全 文 ：第 １２卷第 ２期
２０１４年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０２􀆰 ００３
收稿日期：２０１２－１２－１２
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２００９ＣＢ７２４７０）；江苏省普通高校研究生科研创新计划（ＣＸＺＺ１２＿０４４０）
作者简介：胡集铖（１９８８—），男，安徽芜湖人，硕士研究生，研究方向：生物酶固定化及催化；韩萍芳（联系人），研究员，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｐｆ＠ ｎｊｔｅｃｈ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
γ Ｆｅ２ Ｏ３ 凹土超顺磁性纳米复合材料
固载猪胰脂肪酶
胡集铖，王　 欢，李　 亚，韩萍芳
（南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 ２１１８００）
摘　 要：以凹凸棒石黏土为原料，制备 γ Ｆｅ２Ｏ３ 凹土超顺磁性纳米复合材料（γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ）作为猪胰脂肪酶
（ＰＰＬ）固定化的载体，利用透射电子显微镜（ＴＥＭ）、Ｎ２吸附脱附等温图（ＢＥＴ）、振动试样磁强计（ＶＳＭ）等对材料进
行表征，同时对固定化条件和固定化酶的相关性质进行了研究。 结果表明：制备的 γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ 是介孔材料，比
表面积为 １０２􀆰 ６３ ｍ２ ／ ｇ，平均孔径为 １０􀆰 ８６２ ｎｍ，饱和磁化强度为 ８􀆰 ９１５ ｅｍｕ ／ ｇ，其作为载体能实现固定化酶与反应
介质简单、快速分离回收和重复利用。 在固定化时间为 ４ ｈ及 ｐＨ ６􀆰 ０时制备的固定化酶效果最佳；经过 ６ ｈ 高温
保存后固定化酶可保留初始酶活的 ５２％，而游离酶仅保留初始酶活的 １９％，同时固定化酶在重复使用 ５ 次后酶活
仍保留初始酶活的 ６０％。
关键词：凹凸棒石黏土；固定化；介孔；猪胰脂肪酶；超顺磁性
中图分类号：Ｑ８１４􀆰 ２　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０２－００１２－０５
Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ ｏｎ ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ
γ⁃Ｆｅ２Ｏ３⁃ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ
ＨＵ Ｊｉｃｈｅｎｇ，ＷＡＮＧ Ｈｕａｎ，ＬＩ Ｙａ，ＨＡＮ Ｐｉｎｇｆａｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ （ ＰＰＬ） ｗａｓ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ γ⁃Ｆｅ２Ｏ ３ ⁃
ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ （ γ⁃Ｆｅ２ Ｏ ３ ⁃ＡＴＰ ） 􀆰 Ｔｈｅ γ⁃Ｆｅ２ Ｏ ３ ⁃ＡＴＰ ｗａｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｗｉｔｈ
ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ （ ＴＥＭ ） ， ＢＥＴ ａｎｄ ＶＳＭ􀆰 Ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ
ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＰＰＬ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ􀆰 Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ γ⁃Ｆｅ２Ｏ ３ ⁃
ＡＴＰ ｗａｓ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ ｗａｓ １０２􀆰 ６３ ｍ ２ ／ ｇ，ａｖｅｒａｇｅ ｐｏｒｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｗａｓ
１０􀆰 ８６２ ｎｍ， ａｎｄ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ ｗａｓ ８􀆰 ９１５ ｅｍｕ ／ ｇ􀆰 Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｏ ｂｅ ｐＨ ６􀆰 ０ ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ ４ ｈ􀆰 Ｔｈｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ
ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｒｅｅ ｅｎｚｙｍｅ􀆰 Ｔｈｅ ｒｅｓｉｄｕａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ
