全 文 ： 万方数据
· 8 · 生物加工过程 第4卷第2期
氧化专一性不够理想，成品中除了Hc外，还产生
c；，廿羧基化合物，即表氢化可的松，以及少量其他位
置的羟基化合物，剐产物的量比较大；所以Hc的总
收率不是很理想，其产率平均维持在45％左右(以
化合物s醋酸酯(RSA)计)bj。早在1953年，国外就
已经有了用新胃弯孢霉(绕阳如斑z黝船)转化制备
HC的报道。本实验室通过对以上两株菌种的选育
比较，发酵条件的优化，提高了Hc的净产率，应用
改进的发酵工艺，使用薪月弯孢霉AS3．438l菌株可
以使Hc的收率达到55％～60％(以RS计)旧』。本
文将结合本实验室的工作，就鼹内外有关对篷体C，，
B一羟基化的研究进展及应用作一评述。
l甾体C，，8一羟基化生物化学反应的机理
箔体的羟化夔都是细胞色素P4鼬依赖型单加氧
酶，是P4踟末端氧化酶，其利用分子氧而且需要一个
MD滩提供电子转移系统。蹯+晓+N鑫D雕+
H+一RoH+H20+NADp+。
中国台湾Kuo．chengchen等以及国内卢文玉等
对毅月弯孢霉‰酶在鼷体c，，8一羟基化过程中的研
究，证实P4∞酶含量与细胞转化为Hc能力具有正相
关性∞』，真菌甾体羟化酶是缩胞色素P珊单加氧酶。
C，，0一羟化位上的援基的立体位置是竖直的，由于10
位、13位角甲基的存在，造成C。p一竖键羟基的立体
阻碍毙G；找一横键羟基位阻大，这就导致C，；零．羟化比
c¨a．羟化效率低，而且其副产物也较多。
2具有对甾体进行C，，8-羟基化能力的菌种
选择
目前网内生产Hc的种菌主要是蓝色犁头霉，
近年王敏[1b娩3等对此工艺有栩关的研究报道。健由
于蓝色犁头霉氧化专一性低，Hc的收率受到限制，
国外大都是用新月弯孢霉进行工韭化生产，国内对
用薪月弯孢霉进行生物转化生产腿也有相关研
究，但未有投入工业化生产。
早在上世纪7e～∞年代，俄罗斯科学院微生物
生理生化研究所就用选到的新月弯孢霉(如删以}以口
‰嬲玩VKI娃F-6籍)对RS，RsA，17馥．羟醋酸髓．RS焱进
行c，；8一羟基化生产Hc做过系统研究，对投料浓度、
菌丝量、茵龄、接种方式、底物添加方式、转化时阔等
做了比较实验，确立了此反应的相关过程参数[13。。
黄淑惠等对新月弯孢霉c，，p。羟基化16a．甲基．RSA
进行了研究，也表明薪冀弯孢霉c，，8一羟基化的转化
能力ll引。曾本秀等对新月弯孢霉对甾体c，，8．羟基
化的研究也作了部分研究工作，对菌丝体的培养、底
物的添加浓度及时闽、转化条{牛等进行了一些试验
研究【1引。本实验室通过对新月弯孢霉AS3．4381菌
株的选择，发酵工艺的改进，提高了投料浓度及总甾
体量的回收率，HC产率较现有的蓝色犁头霉显著提
高，有望投入工业化开发晦7|。
翦苏联学者An鼯lo糖较系统地开展了新月弯孢
霉(仇形M如腕f。M地)BKMF-644菌株对甾体底物的
C，，§．羟基化作用的裰关研究雏引。他们在对15株小
克银汉霉属(仇黼i挖砌税me玩)和6株弯孢霉属(Gu卜
讹酝砌)菌种直接进行定向筛选具有对甾体底物RS
和RSA进行C，，8一羟基化生物转化能力的基础上，发
现小克银汉霉属的培养物产生了多种甾体羟撼化
物，且c蚪一羟基纯产物占{茏势，目标产物C，，8。羟基
化物的含量较低。在这一过程中，最有效的甾体c¨
8．羟基化菌是新月弯孢霉(醌MMf0砌￡M础搬)VKMF-
644秘vNlC建鼹株菌，它们对RS秘RSA呈现了最
高的C。，p．羟基化活性，积累的转化产物量达到50％
(Rs为底物)；HC与截产物l霹娃．羟基．懿的数量耽在
