全 文 ：第 １３卷第 ６期
２０１５年 １１月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ６
Ｎｏｖ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０６􀆰 ００９
收稿日期：２０１４－０４－１１
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１２ＡＡ０２２１０８）；国家自然科学基金（３１１０１２２９）；无锡市科技支持项目（ＣＬＥ０１Ｎ１１１１）
作者简介：罗秋玲（１９８８—），女，河南周口人，硕士研究生，研究方向：生物工程；吴　 静（联系人），副教授，ｗｕｊｉｎｇ＠ ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ；邬敏辰（联
系人），教授，ｂｉｏｗｍｃ＠ １２６．ｃｏｍ
乙偶姻对解淀粉芽胞杆菌细胞生理的影响
罗秋玲１，２，３，吴　 静１，邬敏辰１
（１．江南大学 无锡医学院，江苏 无锡 ２１４１２２； ２．江南大学 药学院，江苏 无锡 ２１４１２２；
３．江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 ２１４１２２）
摘　 要：以出发菌株解淀粉芽胞杆菌 ＦＭＭＥ０４４和其突变株 Ｅ １１为研究对象，研究在不同浓度乙偶姻胁迫下，菌
株的细胞活力、细胞存活率、胞内蛋白含量、膜电位和膜通透性的变化。 结果表明：在不同乙偶姻浓度下，突变株
Ｅ １１ 的细胞活力、菌体存活率、胞内蛋白含量和膜电位均高于出发菌株 ＦＭＭＥ０４４。 当乙偶姻质量浓度为 ４０、６０
和 ８０ ｇ ／ Ｌ时，与出发菌株相比，突变株 Ｅ １１ 的细胞活力分别提高了 ７􀆰 １６％、１７􀆰 ７％和 ４０􀆰 １％；存活率分别提高了
９􀆰 ０９％、１８􀆰 ３％和 ３８􀆰 ２％；胞内蛋白含量分别提高了 ９􀆰 ６３％、１９􀆰 １％和 ３１􀆰 ６％；膜电位比出发菌株分别提高了
６􀆰 ２８％、９􀆰 １４％和 ２７􀆰 １％。 突变株 Ｅ １１ 的膜通透性低于出发菌株，分别降低了 ６􀆰 ３３％、１６􀆰 １％和 ３３􀆰 １％。 在抵抗
外界乙偶姻情况下，乙偶姻耐受性菌株 Ｅ １１ 的这些参数均高于出发菌株（膜通透性相反）。 说明乙偶姻会对细胞
产生毒性，但这种毒性可以通过增加菌体自身抗性而得以缓解。
关键词：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ；乙偶姻；细胞生理；耐受性；毒性
中图分类号：Ｑ９３５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０６－００４９－０６
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｅｔｏｉｎ ｏｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｃｅｌｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ
ＬＵＯ Ｑｉｕｌｉｎｇ１，２，３，ＷＵ Ｊｉｎｇ１，ＷＵ Ｍｉｎｃｈｅｎ１
（１．Ｗｕｘｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，
Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；３．Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ
Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｅｔｏｉｎ ｏｎ ｃｅｌｌ ｖｉｔａｌｉｔｙ，ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ，ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ，ｃｅｌｌ ｏｆ ｔｈｅ
ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ Ｅ⁃１１ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ
ＦＭＭＥ０４４． Ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｃｅｔｏｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ｃｅｌｌ ｖｉｔａｌｉｔｙ，ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ，ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ，ｃｅｌｌ ｏｆ
ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ Ｅ⁃１１ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ＦＭＭＥ０４４． Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ａｃｅｔｏｉｎ ａｔ ４０，６０ ａｎｄ ８０ ｇ ／ Ｌ， ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ＦＭＭＥ０４４， ｉｔｓ ｃｅｌｌ ｖｉｔａｌｉｔｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ
７􀆰 １６％，１７􀆰 ７％ ａｎｄ ４０􀆰 １％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； ｉｔｓ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ９􀆰 ０９％， １８􀆰 ３％ ａｎｄ ３８􀆰 ２％，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ｉｔｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ９􀆰 ６３％，１９􀆰 １％ ａｎｄ ３１􀆰 ６％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ６􀆰 ２８％，９􀆰 １４％ ａｎｄ ２７􀆰 １％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｗｈｅｒｅａｓ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ
ｍｕｔａｎｔ Ｅ⁃１１ ｒｅｄｕｃｅｄ （６􀆰 ３３％，１６􀆰 １％ ａｎｄ ３３􀆰 １％ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｅｎ ａｃｅｔｏｉｎ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｔｏ ４０，６０ ａｎｄ ８０ ｇ ／ Ｌ）． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ａｃｅｔｏｉｎ，ｔｈｅｓｅ
ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｅｔｏｉｎ⁃ｔｏｌｅｒａｎｔ ｍｕｔａｎｔ Ｅ⁃１１ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ＦＭＭＥ０４４ （ ｍｅｍｂｒａｎｅ
ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｖｉｃｅ ｖｅｒｓａ）． Ａｌｌ ｔｈｅｓｅ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｃｅｔｏｉｎ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｄｕｃｅ ｔｏｘｉｃ ｔｏ ｃｅｌｌｓ，
ｂｕｔ ｔｈｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｅａｓｅｄ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ａｃｅｔｏｉｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ； ａｃｅｔｏｉｎ； ｃｅｌｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ； ｔｏｌｅｒａｎｃｅ； ｔｏｘｉｃｉｔｙ
　 　 乙偶姻作为一种重要的化学合成中间体，广泛
应用于食品、制药、化工等领域［１－３］，已被美国能源
部指定为优先开发的平台化合物［４］。 目前，乙偶姻
的生成方法主要包括化学法、酶转化法和微生物发
酵法。 与化学合成法和酶转化法相比，微生物发酵
法生产乙偶姻具有生产效率高、原料来源广泛、成
本低廉等优势，因此，开展微生物发酵法生产乙偶
姻的技术研究，具有重要意义。 安全菌株，如解淀
粉芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ） ［５］、短小芽胞
杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ） ［６］、枯草芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ） ［７］和地衣芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ） ［８］
等，都是乙偶姻生产最常使用的发酵菌株，它们都
具有发酵速度快、高产乙偶姻等优良特性。 然而，
在发酵后期，高浓度乙偶姻的毒性影响到菌体的生
长、存活和发酵能力，进而限制了乙偶姻浓度的提
高。 Ｚｈｕ 等［９］报道，高浓度乙偶姻的存在不但影响
菌体生长，而且也会影响聚 Ｌ 谷氨酸（γ ＰＧＡ）
的发酵生产。
目前，微生物发酵生产乙偶姻的研究主要集中
于以下四个方面：解析代谢机制［１０］，调控代谢流量、
抑制产物分解［１１］，筛选高产菌株［１２］，静息细胞法生
成高纯度立体异构体乙偶姻［１３］。 虽然，有文献报道
可以通过增加提高底物耐受性来提高乙偶姻的产
量［８］，但是人们却忽略了菌株对产物乙偶姻的耐受
性。 乙偶姻作为有机溶剂对细胞产生毒性，高浓度
的乙偶姻甚至会造成细胞死亡，进而影响细胞进一
步生成乙偶姻。 因此，为了更进一步加强乙偶姻的
产量和生产强度，需要了解乙偶姻抑制生理学基
础，分析菌株耐受乙偶姻机制，通过代谢工程手段
改造解淀粉芽胞杆菌，提高其对乙偶姻的耐受能
力，从而提高乙偶姻产量。
笔者应用乙偶姻处理出发菌株（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆ⁃
ａｃｉｅｎｓ ＦＭＭＥ０４４）和耐受高浓度乙偶姻突变株 Ｅ
１１，四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）法测定细胞活力、血球
计数法计算细胞存活率、分光光度计法测定细胞内
蛋白含量、荧光分光光度计检测罗丹明 １２３（Ｒｈ１２３）
和二乙酸荧光素（ＦＤＡ）细胞染色的荧光强度的变
化，来探讨细胞经不同浓度乙偶姻处理细胞生长性
能、膜电位和膜透性的变化，初步研究菌株耐受高
浓度乙偶姻的机制，以期为选育优良菌株和提升乙
