＮ Ｐｉｎｇｆａｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｗｅｒｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｖｉａ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ，ｗｉｔｈ ｎａｔｕｒａｌ
ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ，ｓｏｄｉｕｍ ｓｉｌｉｃａｔｅ ａｎｄ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｓ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ ｃｅｔｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ
（ＣＴＡＢ）ａｓ ａ ｔｅｍｐｌａｔｅ ａｇｅｎｔ ｕｎｄｅｒ ａｌｋａｌｉｎｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｍａｔｅｒｉａｌ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｅ
ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ（ＰＰＬ）．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ
（ＳＥＭ），Ｂｒｕｎａｕｅｒ⁃Ｅｍｍｅｔ⁃Ｔｅｌｌｅｒ （ＢＥＴ） ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｓｏｎｓｉｏｎ ｉｓｏｔｈｅｒｍ ａｎｄ Ｆｏｕｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｎｆｒａｒｅｄ
ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＦＴ⁃ＩＲ），ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｓａｍｐｌｅ ｈａｄ ｔｙｐｉｃａｌ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ
ｌａｒｇｅｒ ａｐｅｒｔｕｒｅ ｏｎ ｉｔｓ ｓｕｒｆａｃｅ． Ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｈａｄ ａ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ ｏｆ １０２􀆰 ２７ ｍ２ ／ ｇ． Ｔｈｅ
ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｌｉｐａｓｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｗａｓ ２５ ℃，ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐＨ ｗａｓ ６．Ｔｈｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ
ａｎｄ ｐＨ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ ｗｅｒｅ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ｆｒｅｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｆｔｅｒ ｌｏａｄｉｎｇ ｆｏｒ ４ ｈ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ； ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ； ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ； ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ
　 　 目前，游离脂肪酶催化技术已相对成熟，但它
在高温、强酸、强碱和有机溶剂中反应容易失活，且
存在分离困难、不能重复利用、难以实现连续操作
等缺点。 为克服游离酶反应的不足之处，对游离酶
进行固定化。 与游离酶相比，固定化酶具有稳定性
好、易从反应系统中分离、能重复使用、便于运输和
贮存、有利于生产的连续化和自动化等优点，得到
广泛的应用［１］。 常用固定化方法有吸附法［２］、包埋
法［３］、交联法［４］和共价偶联法［５］。 一般将 ２ 种或以
上方法共同使用，以提高固定化酶的活力。
在固定化过程中酶与载体紧密结合在一起，会导
致酶的构象发生改变，影响固定化后的酶活性［６］。 同
