全 文 ：第4卷第2期
2006年5月生物加工过程ChineseJ叫malofBi叩mcessEn舀neeringMav．2006·51·
青霉素酰化酶在新型复合载体上的固定化研究王旭朋，郭建峰，高保娇(中北大学
化学工程系，太原030051)
摘要：通过弘氯丙基三甲氧基硅烷的媒介，将聚乙烯亚胺(PEI)化学偶联在硅胶微粒表面，制备了新型复合载体PEI／silica
gel，然后通过双官能团试剂戊二醛的作用，将青霉素酰化酶固定在复合载体上；考察了戊二醛用量、pH
值、固定化温度、固定化时间及给酶量等条件对固定化青霉素酰化酶表观活力、活性回收率等性能的影响；并通过测定复合载体在 定化前的《电位，探索了复合载体PEI，silica
gel固定化酶的作用机理。研究结果表明，由于PEl
分子链中含有大量胺基，共价键联与物理吸附相结合，使青霉素酰化酶被快速稳定薹X霾薹；霍鋈雾崮碴蓁雾■饕
引l曼J霎秘霎药。H雾蘩奏薹囊耋j塑l!目lI岌ii薹；§li著囊襄篓圈羹雨矍露蠢孬堕蒌■美霎毋；警墓蠹d萋薹§莲蘸i姜荔囊
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g
(BiorationalPesticidesResearchandServiceCenter，NorthwestSci-TechUniversityofAgricultureandForest"，Yangling712100，China)
Abstract：AstrainXenorhabdusnematophila"12DOlw sisolatedafterscreeningandselectionofentomopathogen—
iCbacteriasymbioticallyassociatedwithinsectpathogenicnematodes．andinvestigationonbasiccuhurem dia
andoptimalincubationconditionsWaconducted．neresuhs owedthatinitialpH．mediumvolumeinflask．
shakingspeed，temperatureandinoculationmountwere7。0，25mL，220r／rain，28℃and9。0％，respective—
ly．Undertheoptima／condition，thebiomassweightandantibioticactivitywere23．28g／Land30．00f础，and
werenhancedbv52．97％and23．3％respectivelycomparedwiththatundertheinitialcondition．
Keywords：X．nematophilaYL001；ordinalmedium；screening；optimization
Xenorhabdusr地matophila是一种革兰氏阴性细
菌，属肠杆菌科，该细菌与Sternemema震线虫共生，
存在于侵染期线墩的肠腔内，侵染期线虫通过一些
自然孑L口进入寄主昆虫体内，将共生蔚释放到m淋
巴中，共生菌在囊漤巴中大量繁殖，使寄主昆虫患败
血症而死亡H』。共生菌能产生多种次生代谢产物，
这些代谢产物不仅具有多种化学结构，而且在医药
霸农监上具有广泛的生物活性[2j，如撬缨墓、寞麓、
杀虫、杀线虫、抗溃疡、抗肿瘤和抗病毒活性；共生菌
产生的毒素簧自及其基因可应用于转基因抗虫植
物口』。近年来，昆虫病原线虫共生菌的这一生理代
谢特征成为圈际上研究的热点。
共生蘸的生长积搀菌物质的产生与菌株稳培养
万方数据
万方数据
万方数据
·54· 生物加工过程 第4卷第2期
14囊，然后测定其活性，圈定纯酶的滔性及活力隧收
率与酶液用量之间的关系示于图3。由图3中可以
看出，当酶浓度较低时，随着酶液用量的增加，所得
固定化酶活力星持续上升状态，回收率也保持在较
高的水平。这是因为当酶浓度较低时，随着酶浓度
的增加，复合载体上迅速地共价键合了大量的酶，使
固定化酶表现出活性迅速提高，同时活性回收率降
低缓慢，圜诧酶国定他的效力(活力)与效率(圈收