偶姻发酵生产奠定基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌种
解 淀 粉 芽 胞 杆 菌 （ Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
ＦＭＭＥ０４４）保藏于笔者所在实验室。 耐受乙偶姻的
突变株 Ｅ １１ 是由 Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＭＭＥ０４４ 经
亚硝基胍诱变和适应性进化筛选获得。
１􀆰 ２　 主要试剂和仪器
１􀆰 ２􀆰 １　 主要试剂和仪器
ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、二甲亚砜，国药
集团化学试剂有限公司；四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）、
罗丹明 １２３ （Ｒｈ１２３）、二乙酸荧光素（ＦＤＡ），Ｓｉｇｍａ
公司；ＵＶｍｉｎｉ １２４０ 型紫外 可见光分光光度计、
Ｆ ４５００型荧光分光光度计，日本岛津公司； １
１４ＤＥ型冷冻离心机，Ｓｉｇｍａ公司；ｉＭＡＲＫ 酶标仪，伯
乐公司；ＸＯ ６５Ｄ型超声波细胞破碎仪，南京先欧仪
器制造有限公司。
１􀆰 ２􀆰 ２　 主要试剂的配制
１） ０􀆰 ０１ ｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）的配制。
称取 ８ ｇ ＮａＣｌ、０􀆰 ２ ｇ ＫＣｌ、１􀆰 ４４ ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４和 ０􀆰 ２４ ｇ
ＫＨ２ＰＯ４，溶于 ８００ ｍＬ蒸馏水中，用 ＨＣｌ调节溶液的
ｐＨ至 ７􀆰 ４，最后加蒸馏水定容至 １ Ｌ即可。
２）配制 ＭＴＴ溶液。 精确称取 ０􀆰 ５ ｇ ＭＴＴ，用蒸
馏水定容至 １００ ｍＬ，４ ℃避光贮存于冰箱备用。
３）配制 Ｒｈ１２３ 溶液。 用无水乙醇配制 ０􀆰 １９
ｍｇ ／ ｍＬ的 Ｒｈ１２３溶液，４ ℃避光贮存于冰箱备用。
４）配制 ＦＤＡ 溶液。 精确称取 ２００ ｍｇ ＦＤＡ，用
丙酮定容至 １００ ｍＬ，４ ℃避光贮存于冰箱备用。
１􀆰 ３　 培养基
种子培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ６０、酵母粉 １０、大豆
蛋白胨 １０、牛肉膏 １０、ＮａＣｌ ５。
固体培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０、酵母粉 １０、大豆
蛋白胨 １０、ＮａＣｌ ５、琼脂粉 ２０。 ｐＨ ７􀆰 ０。
乙偶姻耐受性机制研究的培养基（ｇ ／ Ｌ）：乙偶
姻（０、４０、６０和 ８０）、 葡萄糖 ６０、酵母粉 １２􀆰 ５、大豆蛋
白胨 １２􀆰 ５、Ｋ２ＨＰＯ４ ３、ＫＨ２ＰＯ４ ３、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ４。
１􀆰 ４　 实验方法
１􀆰 ４􀆰 １　 细胞培养与处理
从冷藏的甘油管中取 ０􀆰 ２ ｍＬ 接入装有 ５０ ｍＬ
０５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
种子培养基的 ５００ ｍＬ 三角瓶中，３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ
振荡培养 １２ ｈ。 按 １０％的接种量将种子接入含有
７０ ｍＬ乙偶姻耐受性机制研究培养基的 ７５０ ｍＬ 摇
瓶中，３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ振荡培养 ６ ｈ，然后加入乙偶
姻，使培养基乙偶姻质量浓度最终为 ０、４０、６０ 和 ８０
ｇ ／ Ｌ，６ ｈ后取样测指标。
１􀆰 ４􀆰 ２　 细胞活力检测
