全 文 ：第７卷第１期
２００９年１月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．１
Ｊａｎ．２００９
收稿日期：２００８０２２３
作者简介：王卿卿（１９８２—），女，河北正定人，硕士研究生，研究方向：生物催化；冯惠勇（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：ｆｅｎｇｈｕｉｙｏｎｇ＠１６３．ｃｏｍ
耐高温 β－糖苷酶的乳糖水解活性及转糖基活性
王卿卿１，冯惠勇１，康 辉２，卢 楠３，张丽丽１
（１．河北科技大学 生物科学与工程学院，石家庄 ０５００１８；
２．河北中润制药有限公司，石家庄 ０５６０１７；
３．河北化工医药职业技术学院，石家庄 ０５００００）
摘 要：β－糖苷酶（ｔβＧＬＹ）是Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ产生的一种耐高温酶，以乳糖为底物的酶反应研究表明：该酶具
有较高的乳糖水解活性，其最适温度为７０℃，最适ｐＨ为７０，乳糖水解的Ｋｍ＝１５６６ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍａｘ＝０４０６ｍｍｏｌ／ｍｉｎ，
在７０℃有较好的热稳定性。该酶同时具有较强的转糖基活性，在以４０％乳糖为底物，加酶量４２５Ｕ／ｍＬ、反应温度
７０℃、反应时间１６ｈ的条件下，低聚半乳糖的合成率达到３５３％。水解产物葡萄糖对乳糖水解反应和转糖基反应具
有抑制作用，是影响ＧＯＳ合成的重要因素。
关键词：β糖苷酶；低聚半乳糖；水解；转糖基
中图分类号：Ｑ５５６＋．２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０１－００４９－０５
Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅβｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｉｎｌａｃｔｏｓｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
ａｎｄｔｒａｎｓｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ
ＷＡＮＧＱｉｎｇｑｉｎｇ１，ＦＥＮＧＨｕｉｙｏｎｇ１，ＫＡＮＧＨｕｉ２，ＬＵＮａｎ３，ＺＨＡＮＧＬｉｌｉ１
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＨｅｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００１８，Ｃｈｉｎａ；
２．ＨｅｂｅｉＺｈｏｎｇｒｕｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５６０１７，Ｃｈｉｎａ；
３．ＨｅｂｅｉＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＶｏｃａｔｉｏｎａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｌｅｇｅ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｔβＧＬＹｉｓａｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅβｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｆｒｏｍＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ．Ｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｓｏｆｔｈｅｅｎ
ｚｙｍｅｉｎｔｗｏｒｅａｃｔｉｏｎｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｉｎｌａｃｔｏｓｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ，ｔｈｅＫｍｗａｓ１５６６ｍｍｏｌ／ＬａｎｄｔｈｅＶｍａｘ
ｗａｓ０４０６ｍｍｏｌ／ｍｉｎａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆ７０℃ ａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｐＨｏｆ７０．Ｉｎａｔｒａｎｓｇａｌａｃｔｏ
ｓｙｌａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ＧＯＳ）ｒｅａｃｈｅｄ３５３％ ｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅ
ｉｎｉｔｉａｌｌａｃｔｏｓｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ４０％，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｔ７０℃，ｅｎｚｙｍｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｔ４２５Ｕ／ｍＬ，ａｎｄｒｅ
ａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆ１６ｈ．Ｇｌｕｃｏｓｅｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｌａｃｔｏｓｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓａｎｄｔｈｅｔｒａｎｓｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ，
ｔｈｕｓｉｔａｆｅｃｔｅｄｔｈｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｆａｃｔｏｒｓｏｆＧＯＳ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：βｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ；ｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；ｔｒａｎｓｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ
糖苷酶（ｇｌｙｃｏｓｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，ＥＣ３２１）是目前
用于酶法合成糖苷和低聚糖的一类重要的酶类。
特别是半乳糖苷酶对乳糖有较高水解活性，在水解
乳糖分子中β－１，４半乳糖苷键的同时，具有转半乳
糖基作用，以乳糖或其水解产物半乳糖和葡萄糖为
糖基受体合成半乳糖苷键，生成低聚半乳糖（ｇａｌａｃ
ｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ＧＯＳ）。据报道产酶的微生物包
括 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，
Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓｏｒｙｚａｅ，Ｂａｃｉｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ，Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｐｓ．，Ｂａｃｉｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ等［１－５］。低聚半乳糖是
具有独特生理功能和理化性质的功能低聚糖。越
