全 文 ：第７卷第６期
２００９年１１月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．６
Ｎｏｖ．２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０６．００３
收稿日期：２００９－０３－０３
基金项目：中科院百人计划资助项目；四川省青年科技基金资助项目（０８ＺＱ０２６ ０２３）；云南丽江映华生物药业有限公司资助项目
作者简介：范林萍（１９８５—），女，四川中江人，硕士研究生，研究方向：应用微生物；杨顺楷（联系人），研究员，Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｇｓｋ＠ｃｉｂ．ａｃ．ｃｎ；吴中柳
（联系人），研究员，Ｅｍａｉｌ：ｗｕｚｈｌ＠ｃｉｂ．ａｃ．ｃｎ
双菌多轮序列协同转化甾体制氢化可的松
范林萍１，杨顺楷２，吴中柳２，杨亚力２，李小刚１
（１．兰州大学 生命科学院，兰州 ７３００００； ２．中国科学院 成都生物研究所，成都 ６１００４１）
摘 要：建立了蓝色犁头霉ＡＳ３．６５和新月弯孢霉 ＡＳ３４３８１协同多轮转化１７α 羟基孕甾 ４ 烯 ３，２０ 二酮
２１醋酸酯（ＲＳＡ）制氢化可的松（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ，ＨＣ）新工艺。在培养好的 ＡＳ３６５和 ＡＳ３４３８１所组成的协同转
化体系中，ＡＳ３６５首先将ＲＳＡ水解为脱氧皮质酮（ＲＳ），这较 ＡＳ３４３８１单轮批次转化省去了 ＲＳＡ到 ＲＳ的化学
水解工序。在甾体底物ＲＳＡ平均投料质量浓度为１３ｇ／Ｌ和１ｇ／Ｌ的条件下，所选定的协同转化体系可分别被重
复利用３轮和６轮，相应的平均产率能维持在较高水平，分别高达８１６％和８５％。另外，该工艺明显减少了底物
ＲＳＡ投料浓度对Ｃ１１位羟化的影响，并有效抑制了ＡＳ３４３８１和ＡＳ３６５单独转化过程中出现的１４α ＯＨ ＲＳ和
１１α ＯＨ ＲＳ副产物。
关键词：蓝色犁头霉；新月弯孢霉；多轮序列；生物转化；氢化可的松
中图分类号：ＴＱ４６７．８ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０６－００１５－０６
ＡｎｏｖｅｌｐｒｏｃｅｓｓｏｆｍｕｌｔｉｒｕｎｓｅｑｕｅｎｃｅｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆＲＳＡｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ
ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅｗｉｔｈＡｂｓｉｄｉａｃｏｅｒｕｌｅａＡＳ３６５ａｎｄＣｕｒｖｕｌａｒｉａｌｕｎａｔａＡＳ３４３８１
ＦＡＮＬｉｎｐｉｎｇ１，ＹＡＮＧＳｈｕｎｋａｉ２，ＷＵＺｈｏｎｇｌｉｕ２，ＹＡＮＧＹａｌｉ２，ＬＩＸｉａｏｇａｎｇ１
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００００，Ｃｈｉｎａ；
２．ＣｈｅｎｇｄｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｌｏｇｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００４１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎｏｖｅｌｐｒｏｃｅｓｓｏｆｍｕｌｔｉｒｕｎｓｅｑｕｅｎｃｅｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ１７αｈｙｄｒｏｘｙｐｒｅｇｎ４ｅｎ３，２０ｄｉｏｎｅ