取经过不同浓度乙偶姻处理的细胞，调 ＯＤ６００至
１􀆰 ０，加入 ９６ 孔培养板（１００ μＬ ／孔）中。 然后再加
入 ＭＴＴ ２０ μＬ ／孔，放置于 ３７ ℃培养箱中培养 ４ ｈ，
培养结束后，小心吸弃各个培养孔内上清液，之后
每孔加入 １００ μＬ的二甲亚砜并振荡摇匀 １０ ｍｉｎ，在
酶标仪上测定各孔吸光度 Ａ４９０（波长 ４９０ ｎｍ） ［１４］。
１􀆰 ４􀆰 ３　 菌体存活率的测定
用平板计数法［１５］测定存活率，在无菌台下把不
同条件处理的细胞稀释到 ＯＤ６００ ＝ １，取相同体积的
稀释液，５ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ，离心 ５ ｍｉｎ，收集菌体，用相同
体积的生理盐水重悬洗涤 ２ 次，然后悬浮于生理盐
水中。 取 １ ｍＬ 悬浮液将细胞稀释到 １０－４、１０－５和
１０－６后，各取 ０􀆰 １ ｍＬ 涂布于固体培养基平板中，３７
℃培养 １ ｄ，计算菌落数（每个梯度 ３ 个平行）。 菌
体存活率计算见式（１）。
存活率＝存在乙偶姻的菌落数 ／对照菌落数×１００％
（１）
１􀆰 ４􀆰 ４　 胞内蛋白含量的测定
取经过不同浓度乙偶姻处理的细胞，调 ＯＤ６００ ＝
１，取 １ ｍＬ 于离心管中，５ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ 收集
菌体，１ ｍＬ ＰＢＳ 溶液洗涤 ２ 次，清除胞外残留蛋白，
离心弃上清液，加入 １ ｍＬ蒸馏水，２００ Ｗ超声破碎细
胞 ２０ ｍｉｎ，得胞内蛋白提取液。 取 ２０ μＬ蛋白提取液
加入酶标板，再在各孔加入 ２００ μＬ Ｂｒａｄｆｏｒｄ 试剂，迅
速振荡混匀 １～２次。 反应 １０ ｍｉｎ 后，在酶标仪上测
各孔的 Ａ５９５值［１６］，计算其标准曲线见式（２）。
ｙ ＝ ０􀆰 ００１ ７ｘ ０􀆰 ０１３ ８，Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９９８ ７ （２）
１􀆰 ４􀆰 ５　 膜电位和通透性的测定
参照文献［１７］测定膜电位和通透性，具体方法
如下。
１）膜电位的测定。 取一定体积的菌液，５ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ，ＰＢＳ（１×）溶液重悬洗涤 ２ 次，离
心弃上清液。 用 ＰＢＳ 稀释样品 ＯＤ６００至 １􀆰 ０，取
０􀆰 ５ ｍＬ 处理好的菌悬液于离心管中加入 ０􀆰 １９
ｍｇ ／ ｍＬ Ｒｈ１２３ 乙醇溶液 ５０ μＬ 和 ４５０ μＬ ＰＢＳ，避
光反应 ２０ ｍｉｎ，ＰＢＳ溶液洗涤 ３ 次，离心弃上清液，
加入 ０􀆰 ５ ｍＬ ＰＢＳ，使用荧光分光光度计测定。
２）膜通透性的测定。 取一定体积的菌液，５ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ，ＰＢＳ（１×）溶液重悬洗涤 ２次，离心
弃上清液。 用 ＰＢＳ 稀释样品 ＯＤ６００至 １􀆰 ０，取 １ ｍＬ
处理好的菌悬液于离心管中加入 ２ ｍｇ ／ ｍＬ ＦＤＡ 丙
酮溶液 ５００ ｍＬ 和 ５００ ｍＬ ＰＢＳ，混匀、避光反应 ３０
ｍｉｎ，然后离心弃上清液，ＰＢＳ重悬液洗涤 ３ 次，离心
弃上清液并加入 １ ｍＬ ＰＢＳ，使用荧光分光光度计
测定。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 乙偶姻浓度对解淀粉芽胞杆菌生长性能的
影响
２􀆰 １􀆰 １　 ＭＴＴ实验分析乙偶姻浓度对细胞活力的影响
利用 ＭＴＴ 方法检测经过乙偶姻处理的细胞活
力，结果见图 １。 由图 １ 可知： 对于突变株 Ｅ １１，
与未添加乙偶姻（对照）相比，乙偶姻质量浓度为
４０、６０ 和 ８０ ｇ ／ Ｌ 时，细胞活力分别降低了 ２６􀆰 ５％、
３９􀆰 ９％和 ６１􀆰 ２％；对于出发菌株 ＦＭＭＥ０４４，与其对
