全 文 ：第 １２卷第 ４期
２０１４年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０４􀆰 ００３
收稿日期：２０１３－０４－０１
基金项目：国家自然科学基金（２１００６０４９）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１１ＡＡ０２Ａ２０７）；江苏高校优势学科建设工程
作者简介：杨　 晗（１９８７—），男，安徽含山人，硕士研究生，研究方向：发酵工程；纪晓俊（联系人），副教授； Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｉａｏｊｕｎｊｉ＠ ｎｊｔｅｃｈ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
多粘类芽胞杆菌利用生物柴油副产物粗甘油生产乙偶姻
杨　 晗，纪晓俊，聂志奎，黄　 和
（南京工业大学 生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室，南京 ２１０００９）
摘　 要：研究多粘类芽胞杆菌利用廉价底物生物柴油副产物粗甘油批次发酵生产乙偶姻，考察不同 ｐＨ条件、不同转
速下乙偶姻、２，３ 丁二醇和乙酸 ３种主要产物的产量，根据发酵结果设计一种三阶段溶氧调节的方法，结果表明：经
７６ ｈ批次发酵，乙偶姻产量为 １４􀆰 ６２ ｇ ／ Ｌ，副产物 ２，３ 丁二醇和乙酸分别为 １􀆰 ２４和 ２􀆰 ９３ ｇ ／ Ｌ；副产物量低，且易于分
离，可以有效减少后期分离提取产物的成本。
关键词：甘油；多粘类芽胞杆菌；生物柴油；乙偶姻
中图分类号：ＴＱ９２０􀆰 ６；ＴＱ６５５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０４－００１１－０５
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｏｉｎ ｂｙ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ ｆｒｏｍ ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｌｙｃｅｒｏｌ
ＹＡＮＧ Ｈａｎ，ＪＩ Ｘｉａｏｊｕｎ，ＮＩＥ Ｚｈｉｋｕｉ，ＨＵＡＮＧ Ｈｅ
（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ⁃Ｏｒｉｅｎｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｉｎ ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｏｌｙｍｙｘａ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｃｅｔｏｉｎ􀆰 Ｍａｊｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｓ， ｓｕｃｈ ａｓ ａｃｅｔｏｉｎ， ２， ３⁃ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ａｎｄ ａｃｅｔａｔｅ ｗｅｒｅ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ，ｃｏｎｓｔａｎｔ ｐＨ， ａｎｄ ａｇｉｔａｔｉｏｎ ｓｐｅｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ􀆰 Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
ｏｆ ｂａｔｃｈ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ａ ｔｈｒｅｅ ｓｔａｇｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ，ａｆｔｅｒ ７６ ｈ ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ａｃｅｔｏｉｎ ｙｉｅｌｄ