２１ａｃｅｔａｔｅ（ＲＳＡ）ｔｏｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（ＨＣ）ｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｂｙａｃｔｉｖｅｍｙｃｅｌｉａｏｆＡｂｓｉｄｉａｃｏｅｒｕｌｅａＡＳ３６５
ａｎｄＣｕｒｖｕｌａｒｉａｌｕｎａｔａＡＳ３４３８１．Ｔｈｅｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｗａｓｅｆｉｃｉｅｎｔｌｙｏｐｅｒａｔｅｄｗｉｔｈ
ｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｄｍｙｃｅｌｉａｏｆＡＳ３６５ａｎｄＡＳ３４３８１．ＲＳＡｗａｓｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｔｏＲＳｂｙＡＳ３６５，ａｎｄｏｍｉｔｅｄ
ｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｓｔｅｐｗｉｔｈＡＳ３４３８１ｉｎａｓｉｎｇｌｅｂａｔｃｈｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ａｍｕｌｔｉｒｕｎｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗｉｔｈｔｈｅｍｙｃｅｌｉａｏｆＡＳ３６５ａｎｄＡＳ３４３８１ｗａｓｒｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｒｅｅｏｒｓｉｘｔｉｍｅｓ，
ａｎｄｔｈｅｒａｔｅｏｆｅａｃｈｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒｕｎｏｆＲＳＡｔｏＨＣｗａｓｋｅｐｔａｔａｈｉｇｈｌｅｖｅｌ，ｉ．ｅ．，ｔｈｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎａｔ
Ｃ１１βｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆＲＳｗａｓｍｏｒｅｔｈａｎ８１６％ ａｎｄ８５％ ｗｉｔｈ１３ｇ／Ｌａｎｄ１ｇ／ＬＲＳＡｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａ
ｔｉｏｎｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｇｅｎｅｒａｌｙ，ｕｎｄｅｒｔｈｉｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｒｅｅｒｕｎａｎｄｓｉｘｒｕｎｓｅｑｕｅｎｃｅｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｗａｓ
ｄｏｎｅ．Ｉｎｐａｒｔｉｃｕｌａｒ，ｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆＲＳＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎＣ１１ｐｏｓｉｔｉｏｎｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎｗａｓｒｅｄｕｃｅｄ，ａｎｄｔｈｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｕｎｄｅｓｉｒａｂｌｅｂｙｐｒｏｄｕｃｔｗａｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄ，ｉｅ，ｏｎ１４αＯＨＲＳｏｆＡＳ３４３８１ａｎｄｏｎ１１αＯＨ
ＲＳｏｆＡＳ３６５，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＡｂｓｉｄｉａｃｏｅｒｕｌｅａＡＳ３６５；ＣｕｒｖｕｌａｒｉａｌｕｎａｔａＡＳ３４３８１；ｍｕｌｔｉｒｕｎｓｅｑｕｅｎｃｅ；ｂｉｏｃｏｎｖｅｒ
ｓｉｏｎ；ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ
协同转化法，即采用２种不同的微生物进行连
续或混合序列转化，实现对甾体化合物的多步反
应［１］。过去数十年来，已有不少关于用２种菌混合
转化制各种甾体激素的报道［２－３］。法幼华等［４］研究
了诺卡氏菌（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）６２ １和蓝色犁头霉 ＡＳ
３６５一起转化５α 娠烷 ３β，１７α 二羟基 ２０ 酮
２１ 醋酸酯，一步生成氢化可的松（ＨＣ）的协同转化
作用，即诺卡氏菌６２ １完成了 Ａ环的 Ｃ４，５ 位脱
氢，Ｃ３ 位羟基氧化为酮基，生成的 ＲＳＡ继续被 ＡＳ
３６５水解为ＲＳ，它作为底物再被引入 Ｃ１１β 羟基，
生成 ＨＣ。陈家任等［５］报道利用简单节杆菌（Ａｒ
ｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｉｍｐｌｅｘ）Ａ６９ ２和球孢白僵菌（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ
ｂａｓｉａｎａ）ＡＳ６９同时存在，一步实现了底物质量分数
０１５％摇床试验条件下，双菌对地塞米松中间体
１６α 甲基 １１α，１７α，２１ 三羟基孕甾 １，４ 二烯
３，２０ 二酮收率达５０％的结果。
ＨＣ作为重要的皮质甾体激素药物和中间体，目
前国内工业生产多采用蓝色犁头霉（Ａｂｓｉｄｉａｃｏｅｒｕｌｅａ）
ＡＳ３６５的传统一步转化发酵法，即经由ＲＳＡ溶于乙
醇投料转化，过程为ＲＳＡ→ＲＳ→ＨＣ（收率４５％）［６］，
副产物主要为表皮醇等；生物催化Ｃ１１β 羟化酶专一
性差是长期以来一直存在的问题，造成了我国宝贵薯
蓣皂素资源利用率低下。国外多采用新月弯孢霉
（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｌｕｎａｔａ）ＡＳ３４３８１转化ＲＳ生产ＨＣ，收率
约６０％［７－８］。近年来本实验室的研究结果也与此接
近（收率 ５７８％）［９－１０］，再次表明新月弯孢霉 ＡＳ
３４３８１是１株生产ＨＣ的优良菌株；但缺点是首先经
由薯蓣皂素多步化学合成ＲＳＡ，增加１步化学水解工
序制ＲＳ，再经由丙酮溶剂微粒结晶介质体系与培养
好的ＡＳ３４３８１菌丝进行生物转化；其次，在转化过
程中存在Ｃ１４α 羟基 ＲＳ副产物问题
［１１］。因此，发
酵工艺的改进和过程优化选择成为需要深化研究的
课题。遵循这一生物转化反应ＲＳＡ→ＲＳ→ＨＣ过程，
笔者开展双菌多轮序列协同转化甾体制ＨＣ的新工
艺实验研究，合理地整合ＡＳ３６５很强的水解酶活性
和较好的Ｃ１１β 羟化能力，再结合ＡＳ３４３８１更佳的
