全 文 ：第 １３卷第 ３期
２０１５年 ５月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ３
Ｍａｙ ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０３􀆰 ００１
收稿日期：２０１４－０４－１８
基金项目：国家自然科学基金重点项目（２０８３６００３）；全国优秀博士学位论文作者专项基金（２００９６２）
作者简介：李树波（１９８５—），男，广西桂林人，博士，研究方向：微生物食品制造；陈　 坚（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｊｃｈｅｎ＠ ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ
光滑球拟酵母线粒体抵御乙偶姻胁迫的生理机制解析
李树波１，刘立明１，２，陈　 坚１，２
（１􀆰 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 ２１４１２２；
２􀆰 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 ２１４１２２）
摘　 要：以光滑球拟酵母为出发菌株，利用生化和分子生物学实验研究微生物抵御有机溶剂胁迫的生理机制。 首
先，添加柠檬酸盐考察能量供给对细胞抵御乙偶姻胁迫的影响。 与对照条件 （０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 柠檬酸盐）相比，
５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ柠檬酸盐可使细胞生物量在不同乙偶姻质量浓度（６、１０、１２ 和 １５ ｇ ／ Ｌ）胁迫下分别提高了 １３􀆰 ２％、
１４􀆰 ２％、１７􀆰 ８％和 ２５􀆰 ２％。 同时，通过表达线粒体融合分裂调控基因 ｆｚｏ１ 和 ｄｎｍ１，以细胞活力、胞内活性氧（ＲＯＳ）
和三磷酸腺苷（ＡＴＰ）为研究指标考察调控线粒体融合分裂对乙偶姻胁迫的影响。 结果表明：与对照菌株相比，在
不同乙偶姻质量浓度胁迫下（１２和 １８ ｇ ／ Ｌ），增强线粒体融合可抑制胞内 ＲＯＳ 的产生，使其水平分别降低了 ９􀆰 ３％
和 １６􀆰 ２％；却使胞内 ＡＴＰ 水平分别提高了 ９􀆰 ７％和 ３６􀆰 １％，从而延缓乙偶姻胁迫对细胞活力的影响，使细胞生物量
相应地提高了 ９􀆰 １％和 ２９􀆰 ７％。 因此，通过添加柠檬酸或改善线粒体生理功能以提高胞内能量供给，可有效提高微
生物细胞抵御乙偶姻等环境胁迫的能力。
关键词：乙偶姻；活性氧；光滑球拟酵母；能力代谢；线粒体融合分裂
中图分类号：ＴＱ２２４􀆰 ２２　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０３－０００１－０６
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ
ａｃｅｔｏｉｎ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ
ＬＩ Ｓｈｕｂｏ１，ＬＩＵ Ｌｉｍｉｎｇ１，２，ＣＨＥＮ Ｊｉａｎ１，２
（１􀆰 Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；
２􀆰 Ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｔｈｅ ｔｏｌｅｒａｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ ａｇａｉｎｓｔ ａｃｅｔｏｉｎ ｓｔｒｅｓｓ， ｗｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｔｓ
ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｗｏ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ． Ｆｉｒｓｔ， ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｏｆ ｃｉｔｒａｔｅ ｗａｓ
