全 文 ：第 １２卷第 ２期
２０１４年 ３月
生 物 加 工 过 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ １２ Ｎｏ ２
Ｍａｒ ２０１４
ｄｏｉ：１０ ３９６９ ／ ｊ ｉｓｓｎ １６７２－３６７８ ２０１４ ０２ ００２
收稿日期：２０１２－１１－１３
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１１ＣＢ７１０８００）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１１ＡＡ０２Ａ２０９）；国家自然科学基
金青年基金（２０９０６０４９）；国家自然科学基金重点项目（２０９３６００２）；南京工业大学自然科学基金；南京工业大学材料化学工程国家重
点实验室开放课题（ＫＬ１０⁃１３）
作者简介：邹 彬（１９８６—），男，湖北荆州人，博士，讲师，研究方向：生物催化；胡 燚（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｕｙｉ＠ ｎｊｔｅｃｈ ｅｄｕ ｃｎ
离子液体修饰的 ＳＢＡ １６材料在猪胰脂肪酶
固定化中的应用
邹 彬，初旭明，张 洋，胡 燚
（南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 ２１１８００）
摘 要：合成了功能化的甲基咪唑类离子液体，并将功能化离子液体修饰介孔材料 ＳＢＡ １６。 以三乙酸甘油酯的
水解为探针反应，考察离子液体修饰的 ＳＢＡ １６ 固定化猪胰脂肪酶（ＰＰＬ） 的酶活、最适反应条件及重复稳定性等
酶学性质。 结果表明：固定化酶对温度的敏感度降低，酶活力及稳定性均显著提高，比酶活是原粉 ＳＢＡ １６ 固定化
酶的 １ ７５ 倍，重复使用 ６次后仍然保持最初活性的 ５７％；与原粉 ＳＢＡ １６ 固定化酶保留的 ３８％相比，有明显的提
高。 同时通过 Ｎ２吸附 脱附、红外光谱和热重等方法分析了离子液体修饰对 ＳＢＡ １６ 结构的影响，结果发现，离子
液体修饰后材料保持了原有的介孔结构，修饰后载体表面性质和结构性质导致了 ＰＰＬ酶学性质的变化。
关键词：固定化；离子液体；介孔材料；脂肪酶；修饰
中图分类号：Ｏ６４３ ３２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０２－０００６－０６
Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ ｏｎ ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄ
ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃａ ＳＢＡ⁃１６
ＺＯＵ Ｂｉｎ，ＣＨＵ Ｘｕｍｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｙａｎｇ，ＨＵ Ｙｉ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ａｎｄ ｇｒａｆｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｏｆ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃａ ＳＢＡ⁃１６
（ＩＬＳＢＡ １６） Ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ（ＰＰＬ） ｗａｓ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＳＢＡ⁃１６
ｍａｔｅｒｉａｌ ｂｙ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ （ ＰＰＬ⁃ＩＬＳＢＡ⁃１６ ） Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｏｐｔｉｍｕｍ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｐＨ ａｎｄ ｒｅｕｓａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＰＰＬ⁃ＩＬＳＢＡ⁃１６， ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｉａｃｅｔｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｐａｒｅｎｔ ＳＢＡ⁃１６ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ（ＰＰＬ⁃ＳＢＡ⁃１６），ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｗｅｒｅ
ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ， ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ２６１ ｔｏ ４５６ Ｕ ／ ｇ ＰＰＬ ａｆｔｅｒ
ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｎ２ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ， ＦＴ⁃ＩＲ ａｎｄ ＴＧ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ
ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｂｅｈａｖｉｏｒｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｂｙ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｃａｒｒｉｅｒｓ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ；ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄ；ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌ；ｌｉｐａｓｅ；ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
固定化酶由于具有容易分离、能够循环使用 及稳定性高等优点，在食品及医药工业领域内得
到了广泛的应用。 通常，固定化酶的催化性能取
决于固定化方法和固定化载体［１－４］ 。 酶的固定化
方法主要分为吸附、共价、包埋及交联等 ４ 大类。
其中，吸附法是利用静电作用、氢键、疏水相互作
用和范德华力作用使酶与水不溶性大分子载体结
合的一种方法。 吸附法的显著优势在于操作简
便、条件温和、不易破坏酶分子的三维结构而影响
活性中心的构象；但是该方法的缺点在于酶与载
体之间的结合不牢固，在使用过程中酶容易从载
体中溢出［５－６］ 。 因此，固定化酶载体材料的选择与
表面修饰至关重要［７－９］。 无机介孔材料 ＳＢＡ １６ 不
仅具有固定化载体所需要具备的机械强度高、化学
稳定性好、易于再生及表面易修饰等优点，而且还
具有允许大分子进入的孔径（２ ～ ５０ ｎｍ）、高的比表
面积（１ ０００ ｍ２ ／ ｇ）、大的吸附容量及三维孔道立体
交叉利于物料传输等特性。 修饰后的载体材料
ＳＢＡ １６独特的表面性质可直接影响其与酶分子之
间的相互作用，从而影响酶的固定化效率以及其体
相孔道的变化，改变酶所处微环境及酶蛋白构象，
从而影响酶的催化活性及稳定性。 通过选择合适
的修饰剂对介孔材料进行表面改性从而提高固定
化酶的酶学性质已成为近年来的研究热点［１０－１２］。
作为一种可以设计的绿色溶剂，离子液体（ ＩＬ）
已经被广泛地应用于生物催化领域，且脂肪酶在离
子液体中往往表现出较高的活性及稳定性［１３－１４］。
笔者拟合成咪唑类离子液体并将其作为酶载
体 ＳＢＡ １６的表面修饰剂，将离子液体修饰的载体
ＩＬＳＢＡ １６对猪胰脂肪酶进行固定化，并考察相关
的条件及固定化酶的相关性质，以期解决传统固定
化介质固定化酶的缺点。
１ 材料与方法
１ １ 药品与试剂
猪胰脂肪酶（ＰＰＬ），购自 Ｓｉｇｍａ 公司并在 ０ ～ ４
℃下保存，酶的蛋白质含量为 ９ ３％，而其最佳比酶
活为 ３６２ Ｕ ／ ｇ（４５ ℃、ｐＨ ７ ５）；１ 甲基咪唑（纯度为
９９％）、（３ 氯丙基）三甲氧基硅烷（纯度为 ９８％），
购自阿拉丁试剂公司；甲苯、四氟硼酸钠（分析纯），
购自国药试剂公司。
１ ２ 实验仪器
试样的 Ｎ２吸附 脱附曲线在 ＡＳＡＰ ２０２０型自动
吸附仪（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ 公司）上测定。 实验前于 ８０
℃ 脱气 １２ ｈ，在液氮温度下进行实验。 利用 ６７０ 型
傅里叶变换红外光谱（ＦＴ ＩＲ） 仪（Ｔｈｅｒｍｏ Ｎｉｃｏｌｅｔ
公司）分别对修饰前后的载体进行分析。 扫描范围
４００～４ ０００ ｃｍ－１， ＫＢｒ 压片。 采用 ＴＧＡ７ 型热重仪
（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ公司）测定载体上负载的离子液体含
量，加热范围为 ５０～ ７００ ℃，升温速率 ５ ℃ ／ ｍｉｎ， 在
２０ ｍＬ ／ ｍｉｎ Ｎ２流中进行。
１ ３ 介孔 ＳＢＡ １６材料的制备与修饰
按文献［１５］方法合成较大孔径介孔材料 ＳＢＡ
１６。 按文献［１６］方法通过两步合成法合成甲基咪
唑类四氟硼酸盐离子液体。 取 ２ ｇ ＳＢＡ １６ 分散在
６０ ｍＬ甲苯中，加入甲基咪唑类四氟硼酸盐离子液