2：1～2。5：l的范围内；对RsA的转化过程，这两株
菌均能生成c¨p．羟熬化产物Hc，数量分数为
37。5％，副产物14娃．羟綦．髓为25％，主副产物之比
为1．5：1；尚存留20％～25％的底物RsA。可见，以
RsA作为转化产物，都要经菡丝培养物的脱乙酰化
(水鳃)生成RS，骼再被液体菌丝培养物的cn．羟化
酶系催化生成相应的溺体羟化产物，即目标产物HC
穗副产物14静羟基一醛。
一般说来，新月弯孢霉对底物RsA具有较低的
脱乙酰活性，两犁头霉As3。密却对胬焱呈现较高
的脱乙酰活性，转化过程为：RSA—RS—Hc及浏产
物。这就是国内工业生产Hc采用RsA作底物进行
生物转化的菌种特征，羟化产物的收率70％，产物
中HC的质量收率45％15]。图外多采用新月弯孢霉
作为生产藩，HC的转化率8◇％以上，收率55％一
60％；德国先令公司的“双菌”工艺，Hc产率70％左
右‘¨。
万方数据
2006年5月 杨顺楷等：甾体微生物转化c。。p．羟基化的研究进展 ·9·
3甾体C。。13-羟基化生物转化过程涉及的部
分生理生化问题
迄今为止，对微生物细胞甾体C，，8．羟化酶体系
的机理研究工作仍较薄弱。文献资料有关甾体c¨
8一羟基化的报道仍是相互矛盾的。
c。，B．羟基化过程具有低效率的特征，受制于底
物极低的溶解度(O．06g／L)；而在生产中实际使用的
底物均停留在0．1％～o．3％的数量级上；若采用较
高浓度的甾体底物又局限于使用大量能与水相混溶
的有机溶剂，而高浓度的有机溶剂导致生物催化剂。
酶系统的变性失活。因此，现行的甾体C。。B．羟基化
生物转化过程，一般选择技术经济可行的有机溶剂
(如乙醇)作为配制甾体底物的溶剂，然后投加到生
理水相介质体系中进行甾体生物转化过程。当产物
浓度积累到最大值时，则终止转化反应，进行产物的
分离回收。
3．1培养基组成的选择
培养基的组成对霉菌的生长和转化有很大的影
响。甾体生物转化具有明显两阶段的特征，即微生
物培养阶段和生物转化阶段。所以在微生物培养阶
段，要重视对培养基组成的优化，并进行合理设计，
以获得优质优量的菌丝体细胞，为第二阶段的甾体
转化奠定基础。
为了保持筛选C，，13一羟化菌株过程的简化，本实
验室通常选用一种培养基，维持分离获得的各种斜
面菌株的液体生长培养，通常包括霉菌、酵母、细菌
及放线菌。其初始的组成如下：葡萄糖20g，黄豆粉
5g，氯化钠5g，酵母浸粉5g，磷酸氢二钾5g，蒸馏
水1L，灭菌前pH调到7．0。根据实验项目的需要，
可以对某些成份进行修改，如果需要配制全可溶性
发酵培养基，则可用蛋白胨代替黄豆粉，葡萄糖可用
蔗糖或糊精或淀粉代替。
蓝色犁头霉(4船砒。砌舭)AS3．65在上述的
发酵培养基的生长培养中，经二级发酵收获处于稳
定生长期之初的菌丝(干重计约在6。8g／L)，以此
用于对分离出来的60株斜面的液体培养物对RSA
进行转化筛选试验。前苏联学者M0凼1niskv等，在
开展蓝色犁头霉(z玩加批耽on晓i掂)对RSA生物转
化生产HC的实验研究中，选择M，培养基(组成为
葡萄糖30g，玉米浆20g，N地N031．0g，(N地)2HP04
3．0g，MgS040．2g，FeS04。7H200．04g，自来水1L，
灭菌后pH5．3～5．6)，及其M2培养基的碳源组份试
验，结果表明，其菌丝生长生物量均同样在5。7g／L
范围内(收获菌丝均选在稳定生长期之初)；摇瓶试
验对RSA的生物转化表明，培养基中的葡萄糖被蔗