ａｄｄｅｄ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｅｒｇｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｃｅｔｏｉｎ （６， １０， １２ ａｎｄ
１５ ｇ ／ Ｌ）， ａｎｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ １３􀆰 ２％， １４􀆰 ２％， １７􀆰 ８％ ａｎｄ ２５􀆰 ２％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ
ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ （ｗｉｔｈｏｕｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｔｒａｔｅ）． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｆｚｏ１ ａｎｄ ｄｎｍ１ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ
ｏｖｅｒ⁃ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｓｏｍｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ （ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ （ＲＯＳ） ａｎｄ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ （ＡＴＰ）） ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ
ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｉｎ， ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｓｉｏｎ （ ｏｖｅｒ⁃ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｆｚｏ１ ） ｃｏｕｌｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅ
ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＯＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ９􀆰 ３％ ａｎｄ １６􀆰 ２％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｕｎｄｅｒ １２ ｇ ／ Ｌ ａｎｄ １８ ｇ ／ Ｌ ｏｆ ａｃｅｔｏｉｎ．
Ｍｏｒｅｏｖｅｒ， ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＡＴＰ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ９􀆰 ７％ ａｎｄ ３６􀆰 １％， ａｎｄ ＤＣＷ
９􀆰 １％ ａｎｄ ２９􀆰 ７％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ， ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｅｒｇｙ ｌｅｖｅｌｓ
ｔｈｒｏｕｇｈ ａｄｄｉｎｇ ｓｏｍｅ ｃｉｔｒａｔｅ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｆａｖｏｒａｂｌｅ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ
ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ ｆｏｒ ａｃｅｔｏｉｎ ｓｔｒｅｓｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｃｅｔｏｉｎ；ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ；Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ；ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ；ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｓｉｏｎ⁃ｆｉｓｓｉｏｎ