体（１０ ｍｍｏｌ），Ｎ２保护下，于 ９５ ℃ 反应 ２６ ｈ，过滤，
用乙醇、乙醚洗涤，经过 ２４ ｈ二氯甲烷索氏提取后，
烘干，得到功能化离子液体修饰的 ＳＢＡ １６，记为
ＩＬＳＢＡ １６ ［１６］。
１ ４ 脂肪酶的固定化
取 ５０ ｍＬ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ 缓冲液（ｐＨ ７ ０） 置于 １００
ｍＬ 锥形瓶中，加入 ０ ２ ｇ ＰＰＬ，振荡直至完全溶解，
再加入 ０ ６ ｇ 载体（ＳＢＡ １６ 或者 ＩＬＳＢＡ １６），加
塞密封并将其置于摇床中，在 ３０ ℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ 下振
荡 ３ ｈ 之后，将混合物于 ５ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ，
用磷酸缓冲液洗涤沉淀数次，抽滤，固体置于真空
冷冻干燥机中干燥 ６ ｈ，得到固定化酶。
１ ５ 蛋白负载量的测定
按照 Ｂｒａｄｆｏｒｄ的方法，以牛血清蛋白作为标准
蛋白质绘制标准曲线，测定固定化后残液的吸光
值，根据标准曲线计算蛋白浓度。 根据式（１）计算
固定化效率（ＩＹ）。
固定化效率＝（ρｉ－ρｆ） ／ ρｉ× １００％ （１）
式中：ρｉ表示溶液中固定化前酶蛋白的初始质量浓
度（ｍｇ ／ ｍＬ）；ρｆ表示固定化后酶蛋白的最终质量浓
度（ｍｇ ／ ｍＬ） ［１７］。
１ ６ 酶活的测定
取 １０ ｍＬ三乙酸甘油酯乳化液（６ ８３％）于 １００
ｍＬ锥形瓶中，再加入 １５ ｍＬ磷酸盐缓冲液，于 ５０ ℃
预热 ５ ｍｉｎ，然后向其中加入 ０ ２５ ｇ 固定化酶在 ５０
℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ条件下反应 １０ ｍｉｎ，取出。 立即加入
１０ ｍＬ 体积的乙醇终止反应。 使用 ＮａＯＨ 溶液
（０ ０５ ｍｏｌ ／ Ｌ） 滴定，记录 ＮａＯＨ 的消耗量。 在一定
条件下，每分钟酶催化三乙酸甘油酯生成 １ μｍｏｌ 乙
酸所需要的酶量，定义为一个酶活单位（Ｕ）。 比酶
活（Ｕ ／ ｇ）＝固定化 ＰＰＬ的表观酶活 ／ １ ｇ 固定化酶中
ＰＰＬ的含量［１８］。
７ 第 ２期 邹 彬等：离子液体修饰的 ＳＢＡ １６材料在猪胰脂肪酶固定化中的应用
１ ７ 最适温度及最适 ｐＨ
调节反应液缓冲液 ｐＨ 为 ７ ０，分别在 ３５、４０、
４５、５０ 和 ５５ ℃下水浴反应 １０ ｍｉｎ，取出测定酶活。
在各自的最优化温度进行反应，调节反应液的 ｐＨ
分别为 ６ ０、６ ５、７ ０、７ ５ 和 ８ ０ 于水浴反应 １０
ｍｉｎ，取出测定酶活。
１ ８ 重复使用性
取 ０ ２５ ｇ 固定化酶测定酶活，在各自最优化条
件反应 １０ ｍｉｎ 后，取出，抽滤、洗涤，分离所得固定
化酶冷冻干燥 ６ ｈ，用于下一次反应，反复循环使用
６次。 滤液加入 １０ ｍＬ 乙醇，然后用 ＮａＯＨ 溶液
（０ ０５ ｍｏｌ ／ Ｌ ） 滴定测定酶活。 设定初始酶活
为 １００％。
１ ９ 动力学参数的测定
根据经典的米氏方程分别讨论游离酶在固定
化前后的最大反应速率 Ｋｍ及米氏常数 Ｖｍａｘ２个动力
学参数的变化情况。 选用双倒数法求取上述参数，
即根据不同底物质量浓度 ６、 １０、 １６、 ２４ 和 ２７ ２
ｍｇ ／ ｍＬ，在最优化条件下测定游离酶和固定化酶的
催化活力，反应时间为 ３ ｍｉｎ。
２ 结果与讨论
２ １ 介孔材料 ＳＢＡ １６修饰及固定化酶前后的表征
２ １ １ Ｎ２吸附 脱附测试
图 １ 载体 ＳＢＡ １６修饰前后的 Ｎ２
吸附 脱附曲线
Ｆｉｇ １ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ⁃ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｓｏｔｈｅｒｍｓ ｏｆ
ＳＢＡ⁃１６ ａｎｄ ＩＬＳＢＡ⁃１６
采用比表面和孔径吸附测定仪，在液氮温度
下测定离子液体修饰前后载体的等温 Ｎ２吸附 脱
附曲线，结果见图 １。 由图 １ 可知：吸附等温线的
吸附曲线由于发生毛细凝聚现象而逐渐上升，而
脱附曲线在较低的压力下突然下降，造成吸附等
温线和脱附等温线不完全重合，这符合介孔材料
载体的特性，也说明离子液体修饰后没有改变其
孔道特性［１９］ 。
通过 ＢＥＴ（Ｂｒｕｎａｕｅｒ⁃Ｅｍｍｅｔｔ⁃Ｔｅｌｌｅｒ）模型计算载
体在离子液体修饰及固定化前后的比表面积，ＢＪＨ
（Ｂａｒｒｅｔｔ⁃Ｊｏｙｎｅｒ⁃Ｈａｌｅｎｄａ）模型计算载体在固定化前
后的孔径等结构参数，由表 １可知：经离子液体修饰
后，载体的比表面积、孔体积及孔径均有所降低；结
合热重分析结果初步表明，离子液体已修饰到载体
ＳＢＡ １６表面。
表 １ 载体或固定化酶孔径、孔容和比表面积测试结果