率)都比较高。当酶液用量达到O．05mL时，酶活达
最大值，之后，随着酶浓度的再继续增大，固定化酶
活力开始鬟现下降的趋势，回收率则大幅度下降。
其原因可畿是载体上键合的酶分子过多时，醵分子
之间的距离变小，相互之间的作用力(比如静电排斥
作用)加剧，酶分子的取向及活性部位受到一定的影
响，故使酶活下降。综合考悫粼与蹦，给酶量
取0．05l溅较为合适，即0．1删g。
O．020．040．06O．08O．10O．12O．140．16
酶液用量嫩m
—V一删A：一-一删酣
固定化条件：温度30℃；戊二醛用凝1．2mmovg；
固定化时闻14h
翻3酶液用量瓣固定诧酶悛髓静影晌
Fig．3Efectof he砌ount0fenzymeonthepropenies0fIME
2．2．3固定化温度对网定化酶活性的影响
将o．5殳载体与6缱浓度为O。l氆ol惩的戊二
醛水溶液反应1h，洗涤抽滤后，加入10n1L磷酸盐
缓冲溶液(mP04．K2mU，pH=7．92)，再加入O．15
畦原酶滚，在不同涅度下振荡固定化14ll，然后测
定其活往，围定亿酶的活力及活力圈收率与固定化
温度之间的关系示于图4。从图4可以看出，在温
度30℃时所得固定化酶活力最高，当温度高于30
℃时，活力及活力回收率都呈下降趋势，表嘎在较高
温度下，酶蕉白分子有可能变性失活，故酶的固定化
应该在较湿帮酶温度条件下进行，本磅究的固酶适
宜温度为30℃。由图4还肴到35℃后翮定化酶活
力变化不大，表明本研究的固定化酶具有较好的温
度稳定性。
lOO
80
60
40
20
固定化温度／℃
一V一髭连矗：一●一髭碰
固定化条件：戊二醛瘸量1．2rn瑚d，嚣；
酶液用量O．15—1】L；固定化时间】4h
图4固定化温度对固定化酶的性能的影晌
聚g。4&e￡《建跫融毪筘ra抛瓣on疰砖≯。pe矗ies磋I溉
2，2．4固定化时间对固定化酶活性的影响
将o．5g载体与6InL浓度为0．1mol／L的戊二
醛水溶液反应lh，洗涤抽滤后，加入lO疵磷酸盐
缓冲溶液(砒弛．避Ⅲq，滞=7．92)，再加入0．15
mL原酶液，在30℃下振荡固定化，然后测定其活
性，改变固定化时间，固定化酶的活力及活力回收率
与缫定纯时闻之阀的关系示于图5。从图5中看
到，在很短的时间(8h)，酶相对活力就达到95％，且
活力回收率也高达50％，表明此复合载体对酶固定
化的速率很快，在固酶速度方面明显傀予与其它载
体(在一般载俸上匿酶，达到高活力时至少需要48
h)，这很大程度上归因于复合载体上存在有大量的
物理吸附点(质子化的胺基)。酶的固定化要经历物
理汲辩与讫学键合两个过程，壶予物理吸附速度较
快，在固定化初期，酶分子首先靠物理作用被吸附在
载体表面，尔后发生化学键合得以固定化，复合载体
躞l／si基c8gel对薅分子强烈的物理吸附作用极大地
促进了固酶的速度，故使固定化酶在短时间内(8h)
酶活力就达到了较高的数值。
另外，由图5中可以看出，随着固定化时间的延
长，圈定纯酶活力量缓慢上升趋势，在l霹h时达弱了
最高，随后随着固定化时间的延长，固定化酶活力呈
现蹦下降趋势，故选择14h作为适宜的固定化时间。
万方数据
2∞6年5月 王怒朋等：青霉素酰{艺酶在新型复合载舔上的固定香匕戮究 ·55·
苌
魍
憋
窝
瓣
6 8 10 12 14 16 18
固定化时间，h
一-一烈点：一●一霆粼
固定化条件：温度30℃；戊二醛用量1．2mmoⅣg；
酶液用量0．15IIlIJ
潮5霾庭毒l：爵阑对霆滗酶牲装的彰晌
Fig．5B瞻ctof吐1ereactiontime帅thepmpenies《IME
2．2．5鼹定化pH值对固定化酶活性的影响
将G。3鬟载体与6疵浓度为0。ll溅琵懿戊二
醛水溶液反应1h，洗涤抽滤后，加入lOmL不同pH
值的磷酸盐缓冲溶液，再加入O．05mL原酶液，在30
℃下振荡固定曩二l霹氧，然后测定其活髓，固定纯酶孵
活性及活性回收率与pH值之间的关系示于图6。
5 6 7 8 ≯ lU
pH
一一跫鲢：一●一霆戳
圃定化条件：深度30℃；戊二醛用量l，2mm甜g；
酶液用爨O．05111L；固定化时间14h
霆6 p}|僮对固定魏性能的影响