时，固定化载体材料也会影响固定化酶的酶学性质，
为增强酶的活性，提高固定化性能，酶的固定化载体
需要具有高机械强度、耐受化学试剂侵蚀、具有易反
应或易修饰的基团以及适宜的表面特性等特点。 各
种各样的新型载体材料如磁性材料、介孔材料等被用
于酶的固定化技术。 新型载体材料以其本身的性能
及优点使得固定化酶的利用率和活性提高，具有良好
的应用前景。 Ｌｉ等［６］将猪胰脂肪酶（ＰＰＬ）固定在棒
状 ＳＢＡ １５ 上，研究结果表明：ＰＰＬ 被成功的吸附固
定到了 ＳＢＡ １５ 孔道内，而且吸附了 ＰＰＬ 的 ＳＢＡ
１５ 仍能保持其有序的介孔结构。
硅酸盐黏土具有特定的链层状多孔结构，该结
构赋予其许多优良的性质，如力学强度高、热稳定
性好及良好的吸附性能。 Ｙａｎｇ 等［７］选用了硅藻土
为载体，将脂肪酶 Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ 进行了固定化，加
入甲基丙烯酰氧基丙基、辛基、十二烷基等与载体
反应，调节材料表面亲疏水性，优化反应工艺，结果
发现甲基丙烯酰氧基丙基改性的载体固定化酶酶
活为游离酶的 ７􀆰 ９ 倍，固定化酶重复使用 ２０ ｄ 后，
残余活性为初始活性的 ７６％。
本文中，笔者以廉价凹土作为原材料，选取无机
柱撑的方式制备凹土介孔材料，并对载体的性能和结
构进行了表征分析，同时对固定化酶的最适条件及
ｐＨ稳定性、储存稳定性等理化性质进行了探讨。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
凹凸棒黏土（７４ μｍ，含预处理），江苏澳特邦非
金属矿业有限公司； ＮａＨＣＯ３、 ＮａＯＨ、 Ｎａ２ ＨＰＯ４、
ＮａＨ２ＰＯ４（ＡＲ），广东汕头西陇化工厂；ＦｅＣｌ３·６Ｈ２Ｏ
（ＡＲ）、聚乙烯醇（ＰＶＡ；１７５０），国药集团化学试剂
有限公司；十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ，ＡＲ），上
海研生实业有限公司；猪胰脂肪酶（ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ
ｌｉｐａｓｅ，纯度 ９８％，ＢＲ），南京奥多福尼生物技术有限
责任公司。
１􀆰 ２　 仪器
ＧＬ ２１Ｍ型离心机，上海离心机械研究所；８５
１型磁力搅拌器，金坛医疗设备厂；ＤＺＦ ６０００ 型真
空干燥箱，上海博迅实业有限公司；Ｎｅｘｕｓ ６７０ 傅里
叶红外光谱仪，美国 Ｎｉｃｏｌｅｔ 公司；ＪｓＭ ６７００Ｆ 型冷
场发射扫描电子显微镜，美国 ＪＥＯＬ公司。
１􀆰 ３　 Ｎａ 天然凹土的制备
Ｎａ 天然凹土的制备参照文献［８］。 ５０ ｇ 天然
凹土加入到 １ ０００ ｍＬ蒸馏水中，然后加入 ２００ ｇ 钠
型离子交换树脂，搅拌 ２４ ｈ 后，将树脂从悬浮液中
分离出来，在 １２０ ℃蒸发干燥 ２４ ｈ，即得钠天然凹
土，命名 Ｎａ Ｌ。
１􀆰 ４　 凹土介孔材料的合成
取 ４ ｇ Ｎａ Ｌ加入到 １１０ ｍＬ蒸馏水中，然后边
搅拌边加入 １４􀆰 ２１ ｇ Ｎａ２ＳｉＯ３·９Ｈ２Ｏ和 ０􀆰 ６ ｇ ＡｌＣｌ３·
６Ｈ２Ｏ，得悬浮液。 取 ９􀆰 １１ ｇ ＣＴＡＢ加入到 ５０ ｍＬ 蒸
馏水中，边加边搅拌，反应几小时直到获得胶状溶
液。 然后在剧烈搅拌的条件下缓慢向胶状溶液中
加入制备好的悬浮液，之后逐滴加入体积分数 ５０％
的 Ｈ２ＳＯ４ 溶液，将 ｐＨ调至 １１，室温下搅拌 １０ ｈ。 将
合成溶液转到 ２５０ ｍＬ圆底烧瓶，在冷凝回流的条件
下加热 ２􀆰 ５ ｈ。 冷却至室温，过滤样品，去离子水洗
涤，然后再 １２０ ℃下烘干 ２４ ｈ，得到样品 ｓ ＬＷＳ。
ｓ ＬＷＳ样品在 ５５０ ℃ （温度以 ２ ℃ ／ ｍｉｎ 的速率上
升至 ５５０ ℃）下焙烧，并维持 ５５０ ℃１０ ｈ，所得样品
为 ｃ ＬＷＳ。
１􀆰 ５　 凹土介孔材料的表征
采用扫描电子显微镜（ＳＥＭ）、傅里叶红外光谱
（ＦＴ ＩＲ）、Ｎ２吸附脱附分析仪（ＢＥＴ）对凹凸棒凹土
介孔材料的结构和性能进行分析表征。
１􀆰 ６　 脂肪酶的固定化
向 １００ ｍＬ具塞三角烧瓶中加入 ４０ ｍＬ 磷酸缓
冲液、８０ ｍｇ 猪胰脂肪酶、制备的凹土介孔材料 ８０
ｍｇ。 一定温度下，在转速为 １１０ ｒ ／ ｍｉｎ 的恒温水浴
振荡器中固定化一定时间后取出，于 ５ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离
心机离心 １０ ｍｉｎ，缓冲溶液洗涤 ３ 次，抽滤，固体置
于真空冷冻干燥机中干燥 ５ ｈ，得到固定化酶，于 ４
℃保存。
１􀆰 ７　 脂肪酶活力的测定
在温度为 ３７ ℃的条件下，按照橄榄油水解
法［９－１０］测定酶活力。 每分钟酶催化底物水解释放出
１ μｍｏｌ脂肪酸所需的酶量为 １ Ｕ。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 凹土介孔材料的表征结果
２􀆰 １􀆰 １　 ＳＥＭ表征
为考察制备的凹土介孔材料的表面孔径状态，
