全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 && 月
生"物"加"工"过"程
*
8FM3$%&%
DFC"&%37#7 ,^3C11L3$ ?#6!3$%&%3%#3%%0
收稿日期"$%&% ?%& ?$&
基金项目"中科院百人计划&四川省青年科技基金资助项目$%!R9%$# ?%$%
作者简介"范林萍$&7!(%#女#四川中江人#硕士#研究方向"应用微生物学&杨顺楷$联系人%#研究员#Z-J@C/"K@LX1aeAC:3@A3AL
改进底物添加体系制备氢化可的松
范林萍&#杨顺楷$#吴中柳$#杨亚力$#李小刚&
$&g兰州大学 生命科学学院#兰州 6%%%%& $3中国科学院 成都生物研究所#成都 #&%%0&%
摘"要"在蓝色梨头霉和新月弯孢霉协同转化制备氢化可的松$S*%过程中#常规的底物热溶液体系由 &6
$
羟基
孕甾 0 烯 #$% 二酮 $& 醋酸酯$4].%和乙醇组成#其中)$4].%l>$乙醇% n&l$(&改进后的底物溶液体系由
5_HHL-!%)丙三醇)4].和磷酸盐缓冲溶液$ =` ]%组成#其中 >$5_HHL-!%%l>$丙三醇%l)$4].%l>$ =` ]% n
&ll&l$(( 4].质量浓度从$ X,N起#累加到( X,N#4].全部被转化#且产物氢化可的松$S*%产率与常规低浓度投
料相当&在4].质量浓度 X,N时添加底物#协同菌丝体能重复利用达 次#S*产率稳定在 6%f左右&经 批次实
验室摇瓶放大制备实验#产物S*平均收率为 ($f#重现性较好#工艺操作稳定( 5_HHL-!%,丙三醇,4].,=`]底物
体系较常规4].,乙醇构成的底物添加体系#可显著提高S*生产收率#有工业应用价值(
关键词"蓝色犁头霉&新月弯孢霉&转化&氢化可的松
中图分类号"590#6g!""""文献标志码".""""文章编号"$ ?#6!$$%&%%%# ?%%&( ?%6
8.2F45/1724I5F.2/X!*F2 -KG42:24F.12/0".I942A0I0/F275GG./; 13J1F45F0
Y.8NCL-2CLX
&
#U.8V]
#[TR
#U.8VU@-/C
$
#NOPC@F-X@LX
&
$&3]A
端皮质甾体药物的合成中间体#其生产采用国内数
十年来依托薯蓣皂素建立起来的半合成工艺路线(
虽然该化学合成工艺水平与国外相差不大#但是霉
菌氧化发酵工艺则是其中的薄弱环节&后者主要采
用本土丝状真菌蓝色犁头霉的发酵转化工艺#以
$g( X,N&6
$
羟基孕甾 0 烯 #$% 二酮 $& 醋
酸酯$4].%为底物#含体积分数 0g(f的乙醇#能与
发酵生理水构成混溶的生物转化反应混合物为体
系#S*收率维持在 0(f左右*&+ # 而国内S*总收率
单项指标为 &7f#这与国际先进水平 $6f的差距
较大*$+ (
""鉴于丝状真菌甾体生物转化制 S*的羟化酶为
胞内诱导酶系#亲脂性甾体底物分子须透过细胞
壁)细胞膜等结构才能与以细胞色素=0(% 为代表的
*
&&
%
羟化酶膜反应器进行转化反应*+ &且甾体底
物在生理水相中的溶解度低#因此限制了自4].到
S*发酵生产时间,体积效率的提高及改进&此外#
蓝色犁头霉菌氧化发酵过程中存在甾体.破坏酶/
裂解甾环的副反应*0+ #是长期影响 S*产率提高的
因素之一(
""为了解决工业生物催化剂及生物加工过程中
酶的高活性)高稳定性及高选择性问题#YHEL@LDHE1
等*(+曾提出选择合适的有机溶剂构成与水混溶的
单液相或双液相体系以有效地提高底物浓度#从而
增高产物产率&张金红等*#+的研究表明在犁头霉菌
催化4].的反应中#利用 &$g(f丙二醇为转化介质
体系#可使底物质量浓度由$g! X,N提高到0g( X,N(
中国科学院成都生物研究所生物催化与分子进化
在蓝色犁头霉和新月弯孢霉组成的协同菌丝体转
化4].制 S*的研究中#发现协同转化能有效地降
低单菌转化过程中产生的副产物#从而提高产率(
