全 文 ： 万方数据
3?
?
万方数据
万方数据
2006年2月 冯惠勇等：定向进化技术改良p一糖苷酶的低聚糖合成性能 ·47·
2．O
1．5
1．O
0．5
O
2O
1．5
l 0
O．5
0
0 5 10 15 20
加
0 5 10 15 20
巾
一▲一‘Ihereactionsyslemc叫l蛐se10m啪I／LpBGal，伽obiose
andenz)，r11e；一◆一7‰reactionsystemcom皿se10mIllol／L胆蹦
图3 pNP．Cal水解动力学曲线
ng．3瞄rleticcurveofhydmlysispNP—GalparwTaJldmutant113
2．3进化酶的基因的测序
DNA测序结果表明：新增突变为A1016C，对应于
氨基酸置换为N339T，即踟被t}lr取代；另一突变为
T12吆C，所对应的氨基酸置换为F401S，即phe被ser
取代。可见，此进化酶有两个氨基酸突变位点，都是
由单碱基替代造成的。
2．4单氨基酸突变克隆子的构建
突变酶N339Ⅱ∞1S虽然转糖苷活性较高，但由
于其水解活性较低，影响了总催化效能。因此采用限
制性酶切再连接介导的基因重组，构建了单氨基酸突
变克隆子：N339T和F401s，以进一步改良ttBGLY催化
合成低聚糖的性能。按筛选方法2，通过测定不同反
应体系的水解产物pNP的∞值，比较了野生型酶、
N339Ⅱ∞ls、N339T和F401S的筛选特征参数，结果见
表l。
表1野生酶与突变酶筛选特征的比较
rI斟e1 CornpaIisonofchracterbm恍nWTandmutan协
突变酶N33卯催化水解比活力是野生型酶的
21％，但与野生型酶有比较一致的筛选特征，可以认为
此点的突变只改变了酶的水解催化活性而未改变转糖
苷反应的催化活性，而且ⅡC结果也没有显示出较强
的转糖苷活性(图略)，因此，判定它是非阳性突变。
突变酶F401s的筛选特征参数与阳性突变酶
N339盯∞1S一致，而催化水解比活力却是
N339盯’401S的4倍，说明通过进一步的基因重组，
所获得的突变酶是有效突变，并提高了催化效能。
2．5进化酶与野生酶的热稳定性研究
各待测酶液分别于70℃下温育，在2h取样置
于冰上10rIlin，测酶水解活性。与野生型酶相比，进
化酶N339TF401s和F40ls的酶活力有所降低，剩余
酶活分别为57％和73％，说明两个酶的氨基酸置换
都影响了热稳定性，但单氨基酸置换进化株比双氨
基酸置换进化株的热稳定性稍有提高，说明重组获
得的单氨基酸置换进化株是有效的。
2．6酶催化pNP蹦水解的动力学特征
经HPLC纯化得酶样，在40℃，pH7．O的磷酸
缓冲液中进行pNP(Ⅺal得水解反应，不同底物浓度
下酶反应的初速度曲线如图4。
1600
1200
盖 800
‘ 400
O
60
￡
‘量 40
苗
≮20
O
O 5 lO 15 2025 30 35
c(pNPGal)／(mmol／L)
O lO 20 30 40 50
c(pNPGal)／(mmol／L)
一●一WT；一◆一N339T；一●一F401S；一▲一N339TF401S
图4不同pNPGal浓度的水解反应的初速度曲线
隐4 Steady—statekineticsWimpNPGalassllbs眦e
万方数据
万方数据
万方数据