糖或淀粉替代后，并没有造成c¨．和c，，B．羟化甾体
产物数量比例的改变，但是却呈现了利用蔗糖作碳
源的试验组转化速度较之淀粉组快1．5倍，较之利
用葡萄糖组快2倍的试验结果，故其后对该菌株的
试验研究，均采用蔗糖代替葡萄糖作碳源；在300L
发酵罐装量1loL培养基，接种蓝色犁头霉(丁．orc一
危施如)进行生物转化55gRSA制备Hc的放大试验
中，获得了在不超过10～14h转化期间内，生成产
物HC的数量比例达到55％～60％，表皮醇为25％
的纸色谱和薄层层析数据分析结果；再经精制，HC
精制率为理论值的49．5％；表皮醇经化学加工，获
得了达药典要求的醋酸可的松，产率13．6％；其他
副产物为痕量的放大试验结果。值得指出的是该
RSA的底物质量浓度较低(0．5g／L)，实际应用价值
有限[10]。
近年国内茅燕勇等在进行葡枝根霉NG00305
酶催化甾体cllQ．羟基化的实验研究中，对培养基中
碳源对甾体底物c¨一羟基化转化率的影响获得了
有意义的结果¨6|。他们选用了4种碳源，即葡萄
糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉，结果发现以葡萄糖和淀粉
作为碳源时，对甾体底物c，，a．羟基化有较高转化
率，分别为44％和48．3％，而蔗糖和麦芽糖则为
23．6％和22．5％；比较其生物量(菌丝干重，g／L)，前
二者为8．5和7．3；后二者为5．5和4．2。作者采用
淀粉和葡萄糖质量比为1：l时，菌丝生长可缩短滞
迟期，而较早地进入对数生长期，此时作为生物催化
剂载体的菌丝体生物量也快速增长，到对数生长期
末，或稳定期之初，甾体羟化酶系总活力达最大值。
3．2收获生物催化剂最佳时机的确定
实验考察结果表明甾体生物转化过程中在C¨
|3．羟基化酶活性最高的时候加入底物进行生物转化
可获得最高的目标产物，因此对酶活力最高时期的
确定尤为重要。sukhodolskava等对新月弯孢霉在生
长培养过程中，伴随着C，。B．羟基化酶活性形成的生
理生化特征的相互关系进行了研究¨7’。他们确证
了最高的c，，B一羟基化酶活性形成是在对数生长期
之末(生长势减缓)和静止期的生长培养物。在这个
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·12· 生物加工过程 第4卷第2期
od01skaya等较系统地比较分析了新月弯孢霉F一644
对RS的C，，j3一羟基化反应，指出在磷酸一柠檬酸缓冲
液中有较高C，，13一羟基化反应速率[18I。国内王敏等
人在开展犁头霉对RsA的C，，B．羟基化研究中，得出
了选择洗涤菌丝悬浮在柠檬酸缓冲液中有利于c。
J3．羟基化的结果，分析指出无论是犁头霉或新月弯
孢霉在c，，B．羟基化反应过程中，洗涤菌丝可提高羟
化酶的专一性，减少异构体副产物的形成¨1I。冯汉
昌和于连生先前报道过蓝色犁头霉(A凰玩如co俨
此o)的二级发酵培养工艺，分离出菌丝物在液相悬
浮介质中对RS底物进行C，。13一羟基化，在底物浓度
相同的情况下，与直接发酵氧化(一步转化法)比较，
氧化(c，，13．羟基化)速度提高1～2倍，缩短了发酵周
期；RS的投料浓度也比直接发酵氧化提高了1．2～
1．3倍，有利于提高生产效率∞’7]。所以，微生物的
生长介质同实际操作的生物转化阶段分开进行有如
下优点：
(1)除去生长阶段可能导致对底物或产物有害的
影响因子。
(2)能很直观地选择优化的细胞物浓度以对应于
合适的转化速率(因为培养的细胞物密度是常量)；