然而#底物浓度限制效应仍然存在( 本文以协同转
化为基础#从文献*6 ?7+报道的多种有机溶剂中筛
选出合适的有机溶剂#构成相应的有机溶剂,底物
添加体系#并探讨 5_HHL-!%)底物体系的处理方式
和底物负荷量等因素对生物转化 4].制 S*反应
过程的影响(
D?材料与方法
D=D?菌种
""蓝色犁头霉$@9-%# +(,&/$,#%.] g#(#新月弯
孢霉$"/&?/$#&# $/2#7#%.] g0!&#均购自中国微
生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
$*VQ**%(
D=B?试剂及药品
""4].和S*由湖北制药厂及山东新华制药公司
提供( 文中所涉及其他试剂及相关药品均为市购
分析纯(
D=O?培养基
""文中所用培养基按文献*!+配制(
D=P?方法
&303&"生物催化剂的制备
""游离菌丝体的制备"蓝色犁头霉和新月弯孢霉
斜面用无菌水制成孢子悬浮液#分别接入装有
(% JN液 体 培 养 基 的 $(% JN锥 形 瓶# $! j)
&!% E,JCL摇瓶生长培养# <后#以体积分数 (f转
接接入第二级锥形瓶培养( 蓝色犁头霉在相同条
件下培养$0 <#新月弯孢霉在相同条件下培养&! <#
菌丝过滤#分别收获蓝色犁头霉菌丝体 & 和新月弯
孢霉菌丝体 $(
&303$"有机溶剂的选择
""单菌转化"将湿质量 i( X的菌丝体 & 或 $ 分
别投入到由氯仿)二氯甲烷)&#$ 丙二醇)丙三醇)
四氢呋喃)正庚烷)乙醇)甲醇共 ! 种有机溶剂溶解
的含有$ X,N底物 4].的 =` ] 磷酸盐缓冲液中混
合#$! j)$%% E,JCL转化 # i0! <(
""协同转化"在上述有机相介质中#菌丝体 & 先转
化约&% <后#添加菌丝体 $ 再转化 $# i! <#条件
不变(
&303"放大制备实验
""0 只& N锥形瓶#装液量$%% JN#投料质量浓度
X,N( 反应结束后#集中 0 瓶反应液#$ 倍体积乙
酸乙酯萃取#萃取液置旋转蒸发仪浓缩#试样结晶)
柱层析#得目标产物#烘干至恒质量#称质量)计算
得率(
D=R?分析方法
""利用 5N*法和 S=N*法#按文献*&%+中方法
进行(
B?结果与讨论
B=D?有机溶剂对生物转化的影响
""构建有机溶剂生物转化反应体系的关键是有
机溶剂的选择*&+ ( 不同的有机溶剂对底物和产物
的溶解度及生物催化剂的活性和稳定性都有不同
程度的影响( 为了选择较优的有机溶剂#本研究
以乙醇为对照#考察常用于甾体生物转化的有机
溶剂对单菌转化和协同转化 4].制 S*的影响
$溶剂的比例以有机溶剂体积,总转化液体积进行
配制%#结果见图 &( 由图 & 可知"与常规溶剂乙醇
相比#蓝色犁头霉单菌转化时仅&#$ 丙二醇对产
率有所提高#这与文献*#+报道的相符&对于新月
弯孢霉#溶剂 &#$ 丙二醇和丙三醇显著提高了产
率#且在此溶剂体系中#常被认为脱乙酰活性弱的
#& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
新月弯孢霉表现出较强的将 4].水解为脱氧皮质
酮$4]%的能力#产物积累量和蓝色犁头霉单独转
化4].时水平相当( 这表明该有机溶剂添加底物
的转化介质有利于新月弯孢霉菌丝体酶法水解
4].为 4]#并继而转化为产物 S*#这很有利于同
国内现有工艺整合#但与文献*&&+报道有别( 对
于协同转化#使产率有明显提高的溶剂仍然是
&#$ 丙二醇和丙三醇&对底物有较大溶解度的氯
仿和二氯甲烷#在单菌转化中能明显抑制转化反
应体系的活性#因此未能在转化液中检测到产物
的生成&而在两菌构成的协同转化中#可进一步提
高催化剂的活性和稳定性#检测到 S*的产率分别
达 0$g(f和 00f#这表明氯仿和二氯甲烷与水相
构成的双液相协同转化体系较单菌转化在该系统
维持转化稳定性方面具有明显的优势#与文献
*&$+报道相符(
&#f氯仿&$&(f二氯甲烷&&%f&#$ 丙二醇&0&%f丙三醇&(#f四氢呋喃&#$%f正庚烷&6(f乙醇&!f甲醇