ｒｅａｃｈｅｄ ｔｏ １４􀆰 ６２ ｇ ／ Ｌ􀆰 Ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ２， ３⁃ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ａｎｄ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｗｅｒｅ １􀆰 ２４ ｇ ／ Ｌ， ２􀆰 ９３ ｇ ／ Ｌ，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ􀆰 Ｓｍａｌｌ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｂｙ⁃ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｅａｓｉｌｙ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｃｏｓｔｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ；ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ；ｇｌｙｃｅｒｏｌ；ａｃｅｔｏｉｎ
　 　 乙偶姻，又名 ３ 羟基丁酮、双乙酰或甲基乙酰
甲醇，是一种重要的食用香料。 此外，作为一种平
台化合物，乙偶姻亦广泛应用于功能材料、医药生
产和化学合成等领域［１］，是美国能源部 ２００４年提出
的优先开发的 ３０ 种生物基平台化合物之一［２］。 生
产乙偶姻的传统方法主要是通过化学方法，包括丁
二酮部分加氢还原法、２，３ 丁二醇选择性氧化法和
丁酮氯化水解法。 这些方法所生产出的乙偶姻产
量和得率较低，质量也难以达到食品级要求［３］。 更
重要的是，其生产原料多来自石油产品，使得其成
本高且污染严重［３］。 生物法生产乙偶姻因其环境
友好、能耗低、污染小等优点，近年来受到了越来越
广泛的关注［４－５］。 现今，生物法生产乙偶姻的菌种
包括肺炎克雷伯氏菌［６－７］、芽胞杆菌［８－９］和产气肠杆
菌［１０］。 然而，生物法生产乙偶姻至今未实现规模化
生产，主要原因有：乙偶姻的产量低，多使用葡萄糖
作为原料，原料成本高，使用的微生物对环境有潜
在的风险。 所以，寻找一种安全、有效、能够利用廉
价原料生产乙偶姻的微生物成为解决乙偶姻生物
法生产的关键问题。
随着对生物柴油研究的深入和生物柴油的大
量生产，其副产物粗甘油的产量也迅速增加，平均
每生产 １ ｔ生物柴油就产生 １００ ｋｇ粗甘油［１１－１２］。 这
些粗甘油废液如果不能及时有效地利用和处理，将
可能成为新的污染源。 利用粗甘油生物合成乙偶
姻，不仅可以解决粗甘油的高效利用，而且可以降
低乙偶姻的生产成本。
因此，本文中笔者研究多粘类芽胞杆菌利用
生物柴油副产物粗甘油来生产乙偶姻，并研究其
生产工艺，以期为规模化生产乙偶姻提供基础
数据。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌株
多粘类芽胞杆菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ） ＡＥ
３０８，笔者所在实验室保藏。
１􀆰 ２　 生物柴油副产物粗甘油预处理
本文中使用的生物柴油副产物粗甘油由中国石
化抚顺石油化工研究院提供，已经过脱色、脱盐处理。
主要成分包括甘油（体积分数 ８８􀆰 ３％）、甘油三酯（体
积分数 １０％）和少量的水，经发酵测试，其产物生成能
力与同浓度的纯甘油相似（数据未列出）。 所以仅对
其进行抽滤以去除其中的固体杂质，然后直接用于
发酵。
１􀆰 ３　 培养条件
平板培养基（ｇ ／ Ｌ）：粗甘油 １０、蛋白胨 ５、酵母
膏 ４。
活化培养基（ｇ ／ Ｌ）：粗甘油 １５、蛋白胨 １０、酵母
膏 ４。
发酵罐接种种子液培养基（ｇ ／ Ｌ）：粗甘油 ６０、蛋
白胨 １０、酵母膏 ７。
发酵培养基（ｇ ／ Ｌ）：粗甘油 ６０、蛋白胨 １０、酵母