照组相比，乙偶姻质量浓度为 ４０、６０和 ８０ ｇ ／ Ｌ时，细
胞活力分别降低了 ２９􀆰 ０％、４７􀆰 ２％和 ７１􀆰 ３％；当乙偶
姻为 ０、４０、６０ 和 ８０ ｇ ／ Ｌ 时，突变株Ｅ １１的细胞活
力比出发菌株 ＦＭＭＥ０４４ 提高了 ３􀆰 ５０％、７􀆰 １６％、
１７􀆰 ７％和 ４０􀆰 １％。 细胞活力是表征微生物细胞的活
性或活的微生物细胞数量，能及时反映微生物细胞
的生长状况［１４］，乙偶姻的存在直接影响了细胞正常
生长，但这种影响程度会因菌体对乙偶姻耐受性的
提高而得以缓解。
图 １　 ＭＴＴ分析乙偶姻浓度处理后的细胞活力变化
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｅｔｏｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ
ｃｅｌｌ ｖｉｔａｌｉｔｙ ｂｙ ＭＴＴ ａｓｓａｙ
２􀆰 １􀆰 ２　 乙偶姻浓度对菌体存活率的影响
单纯通过测定菌体密度研究乙偶姻对菌株的
影响，并不能说明菌体细胞的存活情况，因此，需
１５　 第 ６期 罗秋玲等：乙偶姻对解淀粉芽胞杆菌细胞生理的影响
要通过测定细胞的存活率来考察乙偶姻对菌株的
影响。 用不同浓度乙偶姻处理菌体，菌体的存活
率发生变化，结果见图 ２。 由图 ２ 可知：与对照相
比，对于突变株 Ｅ １１ 菌体存活率分别降低了
２２􀆰 ３％（４０ ｇ ／ Ｌ）、４４􀆰 ３％ （ ６０ ｇ ／ Ｌ）和 ６４􀆰 ９％ （ ８０
ｇ ／ Ｌ）；对于出发菌株 ＦＭＭＥ０４４，与对照相比，菌体
存活率分别降低了 ２８􀆰 ８％ （ ４０ ｇ ／ Ｌ），５２􀆰 ９％ （ ６０
ｇ ／ Ｌ）和 ７４􀆰 ６％（８０ ｇ ／ Ｌ）；与出发菌株相比，突变株
Ｅ １１ 的存活率分别提高了 ９􀆰 ０９％ （ ４０ ｇ ／ Ｌ），
１８􀆰 ３％（６０ ｇ ／ Ｌ）和 ３８􀆰 ２％（８０ ｇ ／ Ｌ）。 这些结果说
明：乙偶姻的存在会导致细胞的死亡，浓度越大死
亡率越高，通过提高菌株对乙偶姻耐受性可以减
少菌体的死亡，从而进一步提高菌体发酵生产乙
偶姻的能力。 这也验证了在有机溶剂 ／水两相系
统中，会有少量有机溶剂吸附在细胞表面，并能通
过细胞外膜渗透进细胞周质和细胞质，对细胞膜
造成破坏，导致细胞死亡［１５］ 。
图 ２　 乙偶姻浓度对出发菌株 ＦＭＭＥ０４４和
突变菌株 Ｅ １１菌体存活率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｅｔｏｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ
２􀆰 １􀆰 ３　 乙偶姻浓度对胞内蛋白外泄的影响
胞内蛋白是细胞亚细胞结构及酶系的组成物
质，细胞内物质整性对于维持细胞正常生理代谢是
必不可少的。 为了研究在不同浓度乙偶姻存在下
胞内蛋白外泄的情况，考察突变株和出发菌株在不
同浓度乙偶姻处理下，经过细胞破碎后，胞内蛋白
含量的变化结果见图 ３。
由图 ３ 可知：胞内蛋白含量随着乙偶姻浓度的
增加而下降。 对于突变株 Ｅ １１，与对照相比，乙偶
姻质量浓度为 ４０、６０ 和 ８０ ｇ ／ Ｌ时，胞内蛋白含量分
别降低了 １６􀆰 ４％、２７􀆰 ７％和 ４２􀆰 ９％；对于出发菌株
ＦＭＭＥ０４４，与对照组相比，乙偶姻质量浓度为 ４０、６０
和 ８０ ｇ ／ Ｌ 时，胞内蛋白含量分别降低了 １８􀆰 ５％、
图 ３　 乙偶姻浓度对出发菌株 ＦＭＭＥ０４４和突变株
Ｅ １１胞内蛋白外泄的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｅｔｏｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｌｅａｋａｇｅ ｏｆ
ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
