全 文 ：第７卷第４期
２００９年７月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．４
Ｊｕｌｙ２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０４．０１２
收稿日期：２００８－１０－２６
基金项目：天津市科委资助项目（０７ＺＨＸＨＮＣ０４５００）；天津科技大学科学研究基金资助项目（２００７０２０１）
作者简介：董杉木（１９８４—），男，山东青岛人，硕士研究生，研究方向：纳米生物传感器；张娟琨（联系人），教授，博士生导师，Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｊｋ＠
ｔｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
纳米多孔硅阻抗生物传感器的研究
董杉木，张娟琨，白丽荣，刘武胜，卢金辉，马 宁
（天津科技大学 工业微生物教育部重点实验室，生物工程学院，天津 ３００４５７）
摘 要：构建了１种基于多孔硅材料，无需标记的纳米生物传感器，用于对牛血清白蛋白分子进行检测。通过对多
孔硅进行表面处理，形成氧化膜，将抗体固定到多孔硅氧化层表面。在磷酸盐缓冲液中，通过电化学检测系统检测
加入抗原后，传感器的阻抗值的变化。磷酸缓冲液（ＰＢＳ）／抗体 氧化层／硅，构成电解液／绝缘层／半导体（ｅｌｅｃｔｒｏ
ｌｙｔｅｉｎｓｕｌａｔｏｒｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ，ＥＩＳ）结构。传感器的线性检测范围为００１～０２７ｍｇ／ｍＬ，检测限为００１ｍｇ／ｍＬ。
关键词：纳米多孔硅；纳米生物器；电解液／绝缘层／半导体；阻抗
中图分类号：Ｒ３９２．１１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０４－００５６－０５
Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｉｎｓｕｌａｔｏｒｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒｉｍｐｅｄａｎｃｅｎａｎｏｐｏｒｏｕｓｓｉｌｉｃｏｎ
ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｆｏｒｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ＤＯＮＧＳｈａｎｍｕ，ＺＨＡＮＧＪｕａｎｋｕｎ，ＢＡＩＬｉｒｏｎｇ，ＬＩＵＷｕｓｈｅｎｇ，ＬＵＪｉｎｈｕｉ，ＭＡＮｉｎｇ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
ＴｉａｎｊｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００４５７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｎａｎｏｐｏｒｏｕｓｓｉｌｉｃｏｎ（ＰＳ）ｉｓａｔｒａｃｔｉｖｅｍａｔｅｒｉａｌｆｏｒｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｉｎｔｏｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓｓｉｎｃｅｉｔｓｌａｒｇｅ
ｓｕｒｆａｃｅａｒｅａａｎｄｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｔｏｇｅｎｅｒａｔｅｂｏｔｈｏｐｔｉｃａｌａｎｄｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｓｉｇｎａｌｓ．Ａｌａｂｅｌｆｒｅｅｎａｎｏｂｉｏｓｅｎｓｏｒｆｏｒ
ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）ｗａｓｄｅｓｃｒｉｂｅｄ．Ｎａｎｏｐｏｒｏｕｓｓｉｌｉｃｏｎｗａｓｆｉｒｓｔｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄａｎｄｔｈｅｎｉｍ
ｍｏｂｉｌｉｚｅｄｗｉｔｈａｎｔｉＢＳＡａｎｔｉｂｏｄｙｏｎｔｈｅｓｕｒｆａｃｅ．ＲｅａｃｔｉｏｎｗｉｔｈＢＳＡｉｎＰＢＳｂｕｆｅｒｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎａｎｉｍｐｅｄ
ａｎｃｅｃｈａｎｇｅａｎｄｉｔｗａｓｉｎｖｅｒｓｅｌｙｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌｔｏｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｎａｌｙｔｅ．ＴｈｅｓｙｓｔｅｍＰＢＳｂｕｆｅｒ／
