全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
青霉素酰化酶表达调控的研究进展
蒋咏梅 1 　章文贤 1 　魏东芝 2
(1 福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心 福建师范大学生命科学学院 福建省现代发酵技术工程研究中心 ,福州 350108;
2华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 鲁华生物技术研究所 ,上海 200237)
　　摘 　要 : 　青霉素酰化酶 (penicillin acylase, PAC)是抗生素工业的重要酶。它在大肠杆菌中需经过复杂的转录、翻译和后
翻译才能成熟 ,且后翻译过程对活性酶的最终形成影响很大。在阐述 PAC的苯乙酸诱导机制的基础上 ,详细论述了 PAC的
后翻译过程 ,并对几种主要的影响因素进行了分析。
关键词 : 　青霉素酰化酶 　大肠杆菌 　诱导机制 　后翻译过程 　影响因素
Studies of Regulating of Expression of Recombination Pen icllin Acylase
J iang Yongmei1 　Zhang W enxian1 　W ei Dongzhi2
(1 Engineering R esearch Center of Industria l M icrobiology, M inistry of Education, College of L ife Sciences, Fujian N orm al University;
Engineering Research Center of Fujian M odern Ferm entation Technology, Fuzhou 350108; 2 S tate Key Laboratory of
B ioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237)
　　Abs trac t: 　Penicillin acylase ( PAC) is an important enzyme of antibiotics industrial. Formation of mature PAC in Escherichia coli
involves transcrip tion, translation and posttranslational step which is the key p rocess. This paper reviewed the mechanism of PAC in2
duction, posttranslational p rocess and main influencing factors of formation of active PAC.
Key wo rds: 　Penicillin acylase　Escherichia coli　Mechanism of induction　Posttranslational step　Effect factor
收稿日期 : 2009205220
基金项目 :上海市重点学科建设项目 (B505)
作者简介 :蒋咏梅 (19712) ,博士 ,研究方向 :生物化工 ; E2mail: ym jiangbio@fjnu. edu. cn
通讯作者 :魏东芝 (19632) ,男 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向 :生物催化工程和生物制药工程 ; E2mail: dzhwei@ ecust. edu. cn
　　青霉素酰化酶 ( E. C. 3. 5. 1. 11)自 1950年首次
在黄青霉 ( Penicilnum chysogenum ) Q176 中发现以
来 ,就以其良好的催化酰化 /去酰化特性受到了广泛
关注。 PAC不仅能催化 62APA、72ADCA 与侧链化
合物缩合生成各种高效低毒的半合成抗生素 ,还可
应用于许多有潜在价值的反应中 ,如在肽的合成过
程中用于保护氨基和羟基 ,以及用于手性化合物的
拆分等 [ 1 ]。
产生青霉素酰化酶的微生物很多 ,可分为革兰
氏阴性菌 ( G2 )和革兰氏阳性菌 ( G+ )两大类 ,前者
有大肠杆菌 ( Escherich ia coli ATCC 11105, Ec) ,嗜柠
檬酸克鲁沃尔氏菌 ( Kluyvera citroph ila ATCC 21285,
Kc) ,雷氏普罗威登斯菌 ( P rovidencia rettgeri ATCC
31052, Pr) ,粪产碱杆菌 (A lcaligenes faecalis, Af)与
无色杆菌木糖氧化属 (Achrom obacter xy losox idans,
Ax)等 ;后者有巨大芽孢杆菌 (B acillus m ega terium
ATCC 14954, Bm )与粘节杆菌 (A rthrobacter viscosus
ATCC 15294, Av)等。G2菌产生的 PAC通常定位于
周质空间 , G+ 菌产生的青霉素酰化酶则分泌于
胞外。
目前研究最多的是大肠杆菌来源的青霉素酰化
酶 ,它定位于周质空间 ,由α(24 kD)和β(65 kD )两
个亚基组成。 pac 基因首先转录表达产生前体
PAC,再经复杂的后翻译形成有活性的成熟酶。该
过程与哺乳动物中的激素形成相似 ,这在细菌中极
为罕见。
1　青霉素酰化酶基因的表达调控
大肠杆菌中 , pac的转录效率通常很低 ,将 pac
基因置于强启动子的控制下 ,并在核糖体结合位点
和起始密码子之间插入一段间隔序列能够分别提高
2009年第 9期 蒋咏梅等 :青霉素酰化酶表达调控的研究进展
转录和翻译效率 ,并最终提高 PAC产量 ,但过表达
的酶无活性且发现了包涵体的聚集 [ 2 ]。
对青霉素酰化酶在大肠杆菌中的表达研究发
现 ,主要存在 3种调控机制 :分解代谢阻遏、PAA诱
导 ,温度调节。在野生型大肠杆菌中 , PAC的表达
受碳源的调节 ,有些碳源如甘油、乳糖、果糖和葡萄
糖对 pac基因的表达有代谢抑制作用 ,而苯乙酸作
为惟一碳源对 pac基因转录有诱导作用 ,这些底物
是在转录水平上影响 pac基因的表达 [ 3 ]。K. citro2
ph ila中 PAC的合成也存在类似情况。在 P. rettgeri
中则恰恰相反 , PAC的表达既不受 PAA诱导也不受
葡萄糖的抑制 ,但 TCA循环中的琥珀酸 ,延胡索酸 ,
苹果酸却能够抑制 PAC的表达 [ 4 ]。A. faeca lis, A.