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｏｒｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｃａｒｒｉｅｒｓ
试样
比表面积
ＳＢＥＴ ／
（ｍ２·ｇ－１）
孔容 ／
（ｃｍ３·ｇ－１）
孔径 ／
ｎｍ
负载量 ／
（ｍｇ·ｇ－１）
ＳＢＡ １６ ６００ ０ ３８ ５ ６ —
ＰＰＬ ＳＢＡ １６ ５６６ ０ ３５ ５ １ —
ＩＬＳＢＡ １６ ３４７ ０ ２２ ５ １ １９ ５
ＰＰＬ ＩＬＳＢＡ １６ ２８３ ０ １６ ４ ８ —
注：所有试样都在 ８０ ℃脱气 １２ ｈ后再测试。
２ １ ２ ＦＴ ＩＲ红外图谱
图 ２ 载体 ＳＢＡ １６修饰前后的 ＦＴ ＩＲ图谱
Ｆｉｇ ２ ＦＴ⁃ＩＲ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ
ＳＢＡ⁃１６ ａｎｄ ＩＬＳＢＡ⁃１６
图 ２ 为载体以及固定化酶的 ＦＴ ＩＲ 光谱图。
由图 ２ 可知：１ ０８０、７８０ 和 ４７０ ｃｍ－１处的这些明显
的峰是介孔材料中 Ｓｉ—Ｏ—Ｓｉ 骨架结构的特征
峰［２０］ 。 表明经过修饰，介孔材料的骨架结构依然
存在，离子液体修饰和酶的固定化并没有改变骨
架结构。 经离子液体修饰后载体在 ２ ９５３ ｃｍ－１处
出峰可归属为烷基链上 Ｃ—Ｈ 键的伸缩振动峰；离
子液体修饰后的介孔材料具有的峰位：１ ６５３ ｃｍ－１
处的吸收峰可归属为咪唑环 Ｎ—Ｈ键的伸缩振动，
进一步说明烷基功能化离子液体已成功修饰到
ＳＢＡ １６ 上。
８ 生 物 加 工 过 程 第 １２卷
２ １ ３ 热重 ＴＧ曲线测定离子液体修饰量
图 ３是离子液体 ＩＬＳＢＡ １６载体负载量的热重
曲线的分析结果。 由图 ３ 可知：试样 ＩＬＳＢＡ １６ 在
２５０ ℃开始热裂解，６００ ℃分解完毕，根据质量变
化，可以推算出离子液体负载量为 １９ ５ ｍｇ ／ ｇ 修饰
载体。
图 ３ ＩＬＳＢＡ １６载体的热重曲线
Ｆｉｇ ３ Ｔｈｅｒｍａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＩＬＳＢＡ⁃１６ ｔｏ ａｓｓａｙ
ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄ
２ ２ 脂肪酶的固定化时间优化
考察固定化时间对离子液体修饰前后载体对
酶负载量的影响，结果见图 ４。 由图 ４ 可知：酶的负
载量随固定化时间延长而增加。 在 ３ ｈ 达到最大负
载量，而后保持相对稳定的状态。 这说明在 ３ ｈ 后，
载体对脂肪酶处于吸附平衡的状态。
２ ３ 固定化酶的固定化效率及酶活
采用甲基咪唑离子液体修饰的 ＳＢＡ １６材料对
图 ４ 固定化时间对固定化酶负载量的影响
Ｆｉｇ ４ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ
ｏｎ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ＰＰＬ
ＰＰＬ进行固定化，表 ２ 显示了 ＰＰＬ ＳＢＡ １６ 及
ＰＰＬ ＩＬＳＢＡ １６ 固定化效率及酶活。 由表 ２ 可知：
离子液体修饰的 ＳＢＡ １６对 ＰＰＬ 的负载量较高，固
定化效率达 ６０ ３％。 原粉载体上 ＰＰＬ 的负载量降
低明显，为 ３９ ２％。 这可能与载体经过修饰后，载
体表面的疏水性增强，从而有利于载体吸附更多的
酶分子有关。 另外，修饰载体的固定化酶的酶活显
著提高，在各自的最优化条件下反应，ＰＰＬ ＩＬＳＢＡ
１６的相对活力为 ＰＰＬ ＳＢＡ １６ 的 １ ７５ 倍。 酶活
提升很可能因为 ２个原因：①离子液体引入ＳＢＡ １６
表面后，提高了载体表面与酶之间的作用力，猪胰
脂肪酶受到孔道内各种微环境作用力的影响，更多
的活性位被打开；②ＳＢＡ １６表面上的亲 ／疏水基团
有利于底物的吸附传递，加快了底物的传质速度。
表 ２ 固定化酶的负载量和活力
Ｔａｂｌｅ ２ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＰＰＬ
试样
酶固定化 酶活测试
固定化
效率 ／ ％
酶负载量 ／
（ｍｇ·ｇ－１）
固定化酶
比酶活 ／
（Ｕ·ｇ－１）
游离酶
比酶活 ／
（Ｕ·ｇ－１）
相对活性 ／ ％
ＰＰＬ ＳＢＡ １６ ３９ ２ １１５ ３０ ２６１ ７２
ＰＰＬ ＩＬＳＢＡ １６ ６０ ３ １６６ ７６ ４５６ １２６
注：固定化条件是在 ３０ ℃、ｐＨ ７ ０ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ缓冲液中固定 ３ ｈ；反应条件是在最适反应温度和 ｐＨ条件下进行反
应；游离酶比酶活为 ３６２ Ｕ ／ ｇ，被定义为相对活性 １００％。
２ ４ 固定化酶最优温度和 ｐＨ
２ ４ １ 固定化酶最优温度的变化
根据经典酸碱滴定的方法，在不同温度下考察
ＰＰＬ水解三乙酸甘油酯特性，结果见图 ５。 由图 ５