ｋｅｐｔ ａｔ ５２％ ｆｏｒ ６ ｈ， ｗｈｉｌｅ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒｅｅ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｊｕｓｔ １９％ 􀆰 Ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｋｅｐｔ ａｔ ６０％ ａｆｔｅｒ ５ ｂａｔｃｈ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ􀆰 Ｅｎｚｙｍｅｓ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｏｎ
ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ γ⁃Ｆｅ２Ｏ ３ ⁃ＡＴＰ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｅａｓｉｌｙ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ａｎｄ ｒｅｕｓｅｄ􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ；ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ；ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ；ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ
　 　 脂肪酶因其催化反应的高效性［１－２］、高立体选
择性［３］、反应条件温和等特点备受关注。 然而，游
离酶稳定性差、反应后难以与产品分离、不易重复
利用，这些缺点制约了其在工业生产中的应用。 为
了提高其稳定性和利用效率，酶的固定化逐渐成为
酶工程研究领域的热点。 固定化酶的性能主要取
决于固定化方法和所使用的载体材料。 目前，制备
固定化酶的方法主要有吸附法、共价法、交联法、包
埋法等，其中吸附法因操作简便、条件温和，不会引
起酶失活被广泛使用。 理想的载体则应具备良好
的机械强度、热稳定性、化学稳定性等特点，如二氧
化硅［４－６］、多糖类［７－９］、高分子纳米纤维［１０－１３］、纳米
粒子［１４－１５］等材料已被成功地用于固定化酶。
作为一类纯天然的矿物材料，硅酸盐黏土因具有
价格低廉、比表面积大、孔隙率高、良好的吸附性和生
物亲和性等优点被广泛用于吸附固定化酶。 但是，凹
土等传统载体固定化酶仍然存在从反应体系中分离
较为复杂的缺点。 对传统载体进行功能化修饰是目
前克服该缺点的理想方案之一，如磁性复合载体的制
备与应用。 一方面，在外加磁场作用下，可以使固定
化酶简单地从反应体系分离；另一方面，外部磁场使
固定化酶的运动方式和方向得到控制，替代传统的机
械搅拌，可以提高固定化酶的催化效率。
笔者通过制备 γ Ｆｅ２Ｏ３ 凹土超顺磁性纳米复
合材料（γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ），并将其用于猪胰脂肪酶
的固定化，考察酶固定化条件及固定化酶的性质，
以期为其在工业化方面的应用奠定基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 药品与试剂
猪胰脂肪酶（ＰＰＬ，ＢＲ），南京奥多福尼生物技术
有限责任公司；凹凸棒石黏土（以下简称“凹土”），江
苏澳特邦非金属矿业有限公司；ＮａＨＣＯ３、ＮａＨ２ＰＯ４、
Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＯＨ（均为 ＡＲ），广东汕头西陇化工厂；
ＦｅＣｌ３·６Ｈ２Ｏ（ＡＲ）、聚乙烯醇，国药集团化学试剂有限
公司；橄榄油（化学纯），上海凌峰化学试剂有限公司；
冰醋酸（ＡＲ），上海申博化工有限公司。
１􀆰 ２　 实验仪器
ＤＳＨＺ ３００Ａ 型恒温振荡器，太仓市试验设备
厂；ＧＬ ２１Ｍ型离心机，上海离心机械研究所；７５２紫
外 可见光分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；
开启管式电阻炉，山东省龙口市先科仪器公司；
Ｈ ８００透射电子显微镜，日本日立公司；ＡＳＡＰ２０１０全
自动比表面积及孔径分布测定仪，美国 Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ
公司；振动试样磁强计，Ｌａｋｅｓｈｏｒｅ Ｃｒｙｏｔｒｏｎｉｃ公司。
１􀆰 ３　 γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ的制备与表征
γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ 的制备方法参照文献［１６］的方
法：配制 ０􀆰 ０２ ｍｏｌ ／ Ｌ ＦｅＣｌ３·６Ｈ２Ｏ 溶液，调节 ｐＨ 至
２􀆰 ５并室温搅拌 １ ｈ，再将其缓慢逐滴加到凹土悬浮
液中并不断搅拌，离心得到 Ｆｅ３＋ ＡＴＰ，水洗至无
Ｃｌ－，室温真空干燥后，研磨成粉末。 将试样粉末暴
露于 ８０ ℃ 冰醋酸蒸气中，熏蒸 ３ ｈ后暴露于相同温