　 　 乙偶姻是一种羟基酮型有机溶剂，高浓度乙偶姻
通过影响微生物细胞结构来改变细胞生理功能和代
谢能力［１］。 目前，研究人员主要从生理功能、细胞结
构和生化组分等方面解析微生物抵御有机溶剂胁迫
的生理机制：①通过改变细胞膜中不饱和脂肪酸的
顺 反异构化、脂肪酸饱和度及磷脂极性头部等结构
特性，增强细胞膜的坚固性并降低细胞膜的流动性，
从而增强微生物对有机溶剂的适应性［２－３］；②通过改
变细胞壁组分构成比例，增强对外界环境胁迫的抵抗
能力［４］；③外排泵，可将胞内与细胞结构和生理功能
不相关物质转运至胞外，以维持细胞正常生理功
能［５］，如 ＡＴＰ 结合盒超家族（ＡＢＣ）外排泵、主要易化
子超家族（ＭＦＳ）、多重抗药性家族（ＳＭＲ）、多药物和
毒性化合物运输蛋白（ＭＡＴＥ）以及耐药结节细胞分
化（ＲＮＤ）家族［６－８］；④热激蛋白等调控蛋白及其相应
调控系统，调控蛋白质合成、转运、折叠及降解等生理
过程，提高微生物抵御外界环境（低酸、缺氧、高温、饥
饿和高盐等）胁迫的能力［９－１０］。 此外，微生物还存在
其他耐受机制，包括脱毒降解效应［１１－１３］、能量代谢［１１］
以及合成海藻糖、甘油及氨基酸等相容性溶质［１４］。
然而，外排泵、细胞壁、细胞膜及脱毒反应等保护
机制的形成均是高耗能过程，且与胞内能量代谢密切
相关。 而对于真核微生物，线粒体不仅是 ＡＴＰ 主要
合成场所，为细胞生理代谢活动提供能量和动力［１５］，
还参与维持胞内 Ｃａ２＋、Ｆｅ３＋稳定，物质代谢及细胞凋
亡等生理过程，在细胞抵御各种复杂环境胁迫中发挥
着重要作用［１６］。 同时，作为不断融合分裂的高度动
态细胞器，高度动态线粒体比静态线粒体更有利于实
现微生物的生理功能。 在酵母细胞中，动力蛋白相关
ＧＴＰ 酶（Ｄｎｍ１，ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｎ⁃ｒｅｌａｔｅｄ ＧＴＰａｓｅ）和线粒体
机动蛋白 ＧＴＰａｓｅ （Ｆｚｏ１）调控着线粒体融合分裂过
程，影响线粒体生理功能和形态［１７－１８］。 其中，正常线
粒体分裂过程可修复细胞氧化损伤，提高细胞对外界
或内部环境胁迫的能力［１９］；而增强线粒体融合过程
能促进线粒体间相互协同作用，有利于增强线粒体能
量传递、信息沟通、ＤＮＡ 互补、膜电位传递及代谢物
交换等生理过程［２０－２２］。 因此，线粒体融合分裂过程
在微生物细胞抵御外界环境胁迫中扮演着重要作用。
目前，基于细胞凋亡角度研究有机溶剂对微生物细胞
毒害作用的相关研究鲜见报道［２３］。
因此，笔者将从线粒体融合分裂过程角度研究
微生物细胞抵御有机溶剂胁迫的耐受机制，拓宽对
微生物抵御有机溶剂胁迫生理机制的认识理解，为
提高微生物抵御有机溶剂胁迫的能力提供新策略。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌株和质粒
本研究中所用菌株和质粒见表 １。
表 １　 本研究中所使用的菌株和质粒
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
名称 相关特征 来源
质粒 ｐＹＸ２１２ ２ μｍ，ＡｍｐＲ，ＵＲＡ３ 笔者所在实验室
质粒 ｐＹＸ２１２ ｆｚｏ１ 带有基因 ｆｚｏ１ （来源于 Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） 笔者构建
质粒 ｐＹＸ２１２ ｆｚｏ１ 带有基因 ｄｎｍ１ （来源于 Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） 笔者构建
菌株 Ｃ􀆰 ｇｌａｂｒａｔａ ＣＣＴＣＣ Ｍ２０２０１９ 硫胺素、生物素、烟酸和吡哆醇四重维生素缺陷型 笔者所在实验室
菌株 Ｃ􀆰 ｇｌａｂｒａｔａΔｕｒａ３ 敲除尿嘧啶的 Ｃ􀆰 ｇｌａｂｒａｔａ 笔者所在实验室
菌株 Ｃ Ｆｚｏ１ｐ Ｃ􀆰 ｇｌａｂｒａｔａΔｕｒａ３ （ｐＹＸ２１２ ｆｚｏ１） 笔者构建