viscosu和 B. M egaterium 中的 PAC表达同样受 PAA
诱导 ,但不受分解代谢阻遏抑制。 PAC表达的温度
调控则广泛存在于上述菌株中。
2004年 Kim等 [ 5 ]对 PAA的诱导机制进行了研
究 ,发现在 E. coliW ATCC 11105中 , PaaX是 pac基
因表达的阻遏物 , PAA的真正作用是将 pac基因从
PaaX的阻遏中解脱出来 ,具体机制如图 1所示。
A. pac启动子 ; B. 正常生活状态下 PaaX阻遏 pac表达 ; C. PAA的去
阻遏作用
图 1　pac基因调控模型 [ 5]
在大肠杆菌 pac的启动中 , PaaX和 cAMP2CRP
复合物竞争性地与 CRP结合位点 Ⅰ相结合 ,因而它
们的存在对 pac的表达产生相反的作用。在 PAA
不存在时的正常生长状况 , PaaX结合于 pac操纵子
上的结合位点 ,由于该位点与 CRP的结合位点相交
叠 ,导致 cAMP2CRP复合物无法与 CRP位点结合 ,
因此 PAC不能表达 (图 1)。当培养基中存在 PAA
时 ,它进入细胞核质内被 PaaK催化形成 PAA2CoA
复合物 ,进而阻止 PaaX之间的相互作用 ,使 PaaX
无法与 pac操纵子相结合。而 cAMP2CRP复合物在
与高亲合性的 CRP结合位点 Ⅱ结合后 ,便可以与空
闲的 CRP结合位点Ⅰ结合 ,继而启动 pac的转录。
2　青霉素酰化酶的后翻译过程
大肠杆菌中 ,形成活性 PAC的过程较为复杂 ,
首先经转录和翻译形成带有信号肽 ,间隔肽 ,α和β
亚基的前蛋白酶原 (ppPAC, 95 kD ) ,后翻译过程包
括 : (1)在信号肽的引导和分子伴侣的帮助下 , pp2
PAC转运至周质空间 ,通过质膜的同时 , 26个氨基
酸的信号肽被蛋白酶水解除去形成酶原 (pPAC, 91
kD) ; (2)从β亚基的 N端切除连接肽产生β亚基
(557个氨基酸 , 65 kD) ; (3)α亚基进一步通过分子
内或分子间的自催化作用从 C端水解 ,同时 54个氨
基酸的间隔肽被切除 (209个氨基酸 , 24 kD ) [ 6 ] ,最
终产生由 209个氨基酸的α亚基和 557个氨基酸的
β亚基折叠成的活性酶。青霉素酰化酶基因表达及
其后加工过程见图 2。
S. 信号肽 ;α.α亚基 ; C. 连接肽 ;β.β亚基
图 2　大肠杆菌中 PAC的表达及成熟过程 [ 7]
成熟的青霉素酰化酶是由α亚基和β亚基组
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
成的 ,但这两个亚基在单独存在时均无活性 ,将它们
的基因分别构建在不同的质粒上 ,放入同一个宿主
中表达时 ,细胞质中的酶活则可恢复至野生菌株的
水平。此外 ,间隔肽对酶活的影响也很大 ,在 α亚
基与β亚基之间加上一个长度为 54个氨基酸的间
隔肽时 ,活力明显降低。
由图 2可见 ,青霉素酰化酶表达的基因调控过
程很复杂 ,影响因素也较多。为得到高产量的活性
青霉素酰化酶 ,除了从转录和转译水平促进 PAC的
表达外 ,还需要提高后翻译的效率。 Ignatova[ 8 ]通过
在培养基中加入氯霉素阻止蛋白质继续合成 ,研究
后翻译水平对 PAC产量的影响 ,发现 PAC的成熟
过程中 ,限制其产量的关键步骤包括蛋白酶水解 ,通
过质膜的转运过程和分子伴侣介导的蛋白重折叠。
3　影响后翻译过程的因素
311　蛋白酶水解
大肠杆菌中 ,外源蛋白在细胞内的过表达常常引