图 D?有机溶剂对生物转化的影响
Q.;=D?#70:F12724;5/.:126A0/F12/J.2F45/1724I5F.2/
""以丙三醇为溶剂的转化体系中#产物量较 &#$
丙二醇条件下低#但生成的副产物也偏少( 因此在
工业生产中#如底物不能定量转化#在转化过程达
动态平衡时#宁可中止转化反应#回收剩余底物#阻
止生成副产物是可取的( 为了选择更合理的底物
添加体系#继续对 $ 种有机溶剂的相关参数作进一
步实验考察(
B=B?转化体系的再优化选择
""目前用于生物转化的有机溶剂转化体系#一般
不是将有机溶剂直接与水相$缓冲液或发酵液%混
合#而是在溶有一定量的底物后#再添加到反应液
中呈微结晶颗粒态进行转化( 上述选择的 &#$ 丙
二醇和丙三醇#有别于乙醇通过加热就能很好溶解
底物#此处须将底物 4].在溶剂中制成均匀悬浮
物#即借助5_HHL-!% 表面活性剂的作用#在研磨条
件下制成混悬浮液添加底物*&+ (
""以 $g& 中优选出的&#$ 丙二醇和丙三醇为有
机溶剂#分别与底物 4].混合#并加入一定量的
5_HHL-!% 助溶#然后加入 =` ] 稀释#构成底物,助溶
剂,有机溶剂,=`]的4].$0% JX,JN%投料体系#这
就显著减少了有机溶剂的使用量#降低对生物催化
剂的毒性#细胞及酶的活性得到保护#可有效提高
生物催化体系的操作稳定性#催化时间缩短了 &! i
$0 <#有利于提高生产效率(
$3$3&"底物前处理方式对协同转化的影响
""采用研磨法)超声波法)研磨超声复合法#分别
对5_HHL-!%,有机溶剂,4].以体积质量比 &l&l&进
行处理#结果如图 $ 所示( 由图 $ 可知"经过研磨超
声复合处理制备的底物添加体系#转化产率相对较
高( 这可能是投料底物微结晶颗粒较单一的研磨
法)超声波法处理后更微细化#以至于能更充分地
与生物催化体系触发反应#生成的羟化产物因为甾
体分子疏水性降低#而易于扩散进入菌丝胞外水
相#转化时间较单一处理缩短 &$ i&! <#生物转化
更趋完全(
$g$g$"有机溶剂配制比例对转化的影响
""]@LB<@L@J等*&0+报道转化体系中有机溶剂所占
比例对转化有着显著的影响( 本实验在助溶剂和
底物浓度相同的条件下#改变有机溶剂量来配制不
同的底物添加体系#结果如表 & 所示( 由表 & 可知#
较低和较高比例的有机溶剂都不利于转化( 如果
溶剂量太少#底物溶解性差&溶剂量多则对生物催
6&"第 # 期 范林萍等"改进底物添加体系制备氢化可的松
化剂的毒性加大#均达不到较理想的转化效果( 本
实验所考察的 5_HHL-!%,有机溶剂,4].底物添加
体系#在有机溶剂为 &#$ 丙二醇和丙三醇)配制比
例均为 &ll&时#有相对较高的目标产物产率#分别
达$6g% o&g0%f和$6!g% o$g!%f( 从工业应用角
度出发#考察目标产物和副产物的产率#且考虑丙三
醇比 &#$ 丙二醇价格便宜#选定>$5_HHL-!%%l>$丙
三醇%l;$4].% n&ll&组合为合理的底物添加体系(
图 B?处理方式对底物添加体积系转化的影响
Q.;=B?#70:F127I0F-2G1724F405F./; F-013J1F45F02/10^30/F.56J.2:2/A041.2/
表 D?有机溶剂配制比例对协同转化的影响
E5J60D?#70:F127F-0G.7040/F45F.2127EN00/H>CY126A0/FYX!*2/F-0J.2:2/A041.2/
有机溶剂 >$5_HHL-!%%l
>$有机溶剂%l;$4].% ;$4].%,f ;$4]%,f ;$S*%,f ;$副产物%,f
&#$ 丙二醇 &l&l%g( g( o$g& &g( o%g6 #6g( og( $6g( o0g7
&#$ 丙二醇 &l&g(l& &g% o%g% %g( o%g6 6&g( o0g7 $6g% o0g$
&#$ 丙二醇 &ll& $g% o&g0 % 6g% o&g0 $(g% o$g!