可知：游离猪胰脂肪酶和固定化酶催化反应速率随
温度的变化均呈先上升后下降的“钟型”曲线，最适
反应温度游离酶为 ４５ ℃左右，而修饰载体固定化酶
为 ５０ ℃，相对较高。 并且游离酶对温度变化比较敏
感，这可能是由于酶经固定化后，在固定化载体孔
道形成了一个良好的微环境，与溶液体系温度存在
温度差，因而温度的耐受性有所提高，蛋白质结构
变化减小。 经过表面修饰后的载体固定化酶
９ 第 ２期 邹 彬等：离子液体修饰的 ＳＢＡ １６材料在猪胰脂肪酶固定化中的应用
（ＰＰＬ ＩＬＳＢＡ １６）对温度耐受性曲线相对未修饰
的载体固定化酶（ＰＰＬ ＳＢＡ）在高温区域更加趋于
平缓，该点证明材料的表面离子液体修饰有助于改
善酶的最佳反应温度。
图 ５ 反应温度对酶活的影响
Ｆｉｇ ５ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
２ ４ ２ 固定化酶的最优 ｐＨ变化
酶在溶液中会发生解离作用，酶的解离状态和
行为都会受到体系中 ｐＨ的影响，因而体系中 ｐＨ变
化会对酶转化的效果产生很大的影响。 根据酸碱
滴定的方法，在不同 ｐＨ 条件下考察猪胰脂肪酶的
三乙酸甘油酯水解特性，结果见图 ６。 由图 ６ 可知：
固定化酶 ＰＰＬ ＩＬＳＢＡ １６ 及 ＰＰＬ ＳＢＡ １６ 的最
适反应 ｐＨ均为 ７ ０ 左右，并且酶活在 ７ ０ ～ ８ ０ 之
间变化较小，游离酶最佳 ｐＨ 为 ７ ５，酶活对低方向
ｐＨ的变化更为敏感。
图 ６ 反应 ｐＨ对酶活的影响
Ｆｉｇ ６ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
２ ５ 脂肪酶重复稳定性的测试
ＰＰＬ ＳＢＡ １６ 和 ＰＰＬ ＩＬＳＢＡ １６ 重复使用
性结果见图 ７。 由图 ７ 可知：随着脂肪酶不断重复
使用，固定化酶的酶活均明显下降。 其中 ＰＰＬ
ＳＢＡ １６ 第一次重复使用后固定化酶活力降低的幅
度最大，分别为 ７３％和 ７９％；重复使用 ４ 次后，活性
损失趋于稳定，其相对活力为初始活力的 ４５％和
６１％；且每一次重复使用时，ＰＰＬ ＩＬＳＢＡ １６ 相对
活力均大于 ＰＰＬ ＳＢＡ １６。 由此可见，离子液体
修饰后的载体固定化酶 ＰＰＬ ＩＬＳＢＡ １６ 的重复使
用性能明显提高。 这可能由于离子液体引入到
ＳＢＡ １６载体表面后，增强了酶与载体之间的相互
作用力，从而降低了酶从载体孔道的溢出量。
图 ７ 重复使用次数
Ｆｉｇ ７ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｕｓｅ
２ ６ 脂肪酶动力学常数
选用双倒数法求取游离酶及固定化酶的 Ｋｍ 及
Ｖｍａｘ２个动力学参数，在不同底物浓度下，测定游离
酶和固定化酶的催化活力，分别对底物浓度和酶活
力求倒数，如图 ８所示。
图 ８ 动力学参数曲线
Ｆｉｇ ８ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ａｎｄ ｆｒｅｅ ＰＰＬ
由图 ８ 可知：游离酶 ＰＰＬ 和固定化酶 ＰＰＬ
ＳＢＡ １６及 ＰＰＬ ＩＬＳＢＡ １６的 Ｋｍ及 Ｖｍａｘ可以根据
米氏方程推算出。 Ｋｍ 等于酶促反应速度为最大反
应速度一半时的底物浓度，当 Ｋｍ 值越大，表明酶和
底物之间的亲和能力越弱［２１］。 表 ３ 为游离酶和固
定化酶的动力学参数。 由表 ３可知：固定化酶的 Ｋｍ
相对游离 ＰＰＬ 降低，表明经过固定化过程后，ＰＰＬ
对底物的亲和力变大。 主要原因可能是离子液体
修饰载体表面有助于 ＰＰＬ活性中心盖子被打开，使
反应物更容易进入 ＰＰＬ 的活性中心。 结合实验测
得的最大比活力可以证明上述观点，ＰＰＬ ＩＬＳＢＡ
０１ 生 物 加 工 过 程 第 １２卷
１６的 Ｖｍａｘ达到了 ＰＰＬ的 １ ８３倍。
表 ３ 游离酶和固定化酶的动力学参数
Ｔａｂｌｅ ３ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｋｍ ａｎｄ Ｖｍａｘ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ａｎｄ ｆｒｅｅ ＰＰＬ
试样
Ｖｍａｘ ／
（Ｕ·ｇ－１）
Ｋｍ ／
（ｍｇ·ｍＬ－１）
Ｖｍａｘ ／ Ｋｍ
ＰＰＬ ９０９ ７ ８ １１６
ＰＰＬ ＳＢＡ １６ １ ０００ ３ ４ ２９４
ＰＰＬ ＩＬＳＢＡ １６ １ ６６７ １ ５ １ １１１
３ 结 论
采用功能化离子液体对载体 ＳＢＡ １６ 进行修
饰，并将其应用于 ＰＰＬ 脂肪酶的固定化。 实验证
明，离子液体修饰后的 ＳＢＡ １６载体固定化 ＰＰＬ 的
比活力显著提高，为原粉 ＳＢＡ １６固定化酶的 １ ７５
倍；ＰＰＬ ＩＬＳＢＡ １６ 对温度变化、较低 ｐＨ 的敏感
度降低，重复使用性大幅度提高。 经过动力学常数
测定表明，离子液体修饰的 ＳＢＡ １６ 固定化酶对底
物的亲和力明显增强，脂肪酶活性构象被激活，催
化效果大大提升。
参考文献：