起一系列生理反应 ,如中间代谢和调节功能的改变 ,
细胞生长停滞 ,核糖体破坏和细胞死亡等 ,给宿主本
身带来严重的生理负担 [ 9 ]。因此 ,细胞的胞质内 ,周
质空间和质膜上有大量内肽酶用于水解外源蛋白 ,水
解后的肽链则继续被肽末端降解酶消化。研究表明 ,
胞内超过 90%已合成的 PAC前体被胞内蛋白降
解 [ 8 ]。为减少 PAC的降解 ,可采用某些特定的方法 ,
如使用蛋白酶缺陷菌株 ,低温培养宿主菌 ,共表达分
子伴侣 ,调整发酵条件 ,降低细胞生长速率 ,改变蛋白
质特定的氨基酸残基以消除蛋白酶切位点等。
312　通过质膜的过程
外源蛋白在胞质内合成后 ,可能定位于不同的
细胞部位 ,如周质空间 ,细胞外膜 ,甚至胞外的培养
基中 [ 10 ]。周质空间为氧化状态 ,其中存在利于含二
硫键蛋白正确折叠的酶 ,且细胞的大多数自身蛋白
聚集于胞内 ,因而外源蛋白定位于周质空间对后期
的提取更为有利 ,这就需要正确的信号肽来引导蛋
白通过合适的转运系统跨越质膜。
31211　信号肽的影响 　信号肽在 PAC前体肽的跨
膜转运过程中起着极其重要的作用 ,它可协助完整
的前体蛋白转移到周质空间 ,信号肽的切除则是
PAC在大肠杆菌中表达加工过程的关键步骤 ,发生
在前体蛋白穿过原生质膜的过程中。移除信号肽的
突变株虽然可以完成部分后翻译过程 ,但 PAC活性
明显下降 ,无活性的前体肽积累在胞浆中 ,且间隔肽
未被加工切除 [ 11 ]。有人曾通过设计引导肽的序列
使蛋白前体顺利通过质膜 [ 12 ]。采用疏水性的信号
肽可带动 ppPCA从胞浆内转运到周质空间 ,提高青
霉素酰化酶的分泌和折叠能力。Monroy[ 13 ]对大肠
杆菌的信号肽基因序列的 Lys2～Thr13 (N 端 )和
A la14～Leu25 (C端 )进行随机诱变 ,发现有几个信
号肽突变株的分泌表达水平比野生型提高了 4倍。
31212　转运系统 　大肠杆菌中大多数蛋白都是通
过 Sec系统转运的。其中 , SecB是帮助转运胞外蛋
白和周质空间蛋白分泌的重要组分 ,缺失 SecB的突
变株则失去了生产活性 PAC的能力 ,这种缺陷可通
过染色体外的 SecB共表达得以恢复。但是 ,过表达
SecB并不能提高活性 PAC的产量 ,只能减少胞内包
涵体的形成 ,说明 SecB的主要作用在于有效地转运
ppPAC进入周质空间 [ 14 ]。
最近发现的双精氨基酸转运系统 ( Tat)能够转运
Sec不能转运的蛋白。识别序列为 SRRXFLK,其中含
有两个精氨酸残基 [ 15 ]。大肠杆菌 ppPAC的信号肽虽
然只含有被天冬氨酸分隔开的两个精氨酸残基 ,但在
研究 E. coli JARV15的 Tat突变体发现 , ppPAC的信
号肽也能有效地通过 Tat转运。而且 ,两个精氨酸中
间天冬氨酸缺失或被 Lys置换也不会对 Tat转运造成
影响。但是如果将第二个精氨酸转变成丝氨酸 ,则
Tat转运系统失效 , ppPAC 转而进入 Sec 转运系
统 [ 16 ]。将 ppPAC原来的信号肽转换成依赖 Sec B的
OmpT信号肽 ,随着 SecB的过表达 ,仍然发现 pPAC
成功地转运至周质空间中 [ 17 ]。
31213　辅因子的影响 　酶的辅因子为酶的生物学
活性或成熟所必须的离子或分子。这些金属离子不
直接参与酶的功能 ,但对于成熟 ,活性和酶的稳定性
很重要。成熟 EcPAC的晶体结构中观察到每个酶
分子都与一个钙离子紧密结合 [ 18 ]。来源于 E. coli,