来越多的研究证据显示了 ＧＯＳ作为肠道内双歧杆
菌增殖因子的保健作用，而且在酸性和高温条件下
具有极好的稳定性。因此，ＧＯＳ作为第三代功能食
品的功能因子和理想的食品配料，广泛地应用于烘
焙食品、糖果、清凉饮料、糕点、调味品、保健食品等
方面，随着研究的深入，其应用范围越来越广，已引
起全世界广泛关注［６］。
本文研究的 β－糖苷酶（ｔβＧＬＹ）来源于 Ｔｈｅｒ
ｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ菌株，具有较高的乳糖水解活性和
转糖基活性［７－９］。本文以乳糖为底物，研究 β－糖
苷酶（ｔβＧＬＹ）的水解反应和转糖基反应，对反应条
件、酶反应动力学参数以及反应产物对酶反应的影
响进行研究。
１ 材料与方法
１１ 菌种与试剂
１１１ 菌种
产酶菌株Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ为河北科技大学
生物科学与工程学院保藏菌种。
１１２ 试剂
乳糖、葡萄糖、半乳糖、１－苯基－３－甲基－５－
吡唑啉酮（ＰＭＰ）（购自天津傲然精细化工研究所），
低聚半乳糖标样（三鹿集团赠送），甲醇（色谱纯）、
乙腈（色谱纯）、葡萄糖试剂盒（购自北京北化康泰
临床试剂有限公司），其他试剂均为市售分析纯或
化学纯。
１２ 实验方法
１２１ 酶活的测定
酶活单位：以乳糖为底物，在温度６５℃、ｐＨ为
７０的条件下，每分钟水解产生１μｍｏｌ葡萄糖所需
的酶量定义为一个酶单位（Ｕ）。
葡萄糖含量测定：采用葡萄糖氧化酶试剂盒法。
１２２ ＨＰＬＣ法检测酶反应的底物及产物
将一定浓度的乳糖用磷酸缓冲液溶解，预热后加
入一定量的ｔβＧＬＹ酶液，在相应实验温度下反应，定
时取样。将试样在一定条件下与ＰＭＰ反应进行柱前
衍生化后，用高效液相色谱检测各反应产物的含量。
色谱条件：色谱柱为 ＡｊｉｌｅｎｔＥｃｌｉｐｓｅＸＤＢＣ１８柱，４６
ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ；紫外检测器；流动相Ｖ（乙腈）∶Ｖ
（磷酸缓冲液）＝２５∶７５；进样量 ２０μＬ；流速 ０８
ｍＬ／ｍｉｎ；柱温２５℃。
１２３ ＴＬＣ法检测酶反应的底物及产物
转糖基产物经 ＴＬＣ薄板点样后，展层剂展开，
雾喷显色剂，于１５０℃显色。展层剂 Ｖ（正丁醇）∶
Ｖ（乙醇）∶Ｖ（Ｈ２Ｏ）＝５∶３∶２，显色剂为２０％Ｈ２ＳＯ４配
制４４％的钼酸铵和２％的硫酸铈。
１２４ 反应底物、产物对酶反应的影响
在７０℃、ｐＨ７０条件下，进行不同底物浓度的
酶反应，定时取样，ＨＰＬＣ法检测底物及产物浓度。
在７０℃、ｐＨ７０条件下，以４０％的乳糖为底
物，实验组加入一定量的葡萄糖，进行酶反应。反
应结束取样，ＨＰＬＣ法及 ＴＬＣ法检测底物及产物浓
度，比较实验组和对照组数据，分析水解产物葡萄
糖对催化反应的影响。
２ 结果与讨论
２１ 酶水解活性的研究
２１１ 酶的最适反应温度研究
在ｐＨ７０条件下，分别测定该酶在５０～１００℃
下乳糖水解反应的酶活，结果见图１。
图１ 温度对水解活性的影响
Ｆｉｇ．１ Ｅｆｅｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｅｎｚｙｍｅ
在温度低于７０℃时随着温度的升高酶活增大，
但当温度超过７０℃后，酶活呈下降趋势，因此该酶
以乳糖为底物在 ｐＨ＝７０条件下的最适反应温度
为７０℃。与文献中报道的一种源于嗜热脂肪芽孢
杆菌的耐热β－糖苷酶的最适温度为５５℃［１０］，来源
于亮曲霉的乳糖酶最适温度为６０℃［１１］相比，该酶
耐热性好，反应温度高，有利于提高反应转化率，更
适合工程应用。
２１２ ｐＨ对水解活性的影响
在７０℃的条件下，分别测定在ｐＨ为４５～８５
时乳糖水解反应中的酶活，结果见图２。由图２可以
０５ 生 物 加 工 过 程 第７卷
看出，ｐＨ在７０左右，酶活达到最大值，而且在ｐＨ为
４５～８５的范围内酶活始终保持７０％以上。与报道
米曲霉来源的酶ｐＨ稳定范围为５～６［６］，最适ｐＨ为
５１５［１３］相比，ｔβＧＬＹ酶的ｐＨ适用范围较宽。