度的空气中几分钟，去除表面吸附的冰醋酸，得到
ＦｅＡｃ３ ＡＴＰ。 在 Ｎ２ 保护下 ４００ ℃煅烧 １ ｈ后，即得
到磁性试样 γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ。
透射电子显微镜（ＴＥＭ）表征：将制备好的 γ
Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ 用透射电子显微镜进行观察，研究其表
面形貌特征。
比表面积和孔径分布测定：通过 ＡＳＡＰ２０１０ 全
自动比表面积及孔径分布测定仪测定 γ Ｆｅ２Ｏ３
ＡＴＰ 的比表面积和平均孔径。
磁性能测定：将 γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ 在室温下通过
振动试样磁强计测定其饱和磁化强度。
１􀆰 ４　 脂肪酶的固定化
向 １００ ｍＬ具塞三角烧瓶中加入 ２ ｍｇ ／ ｍＬ酶液
４０ ｍＬ、γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ ８０ ｍｇ，在 ２５ ℃、１１０ ｒ ／ ｍｉｎ恒
温水浴振荡器中固定一定时间以后，取出三角烧
瓶，利用外加磁场使上清液和固定化酶分离。 上清
液中蛋白含量用考马斯亮蓝测定，其减少的蛋白质
量即为 γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ 上所固载的脂肪酶含量。
固载上的酶蛋白量与载体量的比例可以由式
Ｐａ ＝（ρｉ－ρｆ）Ｖ ／ ｍ计算得出。
式中：Ｐａ 为每克载体上固载的酶蛋白的量，
ｍｇ ／ ｇ；ρｉ和 ρｆ分别为反应前和反应后酶溶液的质量
浓度，ｍｇ ／ ｍＬ；Ｖ 为反应液体积，ｍＬ；ｍ 为使用的载
体的质量，ｇ。
１􀆰 ５　 脂肪酶活力的测定
脂肪酶活力的测定以橄榄油为底物，采用直接
酸碱滴定法［１７－１８］。 一个酶活力单位（Ｕ）定义为在
温度为 ３７ ℃的条件下，１ ｈ 从橄榄油中水解产生 １
μｍｏｌ脂肪酸所需的酶量。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ的表征
２􀆰 １􀆰 １　 透射电子显微镜（ＴＥＭ）表征
图 １为制备好的 γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ 用透射电子显
３１　 第 ２期 胡集铖等：γ Ｆｅ２Ｏ３ 凹土超顺磁性纳米复合材料固载猪胰脂肪酶
微镜进行观察的结果。 由图 １ 可知：凹土呈棒状，
γ Ｆｅ２Ｏ３呈黑色球状，平均粒径为 １０ ｎｍ，γ Ｆｅ２Ｏ３
粒子分布在凹土外表面上。 这种分布原因可能是
凹土表面存在一些负电荷和一些暴露出来的可交
换的 Ａｌ３＋、Ｍｇ２＋等阳离子，Ｆｅ３＋通过静电作用和凹土
的离子交换性质结合在凹土表面，经过醋酸熏蒸形
成醋酸铁，煅烧后与凹土形成稳定的复合结构覆盖
在其表面。
图 １　 γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ透射电镜照片
Ｆｉｇ􀆰 １　 ＴＥＭ ｉｍａｇｅｓ ｏｆ ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ γ⁃Ｆｅ２Ｏ３ ⁃ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ
２􀆰 １􀆰 ２　 Ｎ２等温吸附 脱附（ＢＥＴ）表征
γ Ｆｅ２ Ｏ３ ＡＴＰ 等温吸附 脱附曲线为
Ｌａｎｇｍｕｉｒ ＩＶ型曲线（图 ２）。 由图 ２ 可知：在相对压
力达到 ０􀆰 ５左右时，吸附等温线和脱附等温线开始
不重合，出现了 Ｈ３型的滞后环，说明载体中存在介
孔。 经测定 γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ 的平均孔径为 １０􀆰 ８６２
ｎｍ与猪胰脂肪酶尺寸相似，使得脂肪酶很容易进入
其孔道中。 γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ 有较高的比表面积为
１０２􀆰 ６３ ｍ２ ／ ｇ ，较 Ｚｈａｏ 等［１９］ 化学法合成的 ４８􀆰 ５
ｍ２ ／ ｇ高，使得固载率提高。
图 ２　 γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ吸附 脱附等温曲线
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｎ２ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ⁃ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｓｏｔｈｅｒｍｓ ｏｆ
ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ γ⁃Ｆｅ２Ｏ３ ⁃ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ
ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ
２􀆰 １􀆰 ３　 振动试样磁强计（ＶＳＭ）表征
图 ３为 γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ 在室温下表现出超顺磁