Kg．6E懿ctofthepH0ntllep叩eIties《IME
由图6中看到，在酸性条件下，随着pH值的上
身，圈定亿酶的活力与固收率都逐渐上秀，当趟值
升至7．92时均达到了最高，其后随着pH值的上升，
活力及嘲收率均出现下降。青霉素酰化酶等电点为
6．5．5。7，在低磷值时，青霉素酰纯酶带正电荷，露
载体也带正电荷，由于静电排斥作用，不利于酶分子
靠近载体，不利于酶的固定化，故固定化酶活力不
高；随着溶液pH值的增大，静电排斥逐渐减小最后
变为静电吸引作震，笈酶的固定化作用不断增强，表
现为固定化酶活力不断升高，且网酶的效率(回收
率)也提高；当pH值超过7．92后，随着pH值的增
大，可能由予复合载体凝魄电位变小，与游离酶之
间的物理吸附作用减弱，影响酶的固定化，故固酶的
活力与效率均下降。本研究酶固定化适宜的pH值
选择在7．9辩近。
通过上述各单因素实验，本研究所确定的在复
合载体PEI／silica烈上阏定化青霉素酰化酶的适宜
条件为：戊二醛用量选1．2㈣l踉，酶液用量O。l
洲g，固定化温度30℃，固定化时间14—15h，固定
化pH值7．9，所制得固定化酶活力回收率46％。
2。3复合载体PEl，silieagel的表面电性畿及酶固定
化原理
本研究所制备的复合载体PEⅣsilica鼯l表面所
键合的PEl大分子链中，拥有大量质子他的胺基
(．N联>N埘)，因此复合载体颗粒表面显正电性，
图7为复合载体颗粒在固定青霉素酰化酶懿的Ze|a
电位瞌线，在很大的pH范围内，Zeta电位为正值，郎
复合载体表面显正电性；青霉素酰化酶的等电点为
6。5。6。7，故在本研究所礁定的躁酶适宜斌条件
(pl{=7．92)下，青霉素酰化酶显负电性。因此凭借
静电相互作用，复合载体表面对酶分子产生强烈的
物理吸附作掰，在很短的时间内就可将酶分子快速
吸附至载体表面，使之进～步发生化学键合(载体上
的醛基与酶分子上的氨基进行席夫碱反应)。因此
物理吸附与化学键合的穗互协嗣，使酶圈定化，充分
保持了酶分子的构象，使固定化酶表现出较高活性
与活力回收率。
60
40
妻zo
O
之O
-。＼7．
●
2 3 4 5 6 7 8 9 lO
pH
圈7赛台载体PE影silica耐的Ze如电位曲线
Fig．7CurveofZetap呲e砸alof蹦／smcagelc删er
∞
踟
∞
船
加
e
麓
舳
融
∞
如
0
器孙戮瓣茛霹
万方数据
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2006年5月 王旭朋等：青霉素酰化酶在新型复合载体上的固定化研究 ·57·
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我国成功研制专门攻杀乙肝病毒的“细胞导弹"·
第四军医大学全军基因诊断技术研究所联合国内多家科研单位，历经10a刻苦攻关，一种全新的乙肝治
疗模式——高通量的乙肝病毒基因突变检测体系、高效能的体细胞疗法体系、可视化的生物芯片疗效评估
体系近日在临床上获得成功，这标志着我国在肝病治疗策略上取得突破性进展。其组合式生物芯片在刚刚
揭晓的第九届中国专利奖评选中荣获金奖。据第四军医大学全军基因诊断技术研究所所长阎小君教授介
绍，这种全新的治疗模式主要是建立了高通量的乙肝病毒基因突变检测体系、高效能的体细胞疗法体系和
可视化的生物芯片疗效评估体系。2003年，他们首次成功地筛选合成出乙肝病毒特异性抗原表位肽。这种
多价位优势抗原表位肽和细胞因子的树突状细胞结合能在短时间内“克隆”大量的淋巴细胞。“细胞导弹”
疗法，就是根据这一原理，从人体内采集出单核细胞，进行体外特殊培养，使其发育成树突细胞并大量扩增
后与效应肽或靶向肽结合，成为专门攻击杀伤乙肝病毒的“细胞导弹”。这种特殊的“导弹”能精确“瞄准”乙
肝病毒进行杀伤，却不会伤及“无辜”。在一系列深人研究的基础上，他们采用体细胞治疗的方法，在国内外
首次成功地为患者进行了“细胞导弹”治疗。目前已有近千名乙肝患者接受了此项治疗，疗效较好。
(贾红华)
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