Ｃ１１β羟化酶活性，构成微生物转化新工艺（图１）。
在新工艺中，协同菌丝作为生物催化剂，可连续进行
４～７轮序列转化；每轮转化毕，分离的液相合并，菌
丝体次第转入下一轮液体反应介质，再度开始新一轮
生物转化过程；最后从合并的转化反应毕的液相中进
行产物回收。
图１ 协同菌丝体转化ＲＳＡ制ＨＣ的工艺过程
Ｆｉｇ．１ ＢｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎａｌｐｒｏｃｅｄｕｒｅｏｆｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｍｙｃｅｌｉａｆｒｏｍＲＳＡｔｏＨＣ
１ 材料与方法
１１ 菌种
蓝色犁头霉（Ａｂｓｉｄｉａｃｏｅｒｕｌｅａ）ＡＳ３６５，新月弯
孢霉（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｌｕｎａｔａ）ＡＳ３４３８１（即 ＮＲＲＬ２３８０，
ＡＴＣＣ１２０１７和ＣＢＳ２１５５４），均购自中国微生物菌
种保藏管理委员会普通微生物中心。
１２ 培养基
平板、斜面和发酵培养基参考文献［９］。
１３ 仪器及试剂
参考文献［９］。
１４ 实验方法
１４１ 菌丝体的制备
蓝色犁头霉和新月弯孢霉斜面用无菌水制成
孢子悬浮液，分别接入装有 ５０ｍＬ发酵培养基的
５００ｍＬ锥形瓶，２８℃、１８０ｒ／ｍｉｎ培养４８ｈ后，以体
积分数５％的接种量接入Ⅱ级发酵培养基，蓝色犁
头霉在相同条件下培养２４ｈ，新月弯孢霉在相同条
件下培养１８ｈ，菌丝过滤，分别收获蓝色犁头霉菌丝
体１和新月弯孢霉菌丝体２。
将上述两菌的孢子悬浮液，混合接入到５０ｍＬ
发酵培养基的５００ｍＬ锥形瓶中，培养条件同上，得
６１ 生 物 加 工 过 程 第７卷
混合菌丝体３。
１４２ 转化底物的制备
取一定量的 ＲＳＡ加入锥形瓶，以固液比１∶２５
再加入无水乙醇，于３０℃搅拌溶解，备用。
１４３ 生物转化 摇床实验
单菌转化：将制得的菌丝体１和２分别投入到
含底物 ＲＳＡ（２ｇ／Ｌ）的磷酸缓冲液（５０ｍＬ）中，
２８℃、１８０ｒ／ｍｉｎ转化约９６ｈ。
协同转化：组合１，先将制得的菌丝体１投入到
含底物ＲＳＡ（２ｇ／Ｌ）的磷酸缓冲液（５０ｍＬ）中，２８℃，
１８０ｒ／ｍｉｎ先行转化约２０、２４、２８ｈ后，再加入菌丝体２
继续转化；组合２，将菌丝体１和２同时投入到含同样
底物的磷酸缓冲液中进行转化；组合３，将混合菌丝
体３投入到含同样底物的磷酸缓冲液中进行转化；３
种组合的转化反应均控制在９６ｈ。
１５ 分析方法
用薄层色谱法（ＴＬＣ）和高效液相色谱法
（ＨＰＬＣ）进行分析，具体方法见参考文献［１０］。文
中数据为液相提取相对含量，未计入菌丝吸附甾体
物质的量。
２ 结果与讨论
２１ 协同菌丝转化工艺
２１１ 协同转化组合选择
对于协同转化法，本文设计了１、２和３种组合
（见１４３）对蓝色犁头霉和新月弯孢霉协同转化甾
体制ＨＣ进行考察，结果表明组合１在相同时间底
物转化最完全，产物质量分数最高，见表１和图２。
表１ ３种转化组合９６ｈ的结果比较
Ｔａｂｌｅ１ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｒｅｅｓｃｈｅｍｅｓａｆｔｅｒ９６ｈｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ
转化
组合
ｗ（ＨＣ）／
％
ｗ（ＲＳＡ）／
％
ｗ（ＲＳ）／
％
ｗ（副产物）／
％
１ ８０ 痕量 痕量 ２０
２ ７０ 痕量 １０ ２０
３ ４５ 痕量 ４０ １５
从表１和图２可知：组合１转化体系首先借助