３５􀆰 １％和 ５３􀆰 ６％；对比分析出发菌株与突变株 Ｅ
１１胞内蛋白的含量，在不同乙偶姻浓度条件下，突
变株 Ｅ １１ 胞内蛋白含量高于出发菌株，即当乙偶
姻质量浓度为 ０、４０、６０ 和 ８０ ｇ ／ Ｌ 时，突变株 Ｅ １１
的胞内蛋白含量分别比 ＦＭＭＥ０４４ 高 ６􀆰 ９１％、
９􀆰 ６３％、１９􀆰 １％和 ３１􀆰 ６％。 这说明，经过乙偶姻处理
的菌体，细胞内容物完整性遭到破坏，胞内蛋白外
泄，从而影响了菌体的正常生理代谢，导致后期发
酵菌体量不断下降、转化率和生产强度下降的直接
原因［１８］。
２􀆰 ２　 乙偶姻浓度对细胞膜完整性的影响
细胞膜可以选择性地控制细胞内外营养物质
和代谢产物的输送，是维持胞内渗透压的结构屏
障，同时也是合成细胞壁和糖被等有关成分的重要
场所。 此外，细胞膜上含有与氧化磷酸化等能量代
谢有关的酶系，被认为是提供细胞所需要能量的产
能基地，所以细胞膜是维持细胞正常生理代谢至关
重要的亚细胞结构。 细胞膜完整性遭到破坏，将会
导致细胞生长受阻或死亡。 乙偶姻，类似丁醇之类
的有机溶剂一样具有较强的疏水性，能够改变细胞
膜的磷脂结构，因此影响生产菌细胞膜结构的完整
性与流动性，从而对跨膜营养、离子的运输以及细
胞的能量代谢产生不利影响，严重时甚至引起细胞
死亡［１９－２１］。
２􀆰 ２􀆰 １　 乙偶姻对膜电位的影响
Ｒｈ１２３ 是一种阳离子亲脂性荧光染料，能通过
细胞膜。 由于活细胞内外电势不相同，存在跨膜电
位，因而 Ｒｈ１２３能特异地吸附于细胞内膜上，Ｒｈ１２３
的荧光强度降低，反应膜电位也随之降低或丧
失［１５］。 所以，细胞膜经 Ｒｈ１２３ 染色后，可以使用荧
２５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
光分光光度计来检测荧光强度大小，探究细胞膜电
位的变化，检测结果见图 ４。
图 ４　 乙偶姻浓度对出发菌株 ＦＭＭＥ０４４和突变株
Ｅ １１ Ｒｈ１２３荧光强度的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｅｔｏｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ｔｈｅ Ｒｈ１２３ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ
由图 ４可知：出发菌株与突变株 Ｅ １１的 Ｒｈ１２３
荧光强度随着乙偶姻浓度的增加而不断下降，其中出
发菌株荧光强度从 １００％（０ ｇ ／ Ｌ）下降到 ４６􀆰 １％（８０
ｇ ／ Ｌ），即膜电位降低了 ５３􀆰 ９％；突变株荧光强度从
１００％（０ ｇ ／ Ｌ）下降到 ５８􀆰 ６％（８０ ｇ ／ Ｌ），即膜电位降低
了 ４１􀆰 ４％。 在不同乙偶姻浓度条件下，突变株 Ｅ １１
荧光强度均高于同一乙偶姻浓度时出发菌株的荧光
强度。 且随着乙偶姻浓度的增加，两菌的荧光强度之
差逐渐增大，当乙偶姻质量浓度为 ４０、６０ 和 ８０ ｇ ／ Ｌ
时，突变株 Ｅ １１的荧光强度（膜电位）比 ＦＭＭＥ０４４
分别高了 ６􀆰 ２８％、９􀆰 １４％和 ２７􀆰 １％。
２􀆰 ２􀆰 ２　 乙偶姻对膜通透性的影响
ＦＤＡ本身虽然不能发出荧光，但它能穿透细胞
膜而被细胞内的非特异性酯酶分解为黄绿色荧光
的荧光素分子而产生荧光，且由于其脂溶性生化物
质而得以保留于活细胞内。 细胞膜受到损伤时，通
透性会增加，荧光素分子便从胞浆中外漏，从而导
致 ＦＤＡ荧光强度降低［１７］。 因此，可以检测荧光强
度的变化来反映细胞膜的完整性及通透性变化。
考察乙偶姻浓度对突变株 Ｅ １１ 和出发菌株
ＦＭＭＥ０４４膜通透性的影响，结果见图 ５。 由图 ５ 可
知：无论是突变株还是出发菌株，其 ＦＤＡ 荧光强度
随着乙偶姻浓度的增加而逐渐降低，且乙偶姻浓度
越高，荧光强度变化越大。 对于出发菌株，当乙偶