性特征结果。 由图 ３ 可知：当外界有磁场时载体能
够迅速被磁化且有较强磁性，当外界磁场消失时载
体的磁性能够迅速随之消失。 这种性质有利于载
体从反应介质中分离，载体不会因磁化而团聚，有
利于载体的重新分散。 经测定，γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ 的
饱和磁化强度为 ８􀆰 ９１５ ｅｍｕ ／ ｇ，较 Ｂｏｕｒｌｉｎｏｓ 等［１６］磁
性蒙脱土 １􀆰 ７５ ｅｍｕ ／ ｇ 高，能够迅速响应外界磁场，
使得 γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ 在使用过程中易于在外界磁场
的作用下分离，这一点对固定化酶的回收和重复利
用极为重要。
图 ３　 γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ磁滞回线
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｈｙｓｔｅｒｅｓｉｓ ｌｏｏｐ ｏｆ ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ
γ⁃Ｆｅ２Ｏ３ ⁃ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ
２􀆰 ２　 脂肪酶固定化条件的研究
２􀆰 ２􀆰 １　 固定化时间的确定
图 ４ 是在 ｐＨ ７􀆰 ０ 的磷酸缓冲液中考察固载时
间对固定化酶活的影响结果。 由图 ４ 可知：在 ４ ｈ
之前酶活和固载率随着时间的延长而增大，当时间
４１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
为 ４ ｈ时酶活和固载率都达到最大。 猪胰脂肪酶分
子与 γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ 可能是通过范德华力、疏水作
用相结合，在载体表面和孔道形成单分子层吸附，
使得酶的活性中心能够充分暴露出来，表现出较大
的酶活［２０］。 ４ ｈ之后，酶活和固载率随时间延长下
降。 可能一方面是脂肪酶与载体之间仅通过微弱
的物理作用相结合，经过长时间摇床固载后，使其
又回到溶液中去，导致酶活下降。 另一方面可能是
因为固载环境不是无菌的，固载后期酶液中有 Ｈ２Ｓ
的气味即是被细菌分解所致。
图 ４　 时间对酶固定化的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｉｍｅ ｏｎ ＰＰＬ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｏｎ γ⁃Ｆｅ２Ｏ３ ⁃ＡＴＰ
２􀆰 ２􀆰 ２　 体系 ｐＨ的确定
图 ５　 ｐＨ对酶固定化的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ＰＰＬ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｏｎ γ⁃Ｆｅ２Ｏ３ ⁃ＡＴＰ
图 ５是在其他条件不变的情况下，考察体系 ｐＨ
对固定化酶活的影响结果。 由图 ５ 可知：当 ｐＨ 为
６􀆰 ０时酶活和固载率最大，在 ｐＨ值超过 ７􀆰 ０ 后酶活
和固载率急剧下降。 这可能是因为蛋白质在溶液
中有两性电离现象，当溶液 ｐＨ 值低于蛋白质等电
点时，蛋白质带正电，反之蛋白质带负电。 载体孔
道内表面由于带有负电荷使其 ｐＨ 值比溶液中
小［２１］。 ＰＰＬ 的等电点为 ５􀆰 ０［２２］。 当溶液的 ｐＨ 在
５􀆰 ０～６􀆰 ０之间时，由于载体孔道内表面的 ｐＨ 值比
溶液小，所以孔道内的脂肪酶带正电荷并随着 ｐＨ
的增加而逐渐减少为零，酶分子之间的库伦力随之
变弱，在载体的内表面形成较紧密的单层排列［２３］，
在溶液 ｐＨ为 ６􀆰 ０ 时，可能是酶分子所带电荷为 ０，
酶分子之间斥力为 ０，酶活和固载率最高。 当 ｐＨ在
６􀆰 ０～９􀆰 ０之间时，可能是载体孔道 ｐＨ 大于酶分子
等电点，酶分子带负电荷，脂肪酶和载体内表面都
带负电荷而相互排斥，固载率下降，酶活变低［２０］。
２􀆰 ３　 固定化酶酶学性质的研究
２􀆰 ３􀆰 １　 固定化酶的热稳定性
图 ６是将制备好的固定化酶和游离酶放置 ６０
℃环境中考察高温对酶活的影响结果，并以各自未
经热处理的初始酶活力为 １００％计。 由图 ６可知：随
着在 ６０ ℃高温环境下时间的延长，固定化酶和游离
酶的酶活都呈下降趋势，经过 ６ ｈ 高温保存后固定
化酶保留初始酶活的 ５２％，游离酶保留初始酶活的
１９％，固定化酶的剩余酶活高于游离酶，表明固定化
酶有更好的热稳定性。 推测原因可能是部分脂肪
酶进入材料的介孔中使得其在高温中空间构象得
到孔道的束缚，酶活力得以保留。
图 ６　 高温对固定化酶和游离酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ
ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ
２􀆰 ３􀆰 ２　 固定化酶的重复利用性
在 ｐＨ ７􀆰 ０、温度 ３７ ℃的条件下，考察固定化酶
的重复利用效果，结果见图 ７。 由图 ７ 可知：随着使
用次数的增加酶活有所下降，在重复使用 ５ 次后比
酶活仍达 ６ ０００ Ｕ ／ ｇ。 原因一方面可能是利用了载