菌株 Ｃ Ｄｎｍ１ｐ Ｃ􀆰 ｇｌａｂｒａｔａΔｕｒａ３ （ｐＹＸ２１２ ｄｎｍ１） 笔者构建
菌株 ＣＯＮ Ｃ􀆰 ｇｌａｂｒａｔａ Δｕｒａ３ （ｐＹＸ２１２） 笔者构建
１􀆰 ２　 培养基和缓冲液的配制
种子培养基（ ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０，（ＮＨ４） ２ ＳＯ４ ５，
ＫＨ２ＰＯ４ ５，ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ８，乙酸钠 ６。
发酵培养基（１ Ｌ）：葡萄糖 １００ ｇ，尿素 ７ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４
５ ｇ，ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ８ ｇ，ＣａＣＯ３ ２０ ｇ，乙酸钠 ６ ｇ，微量元素液
１０ ｍＬ。 用于研究不同乙偶姻浓度对光滑球拟酵母生
２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
长的影响。
以上培养基中加维生素液 １０ ｍＬ，调 ｐＨ ５􀆰 ５ 后
１１５ ℃高压灭菌 １５ ｍｉｎ。
磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，ｐＨ ７􀆰 ４，ｇ ／ Ｌ）：ＮａＣｌ ８􀆰 ０，
ＫＣｌ ０􀆰 ２，ＫＨ２ＰＯ４ ０􀆰 ２，Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ ２􀆰 ９。
１􀆰 ３　 分析方法
１􀆰 ３􀆰 １　 细胞培养
挑取一环菌体接种于含有 ２５ ｍＬ种子培养基的
２５０ ｍＬ锥形瓶中，于 ３０ ℃、 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ 下摇瓶培养
２４ ｈ，以体积分数 １０％接种量接种于 ５０ ｍＬ 含不同
乙偶姻浓度发酵培养基的 ５００ ｍＬ 锥形瓶中， ３０
℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ培养。
１􀆰 ３􀆰 ２　 细胞生理特性的测定
当细胞培养至对数生长初期（２４ ｈ），添加不同
质量浓度乙偶姻（０、６、１２、１５和 １８ ｇ ／ Ｌ）至发酵培养
基中；３０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ培养 ３６ ｈ，分别取 ２ ｍＬ发酵
液用于测定不同乙偶姻浓度对光滑球拟酵母细胞
生理特性的影响：①利用噻唑蓝（ＭＴＴ）法检测不同
乙偶姻胁迫条件下细胞活力的变化；②２，７ 二氯双
乙酸钠（ＤＣＦＨ ＤＡ）在微生物胞内通过酯化水解和
氧化作用，可形成具有荧光特性的荧光物质 ２，７ 二
氯 ＤＣＦ，通过测定胞内 ＤＣＦ荧光强度计算胞内活性
氧（ＲＯＳ）水平；③利用试剂盒测定胞内 ＡＴＰ；③线
粒体膜电位 （ ΔΨｍ ）测定，罗丹明 １２３ （ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ
１２３）能透过细胞膜作为线粒体跨膜电位指示剂，通
过荧光信号强弱检测线粒体膜电位和细胞凋亡情
况的变化［２４］。
１􀆰 ４　 工程菌株的构建
根据 Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 中基因 ｆｚｏ１和 ｄｎｍ１序列，分别
设计 ＰＣＲ引物 Ｃｏｎ ｆｚｏ Ｆ ／ Ｒ和 Ｃｏｎ ｄｎｍ Ｆ ／ Ｒ。
下划线序列分别为限制性内切酶Ｂａｍ ＨⅠ和 ＸｈｏⅠ
的识别位点（表 ２）。 ＰＣＲ 反应采用 ５０ μＬ 体系，反
应条件：９４ ℃ ５ ｍｉｎ；９４ ℃ ５０ ｓ，６０ ℃ ５０ ｓ，７２ ℃ ９０
ｓ，３０个循环；７２ ℃ １０ ｍｉｎ。 利用质量分数 ０􀆰 ８％琼
脂糖凝胶电泳回收 ＰＣＲ扩增产物，并使用相应的限
制性内切酶消化 ３ ｈ，再利用 Ｔ４ ＤＮＡ连接酶将目的
片段连接至质粒 ｐＹＸ２１２；借助氨苄青霉素抗性和双
酶切方法筛选获得阳性重组质粒 ｐＹＸ２１２ ｆｚｏ１ 和
ｐＹＸ２１２ ｄｎｍ１。 最后，将对照质粒 ｐＹＸ２１２ 及重组
质粒电转化至 Ｃ􀆰 ｇｌａｂｒａｔａ Δｕｒａ３ 感受态中，并利用