［ １ ］ Ｍｅｎｄｅｓ Ａ Ａ， Ｏｌｉｖｅｉｒａ Ｐ Ｃ， ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ Ｈ Ｆ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ
ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ ［ Ｊ］ ． Ｊ
Ｍｏｌ Ｃａｔａｌ Ｂ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２０１２，７８（１）：１１９⁃１３４
［ ２ ］ Ｌｉｕ Ｘ， Ｌｅｉ Ｌ， Ｌｉ Ｙ， ｅｔ ａｌ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ
ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｇｒａｆｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ
ｌｉｐａｓｅ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｊ，２０１１，５６（３）：１４２⁃１４９
［ ３ ］ Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ Ｈ，Ｔｈöｒｎ Ｃ，Ｈｏｌｍｂｅｒｇ Ｋ Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ ａｎｄ
ｔｒｙｐｓｉｎ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｗｉｔｈ ｖａｒｙｉｎｇ ｐｏｒｅ
ｓｉｚｅｓ ａｎｄ ｐＨ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［ Ｊ］ ．Ｃｏｌｌｏｉｄｓ Ｓｕｒｆ Ｂ Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，２０１１，
８７（２）：４６４⁃４７１
［ ４ ］ Ｃｈａｕ Ｃ Ｍ，Ｌｉｕ Ｋ Ｊ，Ｌｉｎ Ｃ Ｈ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ
ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｂｙ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ［ Ｊ］ ．
Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１１，１０２（２１）：１０１３６⁃１０１３８
［ ５ ］ Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ Ｕ Ｔ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ： ｈｏｗ ｔｏ ｃｒｅａｔｅ ｍｏｒｅ
ｓｕｉｔａｂｌｅ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ ［ Ｊ］ ． Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ，２００３，４２ （ ２９）：
３３３６⁃３３３７
［ ６ ］ Ｌｕ Ｓ，Ｈｅ Ｊ，Ｇｕｏ Ｘ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ
ｓｉｌｉｃａ⁃ｌｉｐａｓｅ ｈｙｂｒｉｄｓ ｖｉａ ｎｏｎ⁃ｃｏｖａｌｅｎｔ ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ［Ｊ］ ．
ＡＩＣｈＥ Ｊ，２０１０，５６（２）：５０６⁃５１４
［ ７ ］ Ｑｕｉｒóｓ Ｍ， Ｇａｒｃíａ Ａ Ｂ， Ｍｏｎｔｅｓ⁃Ｍｏｒáｎ Ｍ Ａ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ
ｓｕｐｐｏｒｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏａｄｉｎｇ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
ｌｉｐａｓｅ ／ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｃａｒｂｏｎ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ［Ｊ］ ．Ｃａｒｂｏｎ，２０１０，４９（２）：
４０６⁃４１５