&#$ 丙二醇 &l0l& $g% o%g% % 6$g( o%g6 $(g( o%g6
丙三醇 &l&l& g( o%g6 % 6%g( o%g6 $#g% o%g%
丙三醇 &l&g(l& g% o$g! % 6#g% o%g% $&g% o$g!
丙三醇 &ll& &g% o%g% % 6!g% o$g! $&g% o$g!
丙三醇 &l0l& %g( o%g6 % 66g( o%g6 $$g% o&g0
B=O?底物添加体系对X!*负荷量的考察
""工业生产 S*时 4].底物添加量一般在
%g$(f$乙醇热溶%左右( 张金红等*#+报道丙二醇
转化体系可使底物质量浓度提高到0g! X,N( 本实
验也采用 >$乙醇%l;$4].% n$(l&底物体系为对
照#考察底物添加体系 >$5_HHL-!% % l>$丙三
醇%l;$4].% n&ll&对转化的影响#结果如表 $
所示(
""由表 $ 可知"在 5_HHL-!%,丙三醇转化体系中#
4].添加量在( X,N时#&%0 <内#底物仍能基本定量
转化#产率达 ##f&而对照组 4].添加量在 X,N
时#转化时间长达&#! <#仍有大部分的 4].和 4]
未转化为S*#且副产物多( 可见#随着4].添加量
的增加#因5_HHL-!%,丙三醇,4].体系所含丙三醇
量相对较低#与乙醇,4].构成的转化体系相比#对
生物催化剂的毒性影响相对较低( 因为 5_HHL-!%,
丙三醇,4].转化体系中非离子型表面活性剂
5_HHL-!% 有助于改进亲脂性底物 4].生理水相的
溶解性能&丙三醇这种多羟基化合物使活性菌丝细
胞*
&&
%
羟化酶分子活性结构催化性能更趋专一稳
定#有助于底物负荷量的提高#这就使转化产物 S*
积累量提高(
!& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
表 B?X!*添加量对转化体系的影响
E5J60B?#70:F127F-05I23/F2713J1F45F05GG0G2/F-0J.2:2/A041.2/
溶剂
"
$底物%,$X!N?&% 7,< ;$4].%,f ;$4]%,f ;$S*%,f ;$副产物%,f
5_HHL-!%,丙三醇 $ # &g% o%g% % 60g( o%g6 $0g( o%g6
5_HHL-!%,丙三醇 0# &g( o%g6 % 6g( o%g6 $(g% o%g%
5_HHL-!%,丙三醇 0 6$ g% o&g0 % 6%g( o%g6 $#g( o%g6
5_HHL-!%,丙三醇 0g( !% 0g% o&g0 % 6%g( o%g6 $(g( o%g6
乙醇 ( &%0 (g( o%g6 % ##g% o$g! $!g( o$g&
乙醇 $ 7% 0g% o&g0 $g( o%g6 6g( o%g6 $%g% o&g0
乙醇 $g( &00 (g% o%g% 6g( og( #%g% o%g% $6g( og(
乙醇 &#! &#g( o$g& &g% o&g0 ($g% o$g! &!g( o%g6
B=P?游离协同催化体系在EN00/H>CY丙三醇转化
介质中的多次利用考察
""以首轮添加底物质量浓度为 X,N进行实验#发
现底物在 0 <内基本转化完全#转化液经过滤分离#
菌体再次投入到相同转化体系中进行多轮转化( 本
实验设计了 种方式来考察菌丝体对底物的耐受性#
方式 &指第 &轮至第 轮的投料质量浓度分别为 )$
和& X,N&方式 $ 指第 & 轮至第 0 轮的投料质量浓度
分别为 )&g()&和& X,N&方式 指第 &轮至第 0轮的
投料浓度分别为 )&)&和& X,N#所得结果见图 (