菌丝体１的高水解活性，先单独转化２４ｈ，待生成大
部分ＲＳ时，加入菌丝体２，两者 Ｃ１１β 羟化作用的
加合，顺畅地引入 Ｃ１１β 羟基，生成的 ＨＣ产物质量
分数高于另外两组，且副产物也得到了有效抑制，
这与法幼华等［４］的报道一致。这就表明本双菌协
图２ ３种转化组合ＴＬＣ分析
Ｆｉｇ．２ ＴＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｔｈｒｅｅｓｃｈｅｍｅｓ
同转化的可行性，即顺畅实现 ＲＳＡ→ＲＳ→ＨＣ的生
物转化过程，得到ＨＣ质量分数高，副产物较少。
２１２ 接种量和菌丝体２投加时间对转化的影响
组合１在Ⅱ级发酵真菌液体培养物阶段，Ⅰ级
液体种子培养２ｄ后，转入Ⅱ级培养时，对接种量和
菌丝体２的投加时间进行了优化考察，结果如表２
所示。
表２ 不同时间投加菌丝体２对产率的影响
Ｔａｂｌｅ２ ＥｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅａｄｄｉｎｇＡＳ３４３８１
ｍｙｃｅｌｉａｏｎｙｉｅｌｄｒａｔｉｏ
接种
量
菌丝体投
放时间／ｈ
ｗ（ＨＣ）／
％
ｗ（ＲＳＡ）／
％
ｗ（ＲＳ）／
％
ｗ（副产物）／
％
２０ ８５ 痕量 痕量 １５
５％ ２４ ７５ ５ １０ １０
２８ ６０ ５ １５ １５
２０ ７５ 痕量 １０ １５
１０％ ２４ ８０ 痕量 痕量 ２０
２８ ５５ １５ １５ １５
由表２可知，当接种量为５％时，菌丝体２在菌
丝体１先行转化ＲＳＡ２０ｈ时，投入效果较好，ＨＣ转
化产率达８５％；而接种量为１０％时，菌丝体２在菌
丝体１先行转化ＲＳＡ２４ｈ时，投入效果较好，ＨＣ产
率达８０％。
２１３ 菌丝对甾体的吸附考察
易奎星等［１０］曾报道过有关菌丝体对甾体的吸
附现象，所以本实验对转化后回收烘干的协同菌丝
体进行研磨、热溶解和点样分析等方法处理，发现
接种量为５％和１０％的菌丝体都对甾体存在吸附作
用，其中接种量为１０％时，菌丝体２在菌丝体１先
行转化２４ｈ投入的情况下，协同菌丝体吸附现象较
７１ 第６期 范林萍等：双菌多轮序列协同转化甾体制氢化可的松
明显，估计每ｇ干菌丝吸附的ＨＣ质量高达９２ｍｇ，
有必要对菌丝体作回收甾体处理。
２１４ 单菌转化与双菌协同转化的比较
为了考察协同转化法的可行性，对单菌转化和
协同转化做了比较实验，均选择优化条件进行。结
果如表３和图３所示。
表３ 单菌转化与协同转化发酵液中各成分比较
Ｔａｂｌｅ３ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｐｒｏｄｕｃｅｄｔｈｒｏｕｇｈ
ｓｉｎｇｌｅａｎｄｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ
方法 ｗ（ＲＳＡ）／％
ｗ（ＲＳ）／
％
ｗ（ＨＣ）／
％
ｗ（副产物）／
％
ＡＳ３６５
单菌转化 痕量 １０ ５０ ４０
ＡＳ３４３８１
单菌转化 １０ １５ ５０ ２５
ＡＳ３６５／ＡＳ３４３８１
协同转化 痕量 痕量 ８５ １５
图３ 单菌转化与协同转化的ＴＬＣ分析
Ｆｉｇ．３ ＴＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｓｉｎｇｌｅａｎｄ
ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ
由表３和图３可知，ＡＳ３６５在转化的过程中
对ＲＳＡＣ２１ 位醋酸酯的脱乙酰化水解活性高，但是
生成的副产物量较大；ＡＳ３４３８１转化过程中生成