对其进行了 ＳＥＭ表征，结果如图 １ 所示。 由图 １ 可
以看出：天然凹土呈纤维结构，为直线，且表面相对
５２　 第 ４期 张岩岩等：凹土介孔材料的制备及其固载猪胰脂肪酶
光滑，孔径较小。 凹土介孔材料呈网状纤维结构，
表面粗糙且有明显的较大孔。 正如预期的，凹土材
料的表面被明显地改变，且相对于未改性前的原材
料表现出更紧密更粗糙的表面。 这是因为低相对
分子质量表面活性剂 ＣＴＡＢ 调控柱撑凹土，经过高
温焙烧得到的凹土介孔材料片层表面发生了变化。
图 １　 天然凹土材料和凹土介孔材料 ＳＥＭ照片
Ｆｉｇ􀆰 １　 ＳＥＭ ｉｍａｇｅｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ
２􀆰 １􀆰 ２　 ＦＴ ＩＲ表征
为了了解柱撑及焙烧后凹土基团的信息，对其进
行了红外谱分析，结果见图 ２。 由图 ２可以看出：样品
（ｂ）在 ３ ３８５、１ ６３９、１ ０１５和 ７８０ ｃｍ－１附近都有出峰，
其中在 ３ ３８５ ｃｍ－１附近的出峰是 Ｓｉ—ＯＨ的特征带和
凹土内部吸附水的羟基震动引起的；１ ６３９ ｃｍ－１是水
分子变形振动吸附吸收峰［１１］；１ ０１５ 和 ７８０ ｃｍ－１为
Ｓｉ—Ｏ—Ｓｉ反振动伸缩对称的特征吸收峰。 而样品
（ａ）在 ２ ８５０、２ ９１７和 １ ４９０ ｃｍ－１附近还有 ３个峰，为
表面活性剂烷基链的特征吸收峰，在焙烧过的样品
中，这样的吸收峰消失了。 由此可知图 ２ 表明，柱撑
凹土在经过焙烧后，２ ８５０、２ ９１７和１ ４９０ ｃｍ－１的吸收
峰消失了，而其他的吸收峰没有变化，这说明柱撑样
品被有效地消除了，这与 Ｊｉａｎｇ 等［８］的研究结果一致。
图 ２　 柱撑过的凹土（ａ）和焙烧后的
凹土（ｂ）的红外光谱
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＦＴ⁃ＩＲ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｌｕｍｎ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ
ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ （ａ） ａｎｄ ｒｏａｓｔｅｄ ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ（ｂ）
２􀆰 １􀆰 ３　 ＢＥＴ表征
为考察凹土介孔材料的孔径及大小，对其进行了
等温吸附 脱附表征，表征曲线见图 ３。 由图 ３可知：
凹土介孔材料的吸附 脱附等温曲线类型是 Ｌａｎｇｍｕｉｒ
ＩＶ型曲线［１２］。 吸附等温线和脱附等温线在最初时是
重合的，当相对压力达到一定数值时，两条曲线的趋
势发生了变化，并出现了 Ｈ３型的滞后环。 相对压力
在 ０􀆰 ５５时曲线出现变化，这可以说明载体中存在介
孔［１３］。 若能有一种酶的尺寸和凹土介孔材料的平均
孔径相似，就可以增加其固载率，而猪胰脂肪酶的尺
寸和凹土介孔材料的平均孔径大小相近，所以酶很容
易进入凹土介孔材料的孔道中，凹土介孔材料有较高
的比表面积（１０２􀆰 ２７ ｍ２ ／ ｇ），固载率得到提高，比 Ｚｈａｏ
等［１４］研究的以化学法合成的介孔材料的比表面积
（４８􀆰 ５ ｍ２ ／ ｇ）高。
图 ３　 凹土介孔材料吸附 脱附等温曲线
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｎ２ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ⁃ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｓｏｔｈｅｒｍｓ ｏｆ
ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ
２􀆰 ２　 脂肪酶固定化条件的研究
２􀆰 ２􀆰 １　 固载时间的确定
依据固定化的方法，考察固载时间对酶固定化
的影响，结果如图 ４所示。 由图 ４可知：在固载的前
４ ｈ，比酶活和固载率都随时间的延长而增加；当固
载时间为 ４ ｈ时，酶活和固载率都达到最大值；在固
６２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
载 ４ ｈ之后，酶活和固载率随着固载时间的延长而
下降。 这说明在反应开始阶段（４ ｈ 内），脂肪酶通
过吸附快速结合到载体上，而随着载体上可结合位
点数量的减少，吸附速度明显下降，超过一定时间后
（４ ｈ），载体表面可结合位点已基本上被酶所覆盖，由
于空间位阻的存在，即使还存在一些结合位点，蛋白
基本上无法被继续吸附，因而随着时间的延长也不会
使固定化酶活继续得以提高。 在 ４ ｈ 内，猪胰脂肪酶
分子与凹凸介孔材料可能是通过范德华力和疏水作
用相结合，在载体表面和孔道形成单分子层吸附，使
得酶的活性中心暴露出来，表现出最大的酶活［１５］。
故可以确定固载时间为 ４ ｈ最佳。