尿嘧啶缺陷型回复突变筛选获得相应重组菌株
ＣＯＮ，Ｃ Ｆｚｏ１ｐ和 Ｃ Ｄｎｍ１ｐ。
表 ２　 本研究中所用引物
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
名称 序列 （５′ ３′） 目标基因
Ｃｏｎ ｆｚｏ Ｆ ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＧＡＡＧＧＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＴ
ｆｚｏ１扩增
Ｃｏｎ ｆｚｏ Ｒ ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＴＣＧＡＴＧＴＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＣＴ
Ｃｏｎ ｄｎｍ Ｆ ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＡＧＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＣＴ
ｄｎｍ１扩增
Ｃｏｎ ｄｎｍ Ｒ ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴＴＡＣＴＡＡＴＡＡＧＧＧＴ
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 乙偶姻浓度对光滑球拟酵母生长的影响
为研究有机溶剂乙偶姻对 Ｃ􀆰 ｇｌａｂｒａｔａ 细胞的毒
害抑制作用，利用摇瓶培养，考察不同乙偶姻浓度
对酵母细胞生长的影响，结果如图 １ 所示。 由图 １
可知：低浓度乙偶姻胁迫对细胞毒害和正常生理功
能影响较小。 与对照组（０ ｇ ／ Ｌ）相比，低乙偶姻质量
浓度（６ ｇ ／ Ｌ）对细胞生长影响较小，其生物量仅降低
了 ７􀆰 ５％；但当乙偶姻质量浓度提高至 １２ ｇ ／ Ｌ时，可
有效地抑制细胞的生长，使其生物量降低了
２６􀆰 ３％，仅为 ８􀆰 １１ ｇ ／ Ｌ。
图 １　 摇瓶培养测定不同乙偶姻质量浓度对
细胞生长的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｅｔｏｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｃｅｌｌ
ｇｒｏｗｔｈ （ＤＣＷ） ｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ
３　 第 ３期 李树波等：光滑球拟酵母线粒体抵御乙偶姻胁迫的生理机制解析
２􀆰 ２　 柠檬酸对 Ｃ􀆰 ｇｌａｂｒａｔａ抵御乙偶姻胁迫的影响
柠檬酸可提高 Ｃ􀆰 ｇｌａｂｒａｔａ 胞内 ＡＴＰ 供给，从而
提高细胞抵御外界酸胁迫的能力［２５］。 因此，考察柠
檬酸盐（５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ）对 Ｃ􀆰 ｇｌａｂｒａｔａ 细胞抵御乙偶姻
胁迫的影响，结果如图 ２所示。 由图 ２可知：与对照
条件（０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ柠檬酸盐）相比，添加柠檬酸使细胞
生物量分别提高了 １３􀆰 ２％ （６ ｇ ／ Ｌ 乙偶姻）、１４􀆰 ２％
（１０ ｇ ／ Ｌ乙偶姻）、１７􀆰 ８％（１２ ｇ ／ Ｌ乙偶姻）和 ２５􀆰 ２％
（１５ ｇ ／ Ｌ乙偶姻）。 然而，当乙偶姻质量浓度增加至
１８ ｇ ／ Ｌ 时，柠檬酸盐对细胞生长保护作用基本消
失，使细胞生物量比对照组仅提高了 ４􀆰 ２％。 因此，
提高胞内 ＡＴＰ 水平能有效提高细胞抵御高浓度乙
偶姻胁迫的能力。 但当外界环境胁迫超过一定阈
值时，仅依赖能量代谢难以保护细胞抵御高浓度乙
偶姻的胁迫。
图 ２　 柠檬酸盐对细胞抵御乙偶姻胁迫的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｉｔｒａｔｅ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｕｎｄｅｒ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｃｅｔｏｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