ａｎｔｉｂｏｄｙ／ＰＳｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄａｎｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｉｎｓｕｌａｔｏｒｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（ＥＩＳ）ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｔｈｕｓｆｕｒｎｉｓｈｉｎｇａｎｉｍ
ｐｅｄａｎｃｅＥＩＳｎａｎｏｂｉｏｓｅｎｓｏｒ．Ｔｈｅｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｏｆｔｈｅｓｅｎｓｏｒｗａｓｆｒｏｍ００１ｍｇ／ｍＬｔｏ０２７ｍｇ／ｍＬ．Ｔｈｅ
ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｌｉｍｉｔｗａｓ００１ｍｇ／ｍＬ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｎａｎｏｐｏｒｏｕｓｓｉｌｉｃｏｎ；ｎａｎｏｂｉｏｓｅｎｓｏｒ；ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｉｎｓｕｌａｔｏｒｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ；ｉｍｐｅｄａｎｃｅ
纳米多孔硅材料具有比表面积大、在紫外激发
下可以发射荧光、易于整合到电化学系统中等特
性。将多孔硅材料应用到生物传感器的构建中，是
近几年研究人员普遍关注的热点课题［１－５］。
与普通的纳米材料需要固定到金、玻碳等电极
表面相比，纳米多孔硅具备半导体材料的特性，直
接可以作为电极使用，并且可以构建基于半导体材
料的电化学敏感单元。ＥＩＳ型敏感单元就是其中最
受关注的１种。ＥＩＳ传感器的敏感单元，具备电解
液 绝缘层 半导体（ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｉｎｓｕｌａｔｏｒｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃ
ｔｏｒ，ＥＩＳ）的三层夹心结构，在其绝缘层上固定生物
识别分子，可以对溶液层中的目标分子进行特异性
的识别［６－１０］。２０世纪９０年代末，研究人员［１１－１３］开
始大量报道ＥＩＳ型生物传感器用于蛋白质、ＤＮＡ和
一些小分子的检测。
ＥＩＳ阻抗传感器是利用电化学工作站对构建了
ＥＩＳ敏感单元的电极进行阻抗谱分析。在检测系统
中加入目标分子后，ＥＩＳ电极的阻抗值的会随之发
生变化。由于阻抗传感器具备免标记、快速、灵敏
等特点［１４］，所以在目前的研究中受到了很多的
关注［１５－１６］。
本文报道１种基于多孔硅材料的ＥＩＳ型阻抗传
感器，由多孔硅／ＳｉＯ２ 抗体／ＰＢＳ溶液构成 ＥＩＳ敏感
单元，当加入抗原分子（牛血清白蛋白，ＢＳＡ）时，传感
器表面的抗体对其进行特异性的识别，通过交流阻抗
分析仪可以检测到传感器系统阻抗值的变化，从而确
定加入溶液中抗原分子的含量。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料和仪器
ｐ＜１００＞单晶硅片（电阻率０１５～０２Ω·ｃｍ）
购于天津半导体研究所；牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、卵清
白蛋白（ＯＶＡ）购于北京鼎国生物技术有限公司
（Ｇｅｎｖｉｅｗ分装）；纳米胶体金溶液、ＢＳＡ抗血清为本
实验室自制。
脉冲腐蚀信号发生器为 ＳＵＩＮＧＴＥＧ２００３ＤＤＳ
函数信号发生器；原子力显微镜为日本 ＪＥＯＬＪＳＰＭ
５２００；电化学检测系统采用天津ＬＫ２００５Ａ电化学工
作站和德国ＺＡＨＮＥＲＩｍ６／６ｅｘ电化学工作站系统。
１．２ 实验方法
１．２．１ 多孔硅的制备与氧化膜的形成
本实验选择 ｐ＜１００＞单晶硅片通过阳极电化
学脉冲腐蚀制备多孔硅，脉冲腐蚀电流幅值为 ２０
ｍＡ／ｃｍ２，脉冲频率２０Ｈｚ，占空比为０５，腐蚀时间
１ｈ，该腐蚀过程在自制的聚四氟乙烯容器中进行，
选择铂柱电极为阴极，硅片为阳极。腐蚀液为
Ｖ（４８％ＨＦ）∶Ｖ（无水乙醇）∶Ｖ（Ｈ２Ｏ）＝１∶１∶２。
刚制备好的多孔硅片用去离子水洗净，用体积
分数为１％ Ｈ２Ｏ２作电解液进行阳极氧化，处理 ４０
ｍｉｎ，使多孔硅表面形成一层很薄的氧化膜，然后将
多孔硅片浸入Ｖ（ＮＨ３）∶Ｖ（Ｈ２Ｏ２）∶Ｖ（Ｈ２Ｏ）＝（１∶１∶
１０）组成的混合溶液中，７０℃处理４０ｍｉｎ，使多孔硅
表面的氧化层变得更加均匀完整（同时可以改变表
面氧化层的疏水性）。处理完毕用蒸馏水冲洗干