膏 ７、 Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２ Ｏ ４、 ＫＨ２ＰＯ４ １􀆰 ５、 ＮＨ４Ｃｌ １、
（ＮＨ４） ２ＨＰＯ４ ０􀆰 ５；微量离子（ｍｇ ／ Ｌ） ＭｇＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ
２１９、ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ４４、ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ ８􀆰 ８、ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
０􀆰 ９、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０􀆰 ９。 微量离子溶液浓缩 １ ０００倍，
配制后分 ３部分进行灭菌：Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋（直接灭
菌）；Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋采用 ０􀆰 ２２ μｍ 微孔滤膜过滤，装入 ５
ｍＬ离心管，放入 ４ ℃冰柜中待用；其余无机盐溶液
母液配制完成之后放入 ４ ℃冰柜中待用［１３］。
种子活化方法：将平板中保存的单菌落接种至装
有 １００ ｍＬ活化培养基的三角烧瓶（２５０ ｍＬ）中，在转
速为 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ的台式恒温摇床中 ３１ ℃培养 ２４ ｈ。
种子液培养方法：将活化液按接种量 １０％接入
装有 １００ ｍＬ 种子液培养基的三角烧瓶（２５０ ｍＬ）
中，在转速为 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ的台式恒温摇床中 ３１ ℃培
养 ４８ ｈ。
１􀆰 ４　 分析方法
１􀆰 ４􀆰 １　 甘油的快速滴定法检测
为了实时测定发酵过程中发酵液的甘油浓度，
采用滴定法测定发酵液中的甘油。 从发酵罐中取
１０～１５ ｍＬ发酵液于 １２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ下离心 ５ ｍｉｎ，用
移液管准确移 １ ｍＬ 上清液置于 ２５０ ｍＬ 的三角瓶
中，加水 １０ ｍＬ，加入酚酞指示，０􀆰 ０５ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＯＨ
标准溶液滴定至变色。 然后加入 １０ ｍＬ ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ
高碘酸钠溶液，避光反应 ５ ｍｉｎ，再加入乙二醇（体
积分数 ２５％）溶液 ５ ｍＬ，避光反应 ５ ｍｉｎ。 然后用上
述 ＮａＯＨ 标准溶液滴定至变色，记录所用 ＮａＯＨ 溶
液的量。 甘油质量浓度由式（１）进行计算。
ρ（甘油） ＝ ９２􀆰 １ｃＶ１ ／ Ｖ２ （１）
式中：ｃ为 ＮａＯＨ 标准溶液浓度（ｍｏｌ ／ Ｌ），Ｖ１是消耗
的 ＮａＯＨ标准溶液体积（ｍＬ），Ｖ２为取液量（ｍＬ）。
１􀆰 ４􀆰 ２　 菌体干质量的测定
菌体干质量通过吸光值换算求得。 取发酵液，
用紫外分光光度计测量出 ５４０ ｎｍ 处的 ＯＤ５４０，根据
以下公式换算成细胞干质量（ＤＣＷ）：
ρ（ＤＣＷ） ＝ ０􀆰 ２５ＯＤ５４０ ＋ ０􀆰 １１３ （２）
１􀆰 ４􀆰 ３　 发酵产物的测定
待测试样的制备：取发酵液于 １２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 下
离心 ５ ｍｉｎ，取 １ ｍＬ上清液，稀释 １０倍，用 ０􀆰 ２２ μｍ
微孔滤膜过滤备用。
检测仪器为 ＤＩＯＮＥＸ Ｓｕｍｍｉｔ 高效液相色谱仪
（ＣＨＲＯＭＥＬＥＯＮ 色谱工作站，Ｐ６８０Ａ 低压四元梯度
泵，ＳＨＯＤＥＸ ＲＩ １０１ 示差折光检测器，ＣＢＬ Ｍｏｄｅｌ
１００ 柱温箱，ＡＳＩ １００ 自动进样器），Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ
８７Ｈ色谱柱（美国 Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ 公司）。 检测条件：正接
色谱柱，柱温 ６５ ℃；流动相为 ０􀆰 ００５ ｍｏｌ ／ Ｌ Ｈ２ＳＯ４，
流速为 ０􀆰 ６ ｍＬ ／ ｍｉｎ［１４］。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 ｐＨ对产物生成的影响
２􀆰 １􀆰 １　 初始 ｐＨ对产物生成的影响
选择初始 ｐＨ分别为 ５、６、７和 ８，初始甘油质量
浓度（以粗甘油计）６０ ｇ ／ Ｌ，在发酵罐中进行批次发
酵，发酵过程中 ｐＨ 自然变化，不再添加任何物质。
实验结果如表 １ 所示。 由表 １ 可知：底物最终都未
２１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
耗尽，而且残留甘油质量浓度都在 １５ ｇ ／ Ｌ左右。 ｐＨ
分别为 ５、６、７和 ８ 时，乙偶姻在总产物中的比例分
别为 ６２％、６２％、４８％和 ５３％，在 ２，３ 丁二醇和乙偶
姻中的比例分别为 ７６％、７７％、６１％和 ６６％，乙偶姻
与 ２，３ 丁二醇的总产量分别为 １７􀆰 ６１、１８􀆰 ４、１７􀆰 ７２
和 １７􀆰 １ ｇ ／ Ｌ。 可以看出，随着初始 ｐＨ 的升高，乙偶
姻在产物中的比例逐渐下降，但在 ｐＨ 达到 ７ 后，比
例变化不明显；且就总产量和转化率而言，无论选
择哪一种初始 ｐＨ，对最终结果都影响不大，仅初始
ｐＨ为 ６时产量稍高，但是就产物间比例的变化看
来，ｐＨ是影响发酵过程的重要因素，所以，笔者继续
尝试对发酵过程中的 ｐＨ控制进行考察。
表 １　 初始 ｐＨ对 Ｐ． ｐｏｌｙｍｙｘａ ＡＥ ３０８发酵产乙偶姻的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｎ ａｃｅｔｏｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ Ｐ． ｐｏｌｙｍｙｘａ ＡＥ⁃３０８
ｇ·Ｌ－１
初始 ｐＨ ρ（初始甘油） ρ（残余甘油） ρ（乙偶姻） ρ（２，３ 丁二醇） ρ（乙酸）
５ ５２􀆰 ２２±１􀆰 １３ １４􀆰 ７５±０􀆰 ２３ １３􀆰 ３４±０􀆰 ２６ ４􀆰 ２７±０􀆰 １７ ４􀆰 ０１±０􀆰 ０５
６ ５２􀆰 ８６±０􀆰 ４７ １４􀆰 ４８±０􀆰 ３９ １４􀆰 １４±０􀆰 ０８ ４􀆰 ２６±０􀆰 １８ ４􀆰 ３３±０􀆰 １１
７ ５１􀆰 ９６±０􀆰 ５６ １４􀆰 ０１±０􀆰 ４０ １０􀆰 ７６±０􀆰 １２ ６􀆰 ９６±０􀆰 ２３ ４􀆰 ８６±０􀆰 １４
８ ５２􀆰 ３５±０􀆰 ３１ １４􀆰 ２５±０􀆰 １４ １１􀆰 ３６±０􀆰 ０５ ５􀆰 ７４±０􀆰 ０４ ４􀆰 ２７±０􀆰 ０１
　 注：２，３ 丁二醇的质量浓度计算是将 Ｄ构型与 ｍｅｓｏ构型合并计算而成。
２􀆰 １􀆰 ２　 不同恒定 ｐＨ对产物生成的影响
调节发酵液初始 ｐＨ 为 ６，初始甘油质量浓度
（以粗甘油计） ６０ ｇ ／ Ｌ，在发酵罐中进行批次发酵。
通过分别流加 ＮａＯＨ 或 Ｈ２ＳＯ４控制反应中的 ｐＨ 恒
为 ６、７和 ８，实验结果如图 １ 所示。 由图 １ 可知：与
不控制发酵 ｐＨ 不同的是，在 ｐＨ 恒定的情况下，底
物都被完全消耗。 在 ｐＨ恒为 ６时，在 １２０ ｈ内甘油
的平均消耗速率为 ０􀆰 ４３ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），生产强度（乙偶
姻＋２，３ 丁二醇）为 ０􀆰 １７５ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）；ｐＨ 恒为 ７ 时，
１２０ ｈ内甘油的平均消耗速率为 ０􀆰 ４４ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），生
产强度为 ０􀆰 １２８ ｇ ／ Ｌ；ｐＨ 恒为 ８ 时，１１７ ｈ 内甘油的