２􀆰 ３　 过量表达 ｆｚｏ１ 和 ｄｎｍ１ 对 Ｃ􀆰 ｇｌａｂｒａｔａ 抵御乙
偶姻胁迫的影响
　 　 为研究线粒体融合分裂过程对细胞抵御乙偶
姻胁迫的影响，利用平板点样法和摇瓶培养，分别
考察不同乙偶姻浓度对不同菌株生长的影响，结果
如图 ３所示。 由图 ３（ａ）可知：３０ ℃培养 ７２ ｈ 后，在
低质量浓度乙偶姻胁迫下（６ 和 １２ ｇ ／ Ｌ），不同菌株
细胞生长情况相似；在 １５ ｇ ／ Ｌ 乙偶姻条件下，不同
菌株生长呈显著差异，工程菌株 Ｃ Ｆｚｏ１ 能正常生
长，但菌株 Ｃ Ｄｎｍ１ 和 ＣＯＮ 生长却受到显著的抑
制作用；当乙偶姻质量浓度增加至 １８ 或 ２０ ｇ ／ Ｌ时，
菌株 ＣＯＮ和 Ｃ Ｄｎｍ１ 的生长被完全抑制，而菌株
Ｃ Ｆｚｏ１仍能正常生长，表现出良好的乙偶姻耐受
性。 这一结果表明，过量表达基因 ｆｚｏ１ 可显著提高
Ｃ􀆰 ｇｌａｂｒａｔａ抵御乙偶姻胁迫的能力。 图 ３（ｂ）证明：
在对照条件（０ ｇ ／ Ｌ乙偶姻）下，菌株 ＣＯＮ、Ｃ Ｄｎｍ１
和 Ｃ Ｆｚｏ１细胞生长情况差异较小，分别为 １０􀆰 １６、
１０􀆰 ０１和 １０􀆰 ２５ ｇ ／ Ｌ。 当乙偶姻质量浓度增加至 １２
和 １８ ｇ ／ Ｌ时，与对照菌株 ＣＯＮ细胞生物量（７􀆰 ７１和
３􀆰 ２３ ｇ ／ Ｌ）相比，菌株 Ｃ Ｆｚｏ１的细胞生物量分别为
８􀆰 ４１ ｇ ／ Ｌ和 ４􀆰 １９ ｇ ／ Ｌ，分别提高了 ９􀆰 １％和 ２９􀆰 ７％；
而菌株 Ｃ Ｄｎｍ１的细胞生物量却分别降低至 ６􀆰 ５９
和 ３􀆰 ０１ ｇ ／ Ｌ。 这一结果再次证明：增强线粒体融合
过程更有利于 Ｃ􀆰 ｇｌａｂｒａｔａ 抵御高浓度乙偶姻的
胁迫。
图 ３　 乙偶姻浓度对不同菌株生长的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｅｔｏｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ
２􀆰 ４　 过量表达 ｆｚｏ１ 和 ｄｎｍ１ 对 Ｃ􀆰 ｇｌａｂｒａｔａ 生理特
性的影响
２􀆰 ４􀆰 １　 乙偶姻浓度对不同菌株细胞活力的影响
采用 ＭＴＴ法，以吸光度表征乙偶姻对细胞活力
的影响，结果如图 ４所示。 由图 ４可知：随着乙偶姻
浓度的增加，菌株 ＣＯＮ、Ｃ Ｄｎｍ１ 和 Ｃ Ｆｚｏ１ 细胞
活力均逐渐降低，但其下降比例差异较大。 与对照
条件（０ ｇ ／ Ｌ）相比，１５ ｇ ／ Ｌ 乙偶姻使对照菌株 ＣＯＮ
４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
细胞活力降低了 ４３􀆰 ４％；而菌株 Ｃ Ｄｎｍ１细胞活力
降低比例最大，为 ４５􀆰 ７％；然而，菌株 Ｃ Ｆｚｏ１ 细胞
活力仅降低了 ３１􀆰 ３％。 同时，当乙偶姻质量浓度提
高至 １８ ｇ ／ Ｌ或 ２０ ｇ ／ Ｌ时，菌株 Ｃ Ｆｚｏ１细胞活力进
一步降低 （比对照条件分别减少了 ４４􀆰 ５％ 和
４７􀆰 ６％），而菌株 ＣＯＮ和 Ｃ Ｄｎｍ１ 细胞活力并没有
持续减少，但却维持在较低水平（约为 ０􀆰 ３）。 因此，
Ｃ􀆰 ｇｌａｂｒａｔａ 对乙偶姻胁迫的最高耐受质量浓度可能
为 １５ ｇ ／ Ｌ，而过量表达基因 ｆｚｏ１ 能有效延缓或削弱
高浓度乙偶姻对细胞活力的影响，提高细胞抵御乙
偶姻胁迫的能力。
图 ４　 乙偶姻质量浓度对不同菌株细胞活力的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｅｔｏｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ
ＭＴＴ ａｎａｌｙｓｉｓ
２􀆰 ４􀆰 ２　 乙偶姻浓度对不同菌株胞内 ＲＯＳ、ＡＴＰ 水
平的影响
研究乙偶姻对不同菌株胞内 ＲＯＳ 和 ＡＴＰ 水平
变化的影响，为进一步解析乙偶姻对细胞的毒害机
制提供实验支持，结果如图 ５ 所示。 与对照条件（０
ｇ ／ Ｌ乙偶姻）相比，１２ ｇ ／ Ｌ 和 １８ ｇ ／ Ｌ 乙偶姻使菌株
ＣＯＮ胞内 ＲＯＳ 水平分别提高了 １７％和 ４４％。 但与
对照菌株 ＣＯＮ相比，菌株 Ｃ Ｄｎｍ１ 胞内 ＲＯＳ 水平
却分别提高了 １０􀆰 ２％ （１２ ｇ ／ Ｌ）和 １３􀆰 ４％（１８ ｇ ／ Ｌ）；