［ ８ ］ Ｌａｓｚｌｏ Ｊ Ａ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｍ，Ｂｌａｎｃｏ Ｒ Ｍ Ａｃｔｉｖｅ⁃ｓｉｔｅ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ｌｉｐａｓｅ Ｂ
ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］ ．Ｊ Ｍｏｌ Ｃａｔａｌ Ｂ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２０１１，６９（１ ／ ２）：６０⁃６５
［ ９ ］ Ｌｉ Ｙ，Ｇａｏ Ｆ，Ｗｅｉ Ｗ，ｅｔ ａｌ Ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ
ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ａｆｆｅｃｔｓ ｌｉｐａｓｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｍｏｌ Ｃａｔａｌ Ｂ
Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２０１０，６６（１）：１８２⁃１８９
［１０］ Ｓｏｅｒｅｎｓｅｎ Ｍ Ｈ， Ｎｇ Ｊ Ｂ Ｓ， Ｂｅｒｇｓｔｒｏｅｍ Ｌ， ｅｔ ａｌ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ
ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ ｌｉｐａｓｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ
ｉｎ ａ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｃａｒｒｉｅｒ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｃｏｌｌｏｉｄ
Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ，２０１０，３４３（１）：３５９⁃３６５
［１１］ Ｓｅｒｒａ Ｅ，Ｄｉｅｚ Ｅ，Ｄｉａｚ Ｉ， ｅｔ ａｌ Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｅｒｉｏｄｉｃ
ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｏｒｇａｎｏｓｉｌｉｃａ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ
ｓｉｌｉｃａｓ ｆｏｒ ｌｉｐａｓｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］ ． Ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ Ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ
Ｍａｔｅｒ，２０１０，１３２（３）：４８７⁃４９３
［１２］ Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｓ， Ｐéｒｅｚ⁃Ｒａｍíｒｅｚ Ｊ Ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｚｅｏｌｉｔｅｓ ａｓ ｅｎｚｙｍｅ
ｃａｒｒｉｅｒｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ
［Ｊ］ Ｃａｔａｌ Ｔｏｄａｙ，２０１１，１６８（１）：２８⁃３７
［１３］ Ｍｏｎｉｒｕｚｚａｍａｎ Ｍ，Ｋａｍｉｙａ Ｎ，Ｇｏｔｏ Ｍ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄｓ［Ｊ］ Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１０，８（１３）：
２８８７⁃２８９９
［１４］ Ｋａａｒ Ｊ Ｌ，Ｊｅｓｉｏｎｏｗｓｋｉ Ａ Ｍ，Ｂｅｒｂｅｒｉｃｈ Ｊ Ａ，ｅｔ ａｌ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｉｏｎｉｃ
ｌｉｑｕｉｄ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｎ ｌｉｐａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ［Ｊ］ ．Ｊ Ａｍ
Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，２００３，１２５（１４）：４１２５⁃４１３１
［１５］ Ａｂｕｒｔｏ Ｊ，Ａｙａｌａ Ｍ，Ｂｕｓｔｏｓ⁃Ｊａｉｍｅｓ Ｉ，ｅｔ ａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ
ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ＳＢＡ⁃１６ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ
ｍａｔｅｒｉａｌｓ［Ｊ］ ．Ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ Ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ Ｍａｔｅｒ，２００５，８３（１ ／ ２ ／ ３）：
１９３⁃２００
［１６］ Ｌｏｕ Ｌ， Ｐｅｎｇ Ｘ， Ｙｕ Ｋ， ｅｔ ａｌ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ ｏｆ
ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｃｈｉｒａｌ Ｒｕ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ
ｍａｔｅｒｉａｌ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄ［Ｊ］ ．Ｃａｔａｌ Ｃｏｍｍｕｎ，２００８，９（９）：
１８９１⁃１８９３
［１７］ Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｍ Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ［ Ｊ］ ． Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９７６，７２：
２４８⁃２５４
［１８］ Ｚｏｕ Ｂ，Ｈｕ Ｙ，Ｙｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ
ｌｉｐａｓｅ ｏｎｔｏ ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃａ ＳＢＡ⁃１５［ Ｊ］ ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｊ，２０１０，５３（１）：１５０⁃１５３
［１９］ Ａｂｄｕｌｌａｈ Ａ Ｚ， Ｓｕｌａｉｍａｎ Ｎ Ｓ， Ｋａｍａｒｕｄｄｉｎ Ａ Ｈ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ
ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌ ｗｉｔｈ ｌａｕｒｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ
ｏｎ ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ⁃ｇｒａｆｔｅｄ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ＳＢＡ⁃１５［ Ｊ］ ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｊ，
２００９，４４（２ ／ ３）：２６３⁃２７０
［２０］ Ｈｅ Ｊ，Ｘｕ Ｙ，Ｍａ Ｈ， ｅｔ ａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｌｅａｃｈｉｎｇ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ ｆｒｏｍ
ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｆｔｅｄ ｖｉｎｙｌ ｇｒｏｕｐｓ［Ｊ］ ．
Ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ Ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ Ｍａｔ，２００６，９４（１ ／ ２ ／ ３）：２９⁃３３
［２１］ Ｂａｉ Ｙ Ｘ， Ｌｉ Ｙ Ｆ， Ｙａｎｇ Ｙ， ｅｔ ａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｌｉｐａｓｅ ｏｎｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｎｏｖｅｌ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃａ
ｓｕｐｐｏｒｔｓ［Ｊ］ ．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００６，１２５（４）：５７４⁃５８２
（责任编辑 荀志金）
１１ 第 ２期 邹 彬等：离子液体修饰的 ＳＢＡ １６材料在猪胰脂肪酶固定化中的应用