平均消耗速率为 ０􀆰 ３３ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），生产强度为 ０􀆰 １１４
ｇ ／ （Ｌ·ｈ）。 副产物乙酸随着 ｐＨ的升高而上升，且在
ｐＨ由 ６ 上升到 ７ 时，乙酸的产量大幅增加，发酵终
点的乙酸质量浓度分别为 ３􀆰 １６ 和 １５􀆰 ４２ ｇ ／ Ｌ。 在
ｐＨ恒为 ８ 时，发酵终点的乙酸质量浓度为 １８􀆰 ６８
ｇ ／ Ｌ。 所以 ｐＨ恒定情况下，选择控制 ｐＨ为 ６ 时，目
标产物产量产率最高，生成副产物较少。
分析不同 ｐＨ下的发酵过程，可以发现，菌体在发
酵初期，主要以生成 ２，３ 丁二醇为主，在底物消耗完
后，乙偶姻大量增加，２，３ 丁二醇的浓度则很快减少，
且乙偶姻增加的量大于底物消耗量的 １／ ２。 由此，笔者
认为，在发酵后期，２，３ 丁二醇可以自发向乙偶姻转
化，这与 ２，３ 丁二醇途径中的由乙偶姻到 ２，３ 丁二醇
的反应是可逆的相吻合［１５］。 这可能是因为在发酵后
期，菌体为了维持胞内氧化还原平衡，利用 ２，３ 丁二
醇为底物转化为乙偶姻，从而产生一定的还原力［１６］。
图 １　 不同 ｐＨ控制下的发酵过程曲线
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ
３１　 第 ４期 杨　 晗等：多粘类芽胞杆菌利用生物柴油副产物粗甘油生产乙偶姻
２􀆰 ２　 溶氧对产物生成的影响
为了研究溶氧对产物生成的影响，选取 １００、
２００和 ３００ ｒ ／ ｍｉｎ ３种转速条件，调节发酵液初始 ｐＨ
为 ６，初始甘油质量浓度（以粗甘油计）６０ ｇ ／ Ｌ，在发
酵罐中进行批次发酵。 通过分别流加 ＮａＯＨ 或
Ｈ２ＳＯ４控制反应的 ｐＨ恒为 ６，发酵结果如图 ２所示。
由图 ２可以发现：随着转速的提高，底物的消耗速率
逐渐变快。 在转速为 １００ ｒ ／ ｍｉｎ 时，１４４ ｈ 之后，仅
消耗了 １８􀆰 ５６ ｇ ／ Ｌ甘油，２，３ 丁二醇和乙偶姻的产
量分别为 １􀆰 ７４和 １􀆰 ４１ ｇ ／ Ｌ；在转速为 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ时，
１２２ ｈ时甘油基本耗尽，２，３ 丁二醇和乙偶姻的产
量分别为 １３􀆰 ５４ 和 ９􀆰 １４ ｇ ／ Ｌ；３００ ｒ ／ ｍｉｎ 时，６６􀆰 ５ ｈ
时甘油便耗尽，２，３ 丁二醇和乙偶姻的产量分别为
５􀆰 ５３和 １１􀆰 ９６ ｇ ／ Ｌ。 与较低的转速相比，高转速的
菌体生长速度更快（图 ３），且其菌体生长的速率与
底物消耗速率呈正相关趋势。 但在 ３００ ｒ ／ ｍｉｎ 下，
底物的转化率却明显降低，为理论转化率的 ６０％，
远低于 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ下的 ８２％。 通过图 ３ 的菌体生长
曲线，每个取样间隔时间的菌体的平均生长速率
（近似等于斜率）在 ０～２３ ｈ内，转速为 ３００ ｒ ／ ｍｉｎ 时
更快，菌体量也在这段时间内大量积累，达到 ４􀆰 ８５
ｇ ／ Ｌ，是发酵过程中最大菌体量的 ７９％。 在 ２３ ｈ 之
后，３００ ｒ ／ ｍｉｎ转速下的生长速率显著降低，低于 ２００
ｒ ／ ｍｉｎ转速下的生长速率。 在 ０ ～ ２３ ｈ 内，甘油底物
消耗了 １９􀆰 ０６ ｇ ／ Ｌ，生成的产物乙偶姻和 ２，３ 丁二
醇仅有 ４􀆰 ５６ ｇ ／ Ｌ。 而在 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ 转速下，甘油消
耗了 ２３􀆰 ８９ ｇ ／ Ｌ，生成的产物为 ９􀆰 ９１ ｇ ／ Ｌ，而这段时
间产物生成的相差（５􀆰 ３５ ｇ ／ Ｌ）约等于最终产量的差
（５􀆰 １９ ｇ ／ Ｌ）。 可以推测，在高转速条件下，菌体迅速
生长，同时菌体的呼吸作用消耗了大量的底物。 在
转速为 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ 下，总的发酵时间约 １４５ ｈ，３００
ｒ ／ ｍｉｎ下约 ７５ ｈ。 两者相差 ７０ ｈ，一部分是菌体生长
对数期时间不同（分别为 ６４与 ３７ ｈ），另一部分是由
２，３ 丁二醇氧化为乙偶姻的转化速率不同，从 ２，３