的副产物量较 ＡＳ３６５少，但由于其低的脱乙酰水
解活性，底物ＲＳＡ尚未转化完全；两菌对 ＲＳＡ的协
同转化，不仅底物转化完全，而且有利于抑制副产
物的生成，特别是针对ＡＳ３６５常见较高的Ｃ１１α 羟
化酶活性，发酵积累较高比例的表皮醇（Ｃ１１α ＯＨ
ＲＳ）；以及 ＡＳ３４３８１批式转化发酵中一直存在的
Ｃ１４α 羟化酶活性，生成相当数量的 Ｃ１４α ＯＨ ＲＳ
副产物，所以由表３和图３的 ＴＬＣ比较分析，双菌
的协同转化工艺较之传统的单菌批式转化（Ｃ１１β
羟化）有着明显的优势，目标产物 ＨＣ积累浓度高，
副产物生成量较少。这皆因在ＲＳＡ→ＲＳ→ＨＣ的转
化过程中，首先 ＡＳ３６５酶水解 Ｃ２１ 醋酸酯生成可
供双菌引入Ｃ１１β羟基的优良底物 ＲＳ，该步具有微
分低底物浓度投料的特点，部分解除ＲＳＡ的底物抑
制现象；伴随着Ｃ１１β ＯＨ ＲＳ（ＨＣ）产物的生成，甾
核随着第３个羟基的引入，产物分子极性增大，有利
于ＨＣ产物分子从菌丝细胞向外水相扩散转移，也
有效降低了ＲＳ→ＨＣ的产物抑制效应，有利于目标
产物在发酵液相的积累。这再次表明该双菌协同
转化是可行的工艺过程。
２２ 生物催化剂多次重复使用的性能考察
为了提高协同菌丝体的利用效率，受文献［９］
启发，即连续２批次利用 ＡＳ３４３８１静息细胞生物
转化ＲＳ生产ＨＣ，将首轮进行反应完全的协同菌丝
体过滤，继续投入到相同反应介质体系下进行多轮
批式序列转化试验，以考察提高生物催化剂生产效
能的可行性。
２２１ 首轮转化投料浓度对转化率的影响
研究表明，ＨＣ的生成过程存在底物抑制现
象［１２－１３］。底物浓度对转化反应的影响较大，当投料
浓度太高时，产物生成率下降，转化时间延长，导致
副反应的发生；投料浓度低时，能获得较高的转化
率，且转化时间短，但菌丝作为生物催化剂的生产
性能得不到充分利用，在工业生产中应用价值有
限。本研究对首批次底物浓度进行了比较，结果见
表４。
表４ 首轮投料质量浓度对产率和转化时间的影响
Ｔａｂｌｅ４ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｄｄｉｎｇｓｕｂｓｔｒａｔｅｏｆ
ＲＵＮ１ｏｎｙｉｅｌｄｒａｔｉｏａｎｄｔｉｍｅ
ρ（底物）／
（ｇ·Ｌ－１）
ｔ／ｈ ｗ（ＲＳＡ）／％
ｗ（ＲＳ）／
％
ｗ（ＨＣ）／
％
ｗ（副产物）／
％
１０ ４８ 痕量 痕量 ９５ ５
１５ ８６ 痕量 痕量 ８５ １５
２０ ９０ 痕量 痕量 ８５ １５
２５ １４４ 痕量 ５ ７５ ２０
由表 ４可知，质量浓度在 １５～２０ｇ／Ｌ之间
时，转化率较稳定。鉴于１０ｇ／Ｌ的投料质量浓度
低，菌丝体催化活性尚未得到充分的应用，如果多
次利用，同样会达到提高 ＨＣ总产量的效果。故对
选择ＲＳＡ初始质量浓度为２０ｇ／Ｌ和１０ｇ／Ｌ的多
轮转化进行了比较试验。
８１ 生 物 加 工 过 程 第７卷
２２２ 协同菌丝体转化多轮批次试验
首轮转化反应结束后，过滤分离液相和菌丝，菌
丝混合物转入含微粒结晶性甾体底物ＲＳＡ的磷酸缓
冲液进入后续多轮次序列转化，结果如表５所示。
表５ 协同菌丝体从第２轮到第７轮的转化情况
Ｔａｂｌｅ５ ＢｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｍｙｃｅｌｉａｓｙｓｔｅｍｆｒｏｍＲＵＮ２ｔｏＲＵＮ７
轮数 方式 ρ
（底物）／
（ｇ·Ｌ－１）
ｔ／ｈ ｗ（ＲＳＡ）／％
ｗ（ＲＳ）／
％
ｗ（ＨＣ）／
％
ｗ（副产物）／
％
２
Ⅰ
１０ ６６ 痕量 痕量 ８５ １５
１５ １２０ 痕量 痕量 ７５ ２５
２０ １４０ 痕量 ５ ６０ ３０