净，在真空干燥箱中２００℃干燥处理１ｈ。
１．２．２ 抗体固定化
将处理好的多孔硅片浸入抗 ＢＳＡ血清稀释液
中（用３倍体积的ｐＨ７．４的磷酸缓冲溶液（ＰＢＳ）与
１倍抗 ＢＳＡ兔血清混合），室温卵孵 １ｈ。用
２ｍｇ／ｍＬ的卵清白蛋白溶液封闭多孔硅的空白位
点，之后用大量的 ＰＢＳ溶液冲洗，储存于真空干燥
器中。通过原子力显微镜（ＡＦＭ）观察固定抗体前
后多孔硅基片表面形态的变化；采用纳米金标抗原
证明固定化抗体的活性。
１．２．３ 交流阻抗法测定
电化学检测采用三电极体系：由多孔硅传感器
作为工作电极，铂柱电极作为对电极，Ａｇ／ＡｇＣｌ作为
参比电极。在电化学交流阻抗法测量中，频率扫描
的范围选择 ００１～１００ｋＨｚ，交流幅值 ５ｍＶ，在
ＺＡＨＮＥＲＩｍ６／６ｅｘ电化学工作站上进行测量；偏置
电位的扫描范围选择０１～０３Ｖ，测量的频率选择
１０００Ｈｚ，交流幅值５ｍＶ，在 ＬＫ２００５Ａ电化学工作
站上进行测量。
１．２．４ 待测物的检测
待测物（１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ贮液）溶液由 ＰＢＳ缓冲
液稀释而成。由于多孔硅材料的重复性，将待测物
逐级滴加到检测体系中，使待测物的浓度逐渐提
高。在电化学系统稳定１ｈ之后，每隔３０ｍｉｎ向体
系中滴加 １次待测物，使其质量浓度逐级达到
００１、００３、０１３、０２３、０２７ｍｇ／ｍＬ，分别检测各个
质量浓度对应的阻抗 电位曲线。３０ｍｉｎ的时间间
隔是为了保证抗原和抗体能充分的反应。
２ 结果与讨论
２．１ 多孔硅的表面形貌与氧化层的形成
脉冲腐蚀制备的多孔硅直观表面均匀平整（图
１），为多孔硅表面在１μｍ范围内的原子力显微镜
（ＡＦＭ）形貌图（图２），由图２可知，多孔硅表面成不
规则岛状突起，从岛状结构的顶峰到谷底最深处高
度差可达８０ｎｍ。
刚制备多孔硅表面多为Ｓｉ—Ｈ结构，通过Ｈ２Ｏ２
氧化，可以在多孔硅表面形成一层氧化薄层。将刚制
备的多孔硅基片和氧化后的多孔硅基片在 ＰＢＳ（ｐＨ
７４）溶液中进行循环伏安法扫描，结果见图３。由图
３可知，氧化后的多孔硅基片阳极峰消失，证明在多
孔硅表面形成了阻挡电子转移的绝缘层，即为氧化层
７５ 第４期 董杉木等：纳米多孔硅阻抗生物传感器的研究
结构。研究表明，氧化层的表面多为Ｓｉ—Ｏ结构。
图１ 多孔硅的直观表面形貌
Ｆｉｇ．１ ＩｍａｇｅｏｆＰＳｓｕｒｆａｃｅ
图２ 多孔硅结构表面的ＡＦＭ形貌图
Ｆｉｇ．２ ＡＦＭ ｐｉｃｔｕｒｅｏｆＰＳｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
图３ 循环伏安法扫描Ｈ２Ｏ２氧化前后的多孔硅基片
Ｆｉｇ．３ ＣｙｃｌｉｃｖｏｌｔａｍｍｏｇｒａｍｆｏｒＰＳｓｔｒｕｃｔｕｒｅｂｅｆｏｒｅ
ａｎｄａｆｔｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ
２．２ 抗体的固定化
由原子力显微镜可以观察到（图４），固定抗体
的多孔硅表面（图４（Ｂ））与未固定的抗体多孔硅表
面（图４（Ａ））相比，厚度明显增加，并且表面变得更
加平坦。由此可以证明，抗体成功地固定到了多孔
硅氧化层表面。
为了证明固定化的抗体仍具备生物活性，本试
验采用胶体金标记抗原ＢＳＡ分子，将其滴加到固定
了抗体的多孔硅表面，室温卵孵１ｈ，让抗原抗体充
分反应。之后用大量的ＰＢＳ缓冲液冲洗，发现多孔
图４ 固定抗体前后的多孔硅片ＡＦＭ图
Ｆｉｇ．４ ＡｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｉｍａｇｅｏｆｆｒｅｅＰＳａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄＰＳ
硅表面仍然保留了一层均匀的紫红色。将金标抗
原与未固定抗体多孔硅基片接触，重复以上操作，
发现多孔硅表面保留的紫红色明显变浅。证明抗
体已经成功固定在了多孔硅的氧化层表面上，并保
持活性（图５）。
２．３ 交流阻抗法检测ＢＳＡ分子
通过交流阻抗法的频率扫描测量，可以获得传
感器表面阻抗的Ｎｙｑｕｉｓｔ谱图。从图６中（纵坐标为
阻抗值的虚部，横坐标为阻抗值的实部）可以看出
当在缓冲体系中加入目标分子ＢＳＡ时，传感器表面
的阻抗值会明显下降，则可以认为这可能是抗原与
抗体结合后，抗体层表面的电荷发生重新排布，改
变了传感器表面的介电常数，从而导致阻抗值的最
终变化。
在阻抗 电位扫描中，如图７所示，随着待测物
浓度的增加，在相同电位下的阻抗值不断下降。
８５ 生 物 加 工 过 程 第７卷
图５ 通过金标抗原证明固定化抗体的活性
Ｆｉｇ．５ ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｎｔｉＢＳＡａｎｔｉｂｏｄｙ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈＢＳＡｃｏｌｏｉｄａｌｇｏｌｄ