P. rettgeri, A. faeca lis, A. viscosus和 K. citroph ila的青
霉素酰化酶 [ 19, 20 ]中也同样发现了钙离子的踪迹。
钙被 PAC分子包埋在内部深处 ,说明它的结合优先
于转运的发生。
钙离子是 ppPAC的膜转运、正确折叠和成熟所
必需的辅因子 ,因此活性 PAC的产量就部分依赖于
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培养基中的钙离子浓度。当培养基中钙离子浓度增
加到 60～750μM 时 , E. coli BL21 (DE3)中 AfPAC
和 EcPAC的产量增加了两个数量级 [ 21 ]。分别通过
Tat系统和 Sec系统转运的 EcppPAC和 AfPAC,均
发现钙缺乏时前体肽在胞质内的积累。E. coli BL21
(DE3)中表达 EcPAC时 ,培养基中钙离子浓度增加
到 100 mM可使产量提高 3倍 , PAC从胞内向周质
空间的转运能力也得到大幅提高 [ 22 ]。
313　蛋白的重折叠
青霉素酰化酶的前体酶原 (ppPAC)去除信号肽
进入周质空间后 ,还需要分子伴侣切除空间肽才能折
叠成有活性的 PAC。分子伴侣通常分为两种 ,一种是
转运系统中的组分蛋白 ,如 SecB;另一种通常是些热
休克蛋白 ,如 GroEl和 DnaK。自从发现周质空间也
存在包涵体以来 ,周质空间内的蛋白折叠同样成为一
个普遍的问题 [ 23 ]。过表达分子伴侣提高周质蛋白产
量的策略被广泛应用。Chou[ 24 ]发现 ,胞质和周质空
间都有成熟的 PAC,说明后翻译过程同时存在于胞质
和周质空间。还通过共表达分子伴侣 trigger因子 ,
GroEL /ES和 DnaK/J2GrpE,增加了 PGA成熟限制性
步骤的效率 ,其中 trigger因子效果最为明显。
DegP是同时具有蛋白酶活性和分子伴侣活性
的热休克蛋白 ,为大肠杆菌细胞外膜蛋白水解所必
须。DegP在周质空间的共表达可防止前体 PAC在
周质空间的错误折叠 ,明显减少了包涵体量 ,但该策
略对胞内 PAC前体的累积没有效果 [ 25, 26 ]。当共表
达缺失蛋白酶活性而保留分子伴侣活性的 DegP
时 , PAC活性没有增加 ,说明 DegP的蛋白酶活性是
促进折叠的主要因素 ,可能 pac过表达时错误折叠
的蛋白需要它来降解。但是 ,周质空间蛋白酶的缺
失并非形成包涵体的主要原因 ,因为共表达与 DegP
相似的周质空间蛋白酶 DegS或 DegQ也同样无法
提高 PAC的活性 ,说明 DegP的分子伴侣活性和蛋
白酶活性都是 PAC成熟过程所必须的 [ 27 ]。
4　总结
青霉素酰化酶的表达包括转录、转译及复杂的后
翻译过程。细胞中 ,首先形成的是 PAC的前体多肽 ,
包括引导肽 ,连接肽和α,β亚基 ,在跨越质膜进入周
质空间的过程中去除引导肽和连接肽 ,再经重新折叠
才能形成有活性的 PAC。该过程中的任何步骤都有
可能成为产生活性青霉素酰化酶的瓶颈。因此 ,在
PAC的表达中 ,仅仅提高 pac基因的转录和翻译效
率 ,提高蛋白表达量远远不够。只有通过调控菌体生
长的代谢过程和环境中的诸多因素 ,维持一个从转
录 ,翻译到后翻译过程的蛋白合成流 ,才能最大限度
减少包涵体的形成 ,提高活性 PAC的产量。
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