图 ４　 固载时间对酶固定化的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｉｍｅ ｏｎ ＰＰＬ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
２􀆰 ２􀆰 ２　 固载温度的确定
依据固定化的方法，考察固载温度对酶固定化
的影响，结果如图 ５所示。 由图 ５可知：虽然固载温
度升高，但固载率变化很小，比酶活在 ２５ ℃时达到
最大。 这可能是由于温度的升高致使分子运动加
快和功能团的振动频率加大，传质动力加大，有利
于材料吸附脂肪酶。 在固定化的过程中，由于温度
的升高，固定化酶子分运动加剧，蛋白质的构象发
生了变化，部分脂肪酶分子发生不可逆失活，固定
化脂肪酶的活力损失力度加大，故温度不宜过高。
温度在 ３０ ℃的时候，酶的活性下降明显，所以本实
验固载温度选择室温 ２５ ℃。
２􀆰 ２􀆰 ３　 体系 ｐＨ的确定
固定其他条件，考察 ｐＨ对固定化酶比酶活的影
响，结果如图 ６所示。 由图 ６可知：ｐＨ对酶活性的影
响和对固载率的影响是相似的，ｐＨ为６􀆰 ０时，比酶活和
固载率都达到最大，ｐＨ大于 ６􀆰 ０时呈明显下降趋势。
这一现象是由蛋白质的两性电离性质决定的。 载体孔
道内表面由于带负电荷使其 ｐＨ比蛋白质溶液小［１６］。
ＰＰＬ的等电点为 ５􀆰 ０［１７］。 当溶液 ｐＨ为 ５􀆰 ０～６􀆰 ０时，载
图 ５　 温度对酶固定化的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ＰＰＬ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
体孔道 ｐＨ小于酶分子等电点，所以孔道内的脂肪酶带
正电荷并随着 ｐＨ的增加而逐渐减少为零，酶分子之间
的库伦力随之变弱，在载体的内表面形成较紧密的单
层排列［１８］。 在溶液 ｐＨ等于 ６􀆰 ０时，可能是酶分子所
带电荷为 ０，酶分子之间斥力为 ０，酶活较高。 当 ｐＨ大
于 ７􀆰 ０时，可能是载体孔道 ｐＨ大于酶分子等电点，酶
分子带负电荷，脂肪酶和载体内表面都带负电荷而相
互排斥，固载率下降，比酶活变低［１５］。
图 ６　 ｐＨ对酶固定化的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ＰＰＬ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
２􀆰 ３　 固定化酶的热稳定性
将制备好的固定化酶和游离酶放置 ６０ ℃环境
中考察高温对酶活的影响，并以各自未处理的初始
酶活力为 １００％计，结果见图 ６。 由图 ６ 可知：随着
６０ ℃温浴时间的延长，固定化酶和游离酶的酶活都
呈下降趋势。 经 ６ ｈ 高温保存，固定化酶保留初始
酶活的 ５１％，游离酶活保留初始酶活的 １９％，可说
明固定化酶的剩余酶活高于游离酶。 这表明固定
化酶具有更好的热稳定性，其原因可能是部分脂肪
酶进入材料的介孔中，使得其在高温中的空间构象
得到孔道的束缚，酶活得以保留。
２􀆰 ４　 固定化酶的重复使用性
在 ｐＨ ６􀆰 ０、温度 ２５ ℃的条件下，考察固定化酶
的重复使用性能，结果见图 ８。 由图 ８ 可知：随着使
７２　 第 ４期 张岩岩等：凹土介孔材料的制备及其固载猪胰脂肪酶
图 ７　 高温对固定化酶和游离酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ ｉｎ
ｃｏｍａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｆｒｅｅ ｌｉｐａｓｅ
用次数的增加酶活有所下降，但重复 ７次，酶活仍能
达到原始酶活的 ４２％左右。 这可能是固定化酶的
力学强度较高，使其稳定性提高。 而酶活下降的原
因可能是酶分子与载体仅通过微弱的疏水作用和
范德华力结合，经多次洗涤，酶分子易脱落，造成酶
活部分失活。 整个反应体系在上述优化条件下有
较好的操作稳定性，而且本反应体系反应条件温
和，保持了脂肪酶良好的催化活性。
图 ８　 使用次数对固定化酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｒｅｕｓａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ
３　 结论
以自制凹土介孔材料作载体，用于固定化脂肪
酶的研究，详细研究了脂肪酶固定化的性质，结果
表明：脂肪酶固定化的最适温度为温度 ２５ ℃，最适
ｐＨ为 ｐＨ ６􀆰 ０且固定化脂肪酶的热稳定性、ｐＨ稳定
性均优于游离酶。 制备的凹土介孔材料的固载率
得到较大提升，且载体不需要预先活化，是一种比
较理想的固定化酶的载体。
参考文献：
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（责任编辑　 荀志金）
８２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