菌株 Ｃ Ｆｚｏ１能有效消除抑制胞内 ＲＯＳ 的产生，使
胞内 ＲＯＳ水平分别降低了 ９􀆰 ３％（１２ ｇ ／ Ｌ）和 １６􀆰 ２％
（１８ ｇ ／ Ｌ）。 同时，通过对不同菌株胞内 ＡＴＰ 水平的
测定分析发现：与对照菌株 ＣＯＮ 相比，高浓度乙偶
姻胁迫使菌株 Ｃ Ｄｎｍ１胞内 ＡＴＰ 水平分别降低了
１３􀆰 ２％（１２ ｇ ／ Ｌ）和 ２０％（１８ ｇ ／ Ｌ）；而菌株Ｃ Ｆｚｏ１胞
内 ＡＴＰ 水平却分别提高了 ９􀆰 ７％（１２ ｇ ／ Ｌ）和 ３６􀆰 １％
（１８ ｇ ／ Ｌ）。
综上所述，高浓度乙偶姻可改变胞内 ＲＯＳ 和
ＡＴＰ 水平，而胞内低水平 ＡＴＰ 可导致胞内各代谢反
图 ５　 乙偶姻浓度对不同菌株生理特性的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｅｔｏｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ
ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＯＳ ａｎｄ ＡＴＰ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ
应供能不足，从而影响细胞正常的生理活动，促进
胞内 ＲＯＳ水平的提高，可能是降低 Ｃ􀆰 ｇｌａｂｒａｔａ 抵御
乙偶姻胁迫能力的关键因素。 然而，增强线粒体融
合过程可提高胞内 ＡＴＰ 的合成能力，延缓胞内 ＲＯＳ
的产生，从而维持线粒体膜电位的稳定，为细胞正
常生理活动提供更多能量供给和适宜的胞内微环
境，提高细胞应对高浓度乙偶姻胁迫的能力。
３　 结论
以有机溶剂乙偶姻为例研究微生物抵御有机
溶剂胁迫的生理机制，并为提高微生物抵御有机溶
剂胁迫能力提供新的方法策略。 通过外源添加柠
檬酸盐实验发现，增加微生物胞内 ＡＴＰ 供给可更有
利于提高微生物细胞抵御高浓度乙偶姻胁迫的能
力。 而作为酵母细胞中重要的亚细胞器，线粒体可
参与能力代谢、细胞凋亡等多种生理功能。 通过过
量表达线粒体融合分裂关键调节基因，调控线粒体
的融合分裂过程，改变微生物细胞抵御外界环境胁
迫的能力。 研究结果表明，与对照菌株 ＣＯＮ 相比，
增强线粒体融合过程可有效延缓高浓度乙偶姻胁
迫对细胞活力的影响；抑制胞内 ＲＯＳ 的产生，使胞
内 ＲＯＳ水平分别降低了 ９􀆰 ３％（１２ ｇ ／ Ｌ）和 １６􀆰 ２％
（１８ ｇ ／ Ｌ），但却使胞内 ＡＴＰ 水平分别提高了 ９􀆰 ７％
（１２ ｇ ／ Ｌ）和 ３６􀆰 １％（１８ ｇ ／ Ｌ），有效提高了光滑球拟
５　 第 ３期 李树波等：光滑球拟酵母线粒体抵御乙偶姻胁迫的生理机制解析
酵母抵御高浓度乙偶姻胁迫的能力。 因此，从线粒
体角度解析微生物抵御有机溶剂胁迫的生理机制，
不仅拓宽对有机溶剂耐受机制的认识和理解，也为
增强微生物细胞抵御外界环境胁迫提供新的策略。
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Ｂｉｏｌ，２０００，１５１（２）：３３３⁃３４０．
［１９］ 　 Ｂｏｓｓｙ⁃Ｗｅｔｚｅｌ Ｅ， Ｂａｒｓｏｕｍ Ｍ Ｊ， Ｇｏｄｚｉｋ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ
ｆｉｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｇｉｎｇ［ Ｊ］ ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００３，１５（６）：７０６⁃７１６．
［２０］ 　 Ｏｎｏ Ｔ，Ｉｓｏｂｅ Ｋ，Ｎａｋａｄａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ
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［２２］ 　 Ａｍａｔｉ⁃Ｂｏｎｎｅａｕ Ｐ， Ｖａｌｅｎｔｉｎｏ Ｍ Ｌ， Ｒｅｙｎｉｅｒ Ｐ， ｅｔ ａｌ． ＯＰＡ１
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（责任编辑　 管　 珺）
６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