丁二醇开始转化为乙偶姻到完全转化所用的时间分
别为 ５１􀆰 ５与 ３８ ｈ。 转化时间不同可能是因为 ２，３
丁二醇向乙偶姻的转化需要由氧化型辅酶 ＮＡＤ提供
氧化力，较高的溶氧能够降低胞内 ＮＡＤＨ的含量，从
而使反应向有利于乙偶姻生成的方向进行［１７］。
２􀆰 ３　 三阶段溶氧调控研究
根据以上结果，笔者设计了一种三阶段溶氧调
控实验，按如下方法操作：调节发酵液初始 ｐＨ为 ６，
初始甘油质量浓度（以粗甘油计）６０ ｇ ／ Ｌ，在发酵罐
图 ２　 不同转速下的发酵过程曲线
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅｓ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ａｇｉｔａｔｉｏｎ ｓｐｅｅｄｓ
图 ３　 不同转速下对细胞生长的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｇｉｔａｔｉｏｎ ｓｐｅｅｄｓ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
中进行批次发酵。 通过分别流加 ＮａＯＨ或 Ｈ２ＳＯ４控
制反应中的 ｐＨ 恒为 ６，在前 ２４ ｈ 控制发酵罐搅拌
桨转速为 ３００ ｒ ／ ｍｉｎ，２４ ｈ时调节发酵罐搅拌桨转速
为 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ，隔一定时间取样实时测定底物浓度，
当底物耗尽时，将转速调回至 ３００ ｒ ／ ｍｉｎ，结果如图 ４
所示。
４１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
图 ４　 转速调控的发酵过程曲线
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅｓ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ａｇｉｔａｔｉｏｎ
ｓｐｅｅｄ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ
由图 ４可以看出：在改变转速后，产物的消耗速率
并未下降，但生成的产物中，２，３ 丁二醇所占的比例比
恒定 ３００ ｒ ／ ｍｉｎ转速下的更大，这一点也与前述实验中
不同溶氧对产物比例的影响相吻合。 可见，在微氧发
酵过程中，较高的溶氧有利于乙偶姻的生成。 最终，经
过 ７６ ｈ发酵，乙偶姻的产量为 １４􀆰 ６２ ｇ ／ Ｌ、２，３ 丁二醇
为 １􀆰 ２４ ｇ ／ Ｌ，总产量为 １５􀆰 ８６ ｇ ／ Ｌ，生产强度为 ０􀆰 ２１
ｇ ／ （Ｌ·ｈ）。 转化率达到了理论最大值的 ６８％。 所需发
酵时间远少于 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ 恒定转速下的情况。 产物生
成量与 ３００ ｒ ／ ｍｉｎ恒定转速下的产量接近，在节约能量
的同时达到了减少发酵时间、提高产率的目的［１８］。
３　 结　 论
通过对多粘类芽胞杆菌 ＡＥ ３０８ 甘油代谢情
况的考察，研究了 ｐＨ、溶氧对菌体生长及产物生成
的影响，发现通过控制发酵液保持在恒定的微酸性
ｐＨ状态可以有效促进产物的积累，而不控制或过高
的 ｐＨ则会导致底物转化缓慢、副产物增加和产物
生成降低。 转速则与菌体的生长速率存在正相关
性，较高的转速会使得菌体生长迅速，但也会使底
物转化率降低，且能耗过大。 通过对菌体生长阶
段、产物积累阶段、２，３ 丁二醇向乙偶姻转化阶段
采取不同的溶氧调控方式，相比于传统的分批发
酵，有效地减少了发酵时间，提高了产物的生成效
率，同时在生成的产物中，副产物乙酸极易与乙偶
姻分离，２，３ 丁二醇的含量很低，仅为 １􀆰 ２４ ｇ ／ Ｌ，后
期的分离成本和难度也得到了降低，为进一步补料
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（责任编辑　 管　 珺）
５１　 第 ４期 杨　 晗等：多粘类芽胞杆菌利用生物柴油副产物粗甘油生产乙偶姻