图２ ｐＨ对水解活性的影响
Ｆｉｇ．２ ＥｆｅｃｔｏｆｐＨｏｎｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｅｎｚｙｍｅ
２１３ 酶的热稳定性
将酶分别在７０、８０、９０、１００和１４０℃条件下保
温，不同时间取样，测定乳糖水解反应的相对活力，
结果见图３。
图３ 酶的热稳定性曲线
Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅｃｕｒｖｅｏｆｔｈｅｒｍａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｅｎｚｙｍｅ
由图３可知，随加热时间的延长，酶的活力逐渐
下降。不同温度条件下，酶活半衰期分别为３０ｄ，８５
ｍｉｎ、２３ｍｉｎ、３ｍｉｎ和１４ｍｉｎ。据文献［１２］报道，乳
糖酶在６０℃下保温３０ｍｉｎ，酶相对活力为６０２％，在
７０℃下保温１５ｍｉｎ，酶相对活力仅为１８％。文献［６］
报道，５５℃保温１ｈ，相对酶活为５０％，文献［１２］报道
酶稳定的温度范围为５０～６０℃，文献［１３］报道７０℃
保温２ｈ相对酶活为２０％。由此可见，本研究的酶具
有很好的热稳定性能，在工程应用中可在高温和高底
物浓度反应体系中反应，具有反应速度快，转化率高
的特点。
２１４ 乳糖水解反应的酶动力学参数
为了最大限度提高反应速度，确定最佳反应条
件，需要掌握酶促反应规律。这一基本规律是指酶
反应速度和酶与底物之间的动力学关系，首先绘制
出乳糖浓度对酶反应初速度的影响曲线，如图４所
示，拟合出米氏方程的饱和双曲线。按米氏方程的
双倒数法作图，分别求得Ｖｍａｘ、Ｋｍ。
图４ 乳糖浓度对反应初速度的影响
Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆｌａｃｔｏｓｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｉｎｉｔｉａｌ
ｒａｔｅｏｆｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｒｅａｃｔｉｏｎ
经作图计算求得 Ｖｍａｘ＝０４０６ｍｍｏｌ／ｍｉｎ，Ｋｍ ＝
１５６６ｍｍｏｌ／Ｌ。据文献报道 ｔβＧＬＹ以对硝基酚 β
－半乳糖（ｐＮＰβＧａｌ）为底物的 Ｋｍ＝６６ｍｍｏｌ／Ｌ，
以对硝基酚ｐ－葡萄糖（ｐＮＰβＧｌｕ）为底物的Ｋｍ＝
００９ｍｍｏｌ／Ｌ，以对硝基酚 β－岩藻糖（ｐＮＰβＦｕｃ）
为底物的 Ｋｍ ＝０１６ｍｍｏｌ／Ｌ
［３］，说明 ｔβＧＬＹ对底
物的亲和力大小依次为 ｐＮＰβＧａｌ，ｐＮＰβＦｕｃ，乳
糖，ｐＮＰβＧｌｕ。文献报道的从栖热菌中分离纯化
的乳糖酶水解乳糖反应的Ｋｍ＝６３９ｍｍｏｌ／Ｌ
［１０］。
２２ 酶转糖基化反应催化合成低聚半乳糖
在温度７０℃、乳糖质量分数４０％、ｐＨ为７０，加
酶量为４２５Ｕ／ｍＬ的条件下，进行酶的转糖基反应，
反应体系中反应产物经 ＨＰＬＣ检测，与 ＧＯＳ标准品
的出峰时间对照，反应体系中存在低聚半乳五糖、低
聚半乳四糖、低聚半乳三糖、乳糖、葡萄糖、半乳糖。
ＧＯＳ合成的量随反应时间的变化曲线如图５所示。
图５ ＧＯＳ合成反应过程曲线
Ｆｉｇ．５ ＴｉｍｅｃｏｕｒｓｅｏｆｔｈｅＧＯＳｓｙｎｔｈｅｓｉｓｒｅａｃｔｉｏｎ
１５ 第１期 王卿卿等：耐高温β－糖苷酶的乳糖水解活性及转糖基活性
结果表明反应体系中 ＧＯＳ、葡萄糖、半乳糖的
含量随时间的增加逐渐增加，反应１６ｈＧＯＳ的质量
分数达到３５％，并逐渐趋于平衡；乳糖含量逐渐下
降，一定时间后也趋于平衡，反应结束时乳糖７０％
转化为产物；其中水解产物葡萄糖含量较半乳糖含
量高，说明半乳糖作为转糖苷反应的糖基受体参与
了ＧＯＳ合成，而反应体系中高浓度的葡萄糖，有可
能抑制水解及 ＧＯＳ的合成反应。ＧＯＳ合成反应是
一个复杂的反应体系，乳糖水解反应及低聚糖的合
成反应同时进行，而合成的产物也是酶的作用底物。
２３ 水解产物对水解反应和ＧＯＳ合成的影响
为了验证反应体系中高浓度葡萄糖对水解反