体的磁性特点回收固定化酶避免了其他方法回收
过程中的损失，另一方面可能是固定化酶机械强度
较游离酶高，使其稳定性提高。 酶活有所下降可能
是酶分子与 γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ 仅通过微弱的疏水作用
和范德华力结合的，经过多次分离洗涤，酶分子很
容易脱落，造成酶活部分损失，但每次能回收完全
５１　 第 ２期 胡集铖等：γ Ｆｅ２Ｏ３ 凹土超顺磁性纳米复合材料固载猪胰脂肪酶
且方便，所以就固定酶自身而言，其重复利用性能
很理想。
图 ７　 使用次数对固定化酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｒｅｕｓａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ
３　 结　 论
以自制 γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ 作为固定化猪胰脂肪酶
的载体，其固定化最佳条件为固定化时间 ４ ｈ 及 ｐＨ
６􀆰 ０。 制备的 γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ 比表面积为 １０２􀆰 ６３
ｍ２ ／ ｇ，发现能提高其固载率。 其饱和磁化强度为
８􀆰 ９１５ ｅｍｕ ／ ｇ，对外界磁场响应更灵敏，能更好地解
决传质及回收再利用问题。 由此表明 γ Ｆｅ２Ｏ３
ＡＴＰ 是固定化酶的良好载体。 由于保留了凹土的
骨架结构，γ Ｆｅ２Ｏ３ ＡＴＰ 仍然具有凹土的性质，可
通过改性派生出各类衍生物，具有较好的应用前景。
参考文献：
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ｔｗｏ⁃ｓｔｅｐ ｐｒｏｃｅｓｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇｌｉｐａｓｅ ｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒｍａｌ
ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｉｘ⁃ｍｅｍｂｅｒｅｄ
ｃｙｃｌｉｃ ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｆｒｏｍ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｐｒｏｐａｎｅ ａｎｄ ｄｉｍｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ
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ｆｒｏｍ ａ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ⁃ｌｉｋｅ ｓｔｒａｉｎ ｄｉｓｐｌａｙｓ ｕｎｕｓｕａｌ
ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｓｈｏｗｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｌｃｏｈｏｌｓ［ Ｊ］ ． Ｊ Ａｐｐｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１３，１１４（３）：７２２⁃７３２􀆰
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ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ
［Ｊ］ ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，２０１３，８８（１）：６７⁃７９􀆰
［ ４ ］ 　 Ｚｈａｏ Ｄ Ｙ，Ｈｕｏ Ｑ Ｓ，Ｆｅｎｇ Ｊ Ｌ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｎｏｎｉｏｎｉｃ ｔｒｉｂｌｏｃｋ ａｎｄ ｓｔａｒ
ｄｉｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ
ｏｒｄｅｒｅｄ，ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｓｔａｂｌｅ，ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃａ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ［ Ｊ］ ． Ｊ
Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１９９８，１２０：６０２４⁃６０３６􀆰
［ ５ ］ 　 Ｓｃｈｍｉｄｔ⁃Ｗｉｎｋｅｌ Ｐ，Ｌｕｋｅｎｓ Ｗ Ｗ，Ｚｈａｏ Ｄ Ｙ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｍｅｓｏｃｅｌｌｕｌａｒ
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（责任编辑　 荀志金）
６１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