姻质量浓度从 ０ ｇ ／ Ｌ增至 ８０ ｇ ／ Ｌ，荧光强度从 １００％
降为 ３６􀆰 ０％；而突变株 Ｅ １１ 荧光强度则从 １００％
下降为 ４７􀆰 ９％；比较出发菌株和突变株在不同乙偶
姻浓度下的荧光强度发现：随着乙偶姻浓度的增
图 ５　 乙偶姻浓度对出发菌株 ＦＭＭＥ０４４和
突变株 Ｅ １１ ＦＤＡ荧光强度的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｅｔｏｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ｔｈｅ ＦＤＡ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ
加，突变株 Ｅ １１ 荧光强度比出发菌株增加了
６􀆰 ３３％ （ ４０ ｇ ／ Ｌ）、 １６􀆰 １％ （ ６０ ｇ ／ Ｌ） 和 ３３􀆰 １％ （ ８０
ｇ ／ Ｌ），即突变株 Ｅ １１的膜通透性比出发菌株降低
了 ６􀆰 ３３％、１６􀆰 １％和 ３３􀆰 １％。
当细胞处于乙偶姻环境胁迫时，乙偶姻能透过
细胞膜进入细胞的内部，从而引起细胞膜的变化，
细胞膜通透性和膜电位的变化能准确地反映细胞
膜结构的改变，因此，可以用 ＦＤＡ、Ｒｈ１２３ 对细胞进
行染色，然后通过荧光强度的变化来判别细胞膜的
完整性。 通过上述试验可知，加入乙偶姻后，
ＦＭＭＥ０４４ 的膜电位与通透性变化较大，当测定时间
结束时，乙偶姻质量浓度为 ８０ ｇ ／ Ｌ时，ＦＭＭＥ０４４ 膜
通透性增加了 ６４􀆰 ０％，膜电位下降了 ５３􀆰 ９％，说明
在高浓度乙偶姻胁迫下，ＦＭＭＥ０４４ 细胞膜损伤较
大；而 Ｅ １１ 在同等条件下，膜通透性仅增加了
５２􀆰 １％，膜电位仅下降了 ４１􀆰 ４％，说明在乙偶姻不利
环境下，Ｅ １１ 细胞膜能保持较好的完整性，说明其
有较好的抵抗乙偶姻冲击的能力。 另一方面，细胞
膜的完整性对维持细胞的活性至关重要，当其损伤
严重时会引起细胞的死亡。 从乙偶姻耐受性而言，
Ｅ １１ 的性能优于 ＦＭＭＥ０４４。
３　 结论
通过测定细胞活力、细胞存活率、胞内蛋白含
量、膜电位和膜通透性来研究不同浓度乙偶姻存在
下对出发菌株和突变株 Ｅ １１生理的影响。 结果发
现在不同乙偶姻浓度下，突变株 Ｅ １１ 的细胞活
力、菌体存活率和胞内蛋白含量均高于出发菌株
ＦＭＭＥ０４４；当乙偶姻质量浓度为 ４０、６０ 和 ８０ ｇ ／ Ｌ
时，突变株 Ｅ １１ 的细胞活力比出发菌株
ＦＭＭＥ０４４ 分别提高了 ７􀆰 １６％、１７􀆰 ７％和 ４０􀆰 １％；存
３５　 第 ６期 罗秋玲等：乙偶姻对解淀粉芽胞杆菌细胞生理的影响
活率比出发菌株分别提高了 ９􀆰 ０９％、 １８􀆰 ３％ 和
３８􀆰 ２％；胞内蛋白含量比出发菌株分别提高了
９􀆰 ６３％、１９􀆰 １％和 ３１􀆰 ６％。 实验结果表明：乙偶姻的
存在对细胞产生毒性，降低细胞活力和细胞存活
率，引起菌株胞内蛋白外泄，破坏细胞膜。 当乙偶
姻质量浓度为 ４０、６０和 ８０ ｇ ／ Ｌ时，突变株 Ｅ １１ 的
膜电位比出发菌株分别提高了 ６􀆰 ２８％、９􀆰 １４％和
２７􀆰 １％；膜通透性比出发菌株分别降低了 ６􀆰 ３３％、
１６􀆰 １％和 ３３􀆰 １％。 这说明乙偶姻是影响膜通透性增
加和膜电位降低的关键因素。 由此可推测乙偶姻
影响菌株是通过破坏细胞膜和引发胞内物质外泄
等共同作用引起的。
本文研究结果可以指导通过代谢工程手段改造
解淀粉芽胞杆菌，提高其对乙偶姻的耐受能力，为更
进一步加强乙偶姻的产量和生产强度奠定了基础。
此外，发酵液中乙偶姻的浓度增加，还可以减少下游
提取的成本和对环境的污染，利于节能与环保。
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（责任编辑　 荀志金）
４５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