２５ １９２ ５ １０ ５０ ３５
Ⅱ
１０ ４８ 痕量 痕量 ９０ １０
１５ ９６ 痕量 痕量 ７５ ２５
２０ １２０ 痕量 ５ ５５ ４０
３
Ⅰ １０ ７２ 痕量 ５ ７５ ２５
Ⅱ １０ ４８ 痕量 痕量 ８５ １５
４
Ⅰ １０ ９６ 痕量 ５ ５０ ４５
Ⅱ １０ ４８ 痕量 痕量 ８５ １５
５ Ⅱ １０ ４８ 痕量 痕量 ８０ ２０
６ Ⅱ １０ ４８ 痕量 痕量 ７５ ２５
７ Ⅱ １０ １１３ ２５ ５ ３５ ３５
注：方式Ⅰ指第１轮投料质量浓度为２ｇ／Ｌ；方式Ⅱ指第１轮投料质量浓度为１ｇ／Ｌ。
结合表４和表５的数据分析可知，当初始投料
质量浓度低（１ｇ／Ｌ）时，协同菌丝进行６轮转化表现
出较稳定的羟化酶活性，平均每轮转化时间在４８ｈ
左右，平均转化产率达８５％；当初始投料质量浓度
为２ｇ／Ｌ时，协同菌丝进行３轮转化也呈现较稳定
的生物催化活性；后２轮以１ｇ／Ｌ进行投料，首批次
转化时间约９０ｈ，后２轮转化时间都维持在７２ｈ左
右，平均转化产率 ８１６％（本实验室已有利用 ＡＳ
３４３８１单轮批式转化ＲＳ０２％底物生成ＨＣ产物产
率８１３％的ＨＰＬＣ分析结果，见图４，ＨＣ保留时间
３６１５ｍｉｎ，归一化法８１３％）。
图４ 发酵液ＨＰＬＣ原始图
Ｆｉｇ．４ Ｏｒｉｇｉｎａｌｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈ
由图４可以看出，本双菌多轮序列协同转化甾
体底物 ＲＳＡ生产 ＨＣ的工艺技术途径是可操作的，
具有应用开发的可行性，因为该工作在当前甾体工
业生物技术开发方面具有一定创新性，即针对传统
工艺生产ＨＣ的２株真菌 ＡＳ３６５（本土工业菌种）
和ＡＳ３４３８１，均具有 Ｃ１１β 羟化酶活力，可有效向
甾体引入Ｃ１１β羟基。综合集成了二者生物催化的
优点，在获得的多次可重现的摇瓶实验数据中，表
明应用该２株真菌培养好的活菌丝，在选定的优化
转化体系中，实现对甾体底物ＲＳＡ的多轮序列协同
转化是可行的，具有总产物ＨＣ产出量高、反应副产
物少、工艺操作的稳定性较佳的特点。工艺放大到
实验发酵罐的制备实验研究正在进行之中。
３ 结 论
本研究建立的双菌协同多轮转化新工艺，较传
统的单轮批式转化不仅有效地抑制了副产物的产
生，省去了ＲＳＡ到ＲＳ的化学水解工序，且协同菌丝
体在平均底物投料质量浓度分别为 １３ｇ／Ｌ和
１ｇ／Ｌ的条件下，能分别被多轮重复利用 ３轮和 ６
９１ 第６期 范林萍等：双菌多轮序列协同转化甾体制氢化可的松
轮，平均转化产率分别高达８１６％和８５％。该双菌
协同菌丝体的多次重复利用，的确能有效地提高生
物催化剂的使用效率，总投料质量浓度较原有的ＡＳ
３６５单轮批式发酵工艺 ＲＳＡ质量浓度１５ｇ／Ｌ提
高３～４倍，ＨＣ收得率可提高５％ ～１０％。表明现
有工业皮质激素药物制造中重要的霉菌发酵Ｃ１１β
羟基化，立足于现有工业用菌株的遗传学／生理学
水平的优化选择，强化转化工艺的过程分析，建立
新工艺技术路线仍有改进提高的潜力。这对近年
我国该行业耗用３００ｔ／ａ薯蓣皂素产出６０ｔ／ａＨＣ
的半合成工艺的改进提高及我国薯蓣皂素利用率
的提高显然具有重要意义。这也并非是近年西方
学者（合成化学）持有的悲观论，认为过去５０多年
来生物转化法向甾核Ｃ１１ 位引入β羟基，众多文献
报道的结果是收效甚微的观点［１４］。这就说明当代
合成生物学应用基础研究的重要性，也为甾体药业
的绿色制造展示了美好前景。
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０２ 生 物 加 工 过 程 第７卷