图 O?O 种方式对产率和转化时间的影响
Q.;=O?#70:F127F-400I36F.H43/J.2:2/A041.2/12/F-0K.06G5/GJ.2:2/A041.2/F.I0
""图 结果表明"方式 & 中第 $ 轮不同的底物浓
度对菌丝体的稳定性和对底物的转化时间具有明
显的影响#$ X,N的底物质量浓度使菌丝体在第 轮
转化中菌体开始自溶#转化液渐呈黏稠状*&(+ #出现
混溶#导致催化活性降低#副产物明显增加#S*产
率明显降低#转化时间延长达&$% <#还剩余一定量
的底物4].和中间体4]&方式 $ 和方式 中分别以
&g()& X,N进行投料#均是在菌丝体进入第 0 轮转化
7&"第 # 期 范林萍等"改进底物添加体系制备氢化可的松
时#才呈现副产物明显增加和转化时间明显延长的
现象( 可见#高浓度的甾体底物引入量在一定范围
内仍然限制生物催化介质体系的稳定性及活性*$+ #
以高底物浓度添加底物#显然呈现酶促反应中的底
物抑制效应( 此外#由于 种方式能使相对有效的
投料总质量浓度达到( X,N左右$不累加最后一轮的
投料质量浓度%#推测可能是菌丝静息细胞吸附中
间体4]#作为底物4]的存在#构成该菌丝活细胞在
.饥饿/介质转化底物过程中#继续诱导合成羟化酶
而起作用#延长其催化寿命*&&+ ( 综观 种方式#方
式 $ 投料质量总浓度达(g( X,N#较好地发挥了生物
催化体系的使用效率#可设计择优方案进行克量制
备合成实验(
B=R?协同菌丝体在EN00/H>CY丙三醇转化介质中
的克量制备实验
""用 $g0 中方式 $ 的生物转化模式进行 批次的
摇瓶放大制备实验#产物得率 6n)
A
,$)
@
?)
:
% p
&%%f#式中")
@
为总投料质量#X&)
:
为回收底物质
量#X&)
A
为S*质量#X( 结果如表 所示(
""由表 可知"每批次经产物回收#所得总甾体结
晶物试样质量分别为 0g$)g# 和0g$( X#收率达
7#f以上( 每批次试样经重结晶)柱层析分离#得目
标产物 S*质量分别为 $g&)&g# 和$g$ X#产物得率
分别为 (&g$f)(&g#f和 (g6f#均值 ($f#较国内
现行业内产物收率 0(f高出 (f i6f#所测熔点及
理化常数值均符合药典标准*&#+ (
表 O?协同转化的克量制备实验
E5J60O?S409545F.A0H1:560390V904.I0/F5FF-060A0627;45II05I23/F2/F-0:229045F.A0J.2:2/A041.2/
批次 转化轮次 )
@
,X
)$回收总甾体%,X )
:
,X )
A
,X
6,f 产物熔点,j
& 0g0 0g$ %g $g& (&g$ $&$ i$&0
$ $ g# g(% %g# &g# (&g# $&% i$&0
0g0 0g$( %g $g$ (g6 $%! i$&%
O?结?论
""本文建立的有机相成分构成底物添加介质生
物转化体系#可实用于国内现有 S*生产体系的工
艺改进#结论如下"
""&%&#$ 丙二醇和丙三醇作为有机相成分构成
4].底物添加介质体系#生物催化活性和稳定性较
佳#目标产物 S*积累量高#副产物量降低&氯仿对
4].的溶解度高#但对菌丝体有较强的毒性#导致
单菌双液相转化很快失去活性#但在协同双液相转
化条件下仍保留有 0$g(f的 S*目标产物生成#说
明协同较单菌转化在应对外界恶劣环境有更好的
耐受性和生物催化稳定性(
$%&#$ 丙二醇和丙三醇介质中#单菌新月弯孢
霉对底物4].表现出了较好的水解活性#在相同转
化时间生成S*的结果与单菌蓝色犁头霉转化4].