通常在细胞悬浮缓冲液介质体系中有较高的反应速
率。
(3)勿需严格的无菌操作条件，因为缺乏微生物
生长培养基。
(4)从简单缓冲液介质反应混合物中分离转化产
物较从复杂的培养基混合物中分离操作容易得多。
(5)个别发酵参数的优化调节(如pH、通气量等)
可在没有微生物生长(或影响微生物生长)的条件下
进行。
由此可见，根据微生物转化甾体底物的c，，口一羟
基化生产Hc工艺过程的两阶段特征，有必要将微
生物的生长阶段同生物转化阶段分开进行，有利于
生物催化及生物加工过程优化。本实验室利用静息
细胞进行转化，在经过对部分工艺的调整后，转化率
明显提高，副产物也相对减少，Hc的收率也达到国
外先进水平。
5微生物甾体C。。p-羟基化过程中副产物的
问题
以Hc为代表的糖皮质激素药物及其衍生的临
床治疗剂，如培他米松(Bet—t}lasone)、地塞米松
(DeX锄et}lasone)、摩美松(Momethasone)和倍克乐美
松(Beclomet}lasone)等，在甾体抗炎、皮肤病及变应性
治疗中仍继续起着主要作用。但是，这些药物的生
产主要是由天然存在的植源性薯蓣皂素(diosgenin)，
经由非常昂贵、多步半合成的手段制造出来。在这
些化合物的多步合成工艺中，其中又以微生物学技
术手段引入甾体骨架的C，，p．羟基是最昂贵的合成
步骤；而在该步微生物化学反应中，大部分的损失都
源于副产物的形成，因而导致该类药品为高档高值
的原料药品而进入精细化学品市场。作为该类药品
生产工艺的改进问题，自然就集中在微生物甾体转
化C，，口．羟基化生物技术的研究与开发上，追求的目
标就是减少或降低反应副产物的量，有效提高c。。p．
羟基化的产率Ⅲo。
现行国内HC工业生产一直采用的菌种是蓝色
犁头霉(A凰施。coem如o)AS3．65，其羟基化能力高于
一般水平，羟基化产品的收率近70％，其中c，，口．羟
基化产物Hc的质量收率，以底物RsA计为43％一
45％届4产物主要是C，，a．羟基化物(表皮醇)，占
20％～30％；该a．体经过乙酰化、氧化，可制得醋酸
可的松；此外，还有在甾体底物其他位置上引入的羟
基化合物作为副产物存在，如c，a．羟化物，c。。d．羟化
物，同时在反应混合物中尚存在有被水解的Rs和
未转化的RsA；有时还会出现生成的主要产物被继
续氧化成为可的松的情况，比例可达到5％～10％。
可见，蓝色犁头霉的羟化过程是十分复杂的，加之一
直采用“一步转化法”工艺，给产物的分离精制增加
了难度，导致产收率难以提高。
国外利用新月弯孢霉进行RS的c，。口．羟基化生
产Hc的工艺中，生成的副产物相对较少，且主要为
14一a一羟化物和7廿羟化物，有时尚有痕微量的11心
羟化物和可的松生成，但在分离精制时易于提纯。
但是，随着底物浓度的提高，副产物的数量也开始逐
渐增加，特别是在延长转化时间后，如果是“一步转
化法”工艺，还可能出现20一酮还原之类的副产物；如
果加入RSA作为初始底物，其转化产物及副产物的
情况更加复杂，可导致多达7～8个化合物共存于一
个液体混合物介质体系中，给目标产物Hc的提取
分离造成很大困难，导致该步反应成为了最昂贵的
合成步骤。所以以化合物s作为新月弯孢霉甾体转
化的底物是更经济可行的，因为它具有转化反应速
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生物加工过程 第4卷第2期
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