图６ 不同条件下的多孔硅传感器的Ｎｙｑｕｉｓｔ谱图
Ｆｉｇ．６ Ｎｙｑｕｉｓｔｐｌｏｔｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｃｏｎｄｉｔｏｎｓ
当偏置电位为２９０ｍＶ，其阻抗值下降关系在待测
物质量浓度为 ００１～０２７ｍｇ／ｍＬ范围内有较好
的线性关系（图 ８），易于绘制标准曲线。故选择
电位为２９０ｍＶ，从而可以对标准曲线浓度范围内
的 ＢＳＡ分子进行定量检测。待测物的最低检测线
为００１ｍｇ／ｍＬ。
图７ 多孔硅传感器滴加不同浓度的ＢＳＡ时
阻抗 电位曲线的变化
Ｆｉｇ．７ Ｉｍｐｅｄａｎｃｅｖｅｒｓｕｓｖｏｌｔａｇｅｐｌｏｔｓｏｆｔｈｅｐｏｒｏｕｓ
ｓｉｌｉｃｏｎｓｅｎｓｏｒｓａｆｔｅｒａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔＢＳＡ
图８ 阻抗 ＢＳＡ质量浓度的变化
Ｆｉｇ．８ ＥｆｅｃｔｓｏｆＢＳＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｉｍｐｅｄａｎｃｅ
３ 结 论
纳米多孔硅传感器的特殊结构使其具备更大
的比表面积以及光学、电化学特性。笔者通过对单
晶硅片的腐蚀处理，制备了纳米多孔硅层，并对其
进行了表面修饰，通过ＡＦＭ以及电化学方法对其表
面结构进行了表征。在其上固定抗体，通过电化学
工作站，以交流阻抗的方法对目表分子进行特异性
的检测，获得了目标分子浓度与阻抗值变化的规
律，确定了检测限可达到００１ｍｇ／ｍＬ，以及线性检
测范围为００１～０２７ｍｇ／ｍＬ。
参考文献：
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ｓｏｒｓｆｏｒｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｅｎｓｉｎｇｂａｓｅｄｏｎｐｏｒｏｕｓｓｉｌｉｃｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
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ｃａｐａｃｉｔｉｖｅａｆｉｎｉｔｙｓｅｎｓｏｒ：ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓ
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ａｎｃｅｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｅｎｓｏｒｓａｎｄＡｃｔｕａｔｏｒｓ，
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［１６］ＬｉａｏＷ，ＣｕｉＸＴ．Ｒｅａｇｅｎｔｌｅｓｓａｐｔａｍｅｒｂａｓｅｄｉｍｐｅｄａｎｃｅｂｉｏｓｅｎｓｏｒ
ｆｏｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇａｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅＰＤＧＦ［Ｊ］．Ｂｉｏｉｓｅｎｓ
Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ，２００７，２３：
櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
２１８２２４．
国外动态
阿根廷培育出抗真菌和细菌转基因土豆
布宜诺斯艾利斯大学生物农业研究室的科学家用了５ａ的时间培育出一种转基因土豆。这种土豆能抵
抗“土豆天敌”真菌和细菌的侵害，提高土豆的单位产量。科学家们改变了土豆基因组中的３组，使它能抵
抗不同种类的病原体。目前，阿根廷的科学家们正在研究把这种抗真菌和细菌的转基因方法引入到豆子和
玉米的培植过程中。
生物可降解的荧光聚合物
新开发的人造荧光聚合物有可能让科学家监测培养的组织的生长。尽管荧光染色和量子点被广泛用
于工作台研究，它们的毒性造成了很难长期在活组织中使用这些试剂。ＹａｎｇＪｉａｎ及其同事开发出了一种替
代方法：生物可降解的荧光聚合物，它可以用于组织工程、药物释放和生物成像的棚架材料。研究者通过在
一个化学反应中引入一个氨基酸和柠檬酸从而修改了他们此前创造出的聚合物制造工艺。根据实验证据，
研究者提出，当这种氨基酸的关键原子与聚合物的骨架结合的时候，形成了一个环状结构———这是产生荧
光的关键。研究者提出，对氨基酸的选择影响了荧光的强度和波长。这种荧光聚合物可以进入膜，它们对
于成纤维细胞无毒，而且在５个月的时间里只在小鼠体内导致了轻微的炎症。
（朱宏阳）
０６ 生 物 加 工 过 程 第７卷