应及转糖基反应的影响，在反应体系中外加一定浓
度的葡萄糖，通过比较实验组及对照组反应产物的
量，获得实验结果。
在２２实验结果中，由于水解产物半乳糖参与
转糖基反应，在反应体系中含量显著低于葡萄糖的
量，葡萄糖可能是抑制水解和合成反应的主要因
素。因此，本实验在反应体系中，外加入一定量的
葡萄糖，反应结束后，ＴＬＣ和ＨＰＬＣ的检测结果如图
６和表１所示。
１号—不加葡萄糖的原反应体系
２号—加入葡萄糖的反应体系
图６ ＴＬＣ检测葡萄糖对酶反应的影响
Ｆｉｇ．６ ＴｈｅｅｆｅｃｔｏｆｇｌｕｃｏｓｅｏｎｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｂｙＴＬＣ
由图６所示的ＴＬＣ结果和表１结果看出，加入
葡萄糖的反应体系中的乳糖的含量较高，且低聚糖
的生成量明显少于不加葡萄糖的反应体系，因此，
增加反应体系中水解产物葡萄糖的量，会导致乳糖
水解率降低，同时低聚糖的合成量减少４０％，即葡
萄糖对ｔβＧＬＹ酶的水解反应和转糖基反应都有一
定的抑制作用，这与秦燕等［１３］所报道的结果相一
致。影响ＧＯＳ合成的另一原因可能由于葡萄糖作
为乳糖的水解产物之一，对水解反应有产物抑制
性，造成另一水解产物半乳糖含量降低，而半乳糖
又是 ＧＯＳ合成的糖基受体，从而影响低聚糖的
合成。
表１ ＨＰＬＣ检测反应体系中底物和产物的峰面积
Ｔａｂｌｅ１ ＴｈｅｐｅａｋａｒｅａｏｆｓｕｂｓｔｒａｔｅａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓｂｙＨＰＬＣ
反应体系 低聚糖 乳糖 葡萄糖 半乳糖
加入一定量的
葡萄糖的反应
体系
４７３７１ ３５４３７６ １５８９１９ １２５４２
不加葡萄糖的
反应体系 ７９９６４ ２１７７０７ ７５１６２ ２１７１６
３ 结 论
１）β－糖苷酶（ｔβＧＬＹ）为一新型耐高温酶，通
过研究发现，该酶的最适温度为７０℃，最适 ｐＨ为
７０，该酶在７０℃有较好的热稳定性。与文献中报
道的其他乳糖酶相比 ｔβＧＬＹ酶具有更宽的 ｐＨ和
温度稳定范围。
２）通过对ｔβＧＬＹ催化合成低聚半乳糖工艺条
件的研究发现，当反应体系的温度为７０℃、ｐＨ为
７０、乳糖浓度为４０％、加酶量为４２５Ｕ／ｍＬ时，反
应１６ｈ，ＧＯＳ的合成率达到３５３％，具有较好的低
聚半乳糖的合成性能。
３）通过实验研究还发现乳糖的水解产物葡萄
糖对水解反应和转糖基反应的抑制作用，因此，在
以后的工艺条件的研究中，将进一步探索解除葡萄
糖抑制的方法技术，从而更有利于转糖基反应，更
有利于ＧＯＳ的合成。
研究结果显示了该酶具有较高的乳糖水解活
性和转糖基活性，它的耐热性能，有利于酶的分离
纯化，可在高温和高底物浓度反应体系中反应，具
有反应速度快，转化率高的特点，在应用上有更大
优越性。通过本研究可以拓展β－糖苷酶的潜在应
用，探索生物催化合成低聚糖生产的新途径。
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１２１６．
国外动态
日本：利用“磁性”细菌回收有害物质以净化环境
日本《日经产业新闻》报道说，东京农工大学研究小组研制出一种利用磁性细菌回收有毒物质的新方
法。磁性细菌细胞膜表面上有许多“Ｍｓｐ１”蛋白质，这种蛋白质具有很强的与溶液中的有毒镉离子结合的能
力。而磁性细菌会在菌体内形成磁性粒子，所以可以利用有磁石的小型装置回收附着有镉离子的细菌。研
究人员成功地利用磁性细菌回收了溶液中的有毒镉离子。这一新方法可以在环境净化和回收有色金属等
方面加以利用。
欧洲科研人员发明用木质素生产生物塑料方法
据墨西哥《千年报》日前报道，欧洲的科研人员声称发明了利用造纸工业产生的废料获取木质素生产生
物塑料的方法，这不仅将有助于降低塑料生产对石油的依赖程度，还将促进可循环产品的生产。
科研人员从木质素中获得一种名叫Ａｒｂｏｆｏｒｍ的物质用以生产可再生塑料，由Ａｒｂｏｆｏｒｍ制成的生物塑料
可以加工生产出具备类似木材和涤纶特性的产品。
（文伟河）
３５ 第１期 王卿卿等：耐高温β－糖苷酶的乳糖水解活性及转糖基活性