相当#这有助于与国内现有生产工艺整合(
%4].底物体系经研磨和超声复合处理后#转
化效果明显比单一处理显著#转化时间可缩短
&$ i&! <(
0% 5_HHL-!%,丙三醇,4].配制最佳比例为
&ll&#生物转化产率达$6!g% o$g!%f( 4].添加
总量达( X,N时#协同转化菌丝体于&%0 <内仍能定
量完成4].
$
4]
$
S*的主要反应过程#较常规 0f
乙醇体系添加$ X,N4].负荷量有成倍提高(
(%克量实验制备实验表明"在使用 5_HHL-!%,
丙三醇体系生物转化条件下#4].初始投加质量浓
度高达 X,N#协同菌丝体重复利用 $ i 轮#生成的
目标产物S*收得率平均达 ($f#较国内现行业内
产物收得率 0(f高出 6f(
""总之#本实验研究结果对提高国内薯蓣皂素资
源利用率)促进行业生物制造生产皮质甾体激素
S*的技术进步具有重要意义(
参考文献"
*&+"杨顺楷#易奎星#杨亚力#等3甾体微生物转化 *&&
%
羟基化的
研究进展*W+3生物加工过程#$%%##0$$%"6-&03
U@LX]
%
-
*$+"夏鹏3精细化学品系列丛书"药物*Q+3北京"中国物资出版
社#&77!"(7-#%3
*+"杨顺楷3应用酶学新进展"有机溶剂中的酶*W+3生命科学#
&77$#0$$%"&$-&03
%$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
U@LX]
@AHB@BHGLDHEAFLDCBCFL1FI2HECFDCA@DDCBCFL BFB
LF/#$%%#$ $#%"#!!-6%(3
*#+"张金红#张秀明#陈长治#等3有机相中梨头霉菌催化 && 脱氧
皮质醇转化成氢化可的松的研究*W+3南开大学学报"自然科
学版#&77!#&$0%"&&-&03
R<@LXWCL
TLCMHE1CB@BC18@La@CHL1C1#&77!#&$0%"&&-&03
*6+"*EG;.#YHEL@LDH1=#*@:E@/WQ]#HB@/3[
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*!+"Q@LF1EFCW#]EC2@/@aCB=#Q@LF1EFC.3`CFBE@L1IFEJ@BCFL FIAJ@DCLFLH@AHB@BHBFDH/J@DCLFLH@AHB@BH:KIEHH@LD CJJF:C/C;HD
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&!%(*W+3ZL;KJHQCAEF: 5HA
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*&%+ 易奎星#杨亚力#杨顺楷#等3静息细胞连续两批次生物催化生
产氢化可的松*W+3生物加工过程#$%%(#$0%"0%-003
UC)GCbCLX#U@LXU@/C#U@LX]
%
-
)`QY-#00*W+3=ECa/` CFa
化可的松*W+3生物加工过程#$%%7#6$#%"&(-$%3
Y@L NCL2CLX#U@LX]
0!&*W+3*
应的影响*W+3微生物学通报#$%%&#$!$#%"#!-6&3
U@LX)GC#NCPC@F^CLX#YHLXPC@#HB@/3ZIHAB1FI1G:1BE@BHDC12HE-
1CFL @LD DC11F/GBCFL FL JCAEF:C@/HL;KJ@BCAAFLMHE1CFL FI1BHECD
*W+3QCAEF:CF/FXK#$%%&#$!$#%"#!-6&3
*&0+ ]@LB<@L@JS)#]
*&(+ Q@B1FL ] N3QHB
*&#+ 国家药典委员会3中国药典"二部*Q+3$%&% 版3北京"化学工
业出版社#$%&%"((%3
&$"第 # 期 范林萍等"改进底物添加体系制备氢化可的松