全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 && 月
生"物"加"工"过"程
*cF/3! 8F3#
8FM3$%&% DFC"&%37#7 ,^3C11L3$ ?#6!3$%&%3%#3%%0 收稿日期"$%&% ?%& ?$& 基金项目"中科院百人计划&四川省青年科技基金资助项目$%!R9%$# ?%$%
作者简介"范林萍$&7!(%#女#四川中江人#硕士#研究方向"应用微生物学&杨顺楷$联系人%#研究员#Z-J@C/"K@LX1aeAC:3@A3AL
改进底物添加体系制备氢化可的松
范林萍&#杨顺楷$#吴中柳$#杨亚力$#李小刚&$&g兰州大学 生命科学学院#兰州 6%%%%& $3中国科学院 成都生物研究所#成都 #&%%0&% 摘"要"在蓝色梨头霉和新月弯孢霉协同转化制备氢化可的松$S*%过程中#常规的底物热溶液体系由 &6
$羟基 孕甾 0 烯 #$% 二酮 $& 醋酸酯$4].%和乙醇组成#其中)$4].%l>$乙醇% n&l$(&改进后的底物溶液体系由 5_HHL-!%)丙三醇)4].和磷酸盐缓冲溶液$ =` ]%组成#其中 >$5_HHL-!%%l>$丙三醇%l)$4].%l>$ =` ]% n
&ll&l$(( 4].质量浓度从$ X,N起#累加到( X,N#4].全部被转化#且产物氢化可的松$S*%产率与常规低浓度投 料相当&在4].质量浓度 X,N时添加底物#协同菌丝体能重复利用达 次#S*产率稳定在 6%f左右&经 批次实 验室摇瓶放大制备实验#产物S*平均收率为 ($f#重现性较好#工艺操作稳定( 5_HHL-!%,丙三醇,4].,=`]底物
体系较常规4].,乙醇构成的底物添加体系#可显著提高S*生产收率#有工业应用价值(
关键词"蓝色犁头霉&新月弯孢霉&转化&氢化可的松
中图分类号"590#6g!""""文献标志码".""""文章编号"$?#6!$$%&%%%# ?%%&( ?%6
8.2F45/1724I5F.2/X!*F2 -KG42:24F.12/0".I942A0I0/F275GG./; 13J1F45F0
Y.8NCL-2CLX
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$&3]A**J1F45:F"5?$=` ]% n&ll&l$(% IFE@DDCBCFL FIBDGEHFIB7##J@aCLXBKCH/D FIS*#AFJ2@EHD _CB< B?$HB<@LF/% n&l$(%35JKAH/C@JHDC@AFG/D :HEH2H@BHD/KG1HD BCJH1_CB< B1A@/HHb2HECJHLB@BBJFDHFI@DDCBCFL 1G:1BE@BHCL BM0K N24G1"@9-%# +(,&/$,#&"/&?/$#&# $/2#7#&:CFAFLMHE1CFL&""氢化可的松$S*%是糖皮质甾体激素药物和高 端皮质甾体药物的合成中间体#其生产采用国内数 十年来依托薯蓣皂素建立起来的半合成工艺路线( 虽然该化学合成工艺水平与国外相差不大#但是霉 菌氧化发酵工艺则是其中的薄弱环节&后者主要采 用本土丝状真菌蓝色犁头霉的发酵转化工艺#以$g( X,N&6
$羟基孕甾 0 烯 #$% 二酮 $& 醋 酸酯$4].%为底物#含体积分数 0g(f的乙醇#能与
发酵生理水构成混溶的生物转化反应混合物为体
系#S*收率维持在 0(f左右*&+ # 而国内S*总收率
单项指标为 &7f#这与国际先进水平 $6f的差距 较大*$+ (
""鉴于丝状真菌甾体生物转化制 S*的羟化酶为
胞内诱导酶系#亲脂性甾体底物分子须透过细胞
壁)细胞膜等结构才能与以细胞色素=0(% 为代表的
*
&&
%
羟化酶膜反应器进行转化反应*+ &且甾体底
物在生理水相中的溶解度低#因此限制了自4].到
S*发酵生产时间,体积效率的提高及改进&此外#
蓝色犁头霉菌氧化发酵过程中存在甾体.破坏酶/
裂解甾环的副反应*0+ #是长期影响 S*产率提高的
因素之一(
""为了解决工业生物催化剂及生物加工过程中
酶的高活性)高稳定性及高选择性问题#YHEL@LDHE1
等*(+曾提出选择合适的有机溶剂构成与水混溶的
单液相或双液相体系以有效地提高底物浓度#从而
增高产物产率&张金红等*#+的研究表明在犁头霉菌
催化4].的反应中#利用 &$g(f丙二醇为转化介质 体系#可使底物质量浓度由$g! X,N提高到0g( X,N(
中国科学院成都生物研究所生物催化与分子进化
在蓝色犁头霉和新月弯孢霉组成的协同菌丝体转
化4].制 S*的研究中#发现协同转化能有效地降
低单菌转化过程中产生的副产物#从而提高产率(
然而#底物浓度限制效应仍然存在( 本文以协同转
化为基础#从文献*6 ?7+报道的多种有机溶剂中筛
选出合适的有机溶剂#构成相应的有机溶剂,底物
添加体系#并探讨 5_HHL-!%)底物体系的处理方式
和底物负荷量等因素对生物转化 4].制 S*反应
过程的影响(
D?材料与方法
D=D?菌种
""蓝色犁头霉$@9-%# +(,&/$,#%.] g#(#新月弯
孢霉$"/&?/$#&# $/2#7#%.] g0!&#均购自中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心$*VQ**%(
D=B?试剂及药品
""4].和S*由湖北制药厂及山东新华制药公司
提供( 文中所涉及其他试剂及相关药品均为市购
分析纯(
D=O?培养基
""文中所用培养基按文献*!+配制(
D=P?方法
&303&"生物催化剂的制备
""游离菌丝体的制备"蓝色犁头霉和新月弯孢霉
斜面用无菌水制成孢子悬浮液#分别接入装有
(% JN液 体 培 养 基 的 $(% JN锥 形 瓶#$! j)
&!% E,JCL摇瓶生长培养# <后#以体积分数 (f转
接接入第二级锥形瓶培养( 蓝色犁头霉在相同条
件下培养$0 <#新月弯孢霉在相同条件下培养&! <# 菌丝过滤#分别收获蓝色犁头霉菌丝体 & 和新月弯 孢霉菌丝体$(
&303$"有机溶剂的选择 ""单菌转化"将湿质量 i( X的菌丝体 & 或$ 分
别投入到由氯仿)二氯甲烷)&#$丙二醇)丙三醇) 四氢呋喃)正庚烷)乙醇)甲醇共 ! 种有机溶剂溶解 的含有$ X,N底物 4].的 =` ] 磷酸盐缓冲液中混
合#$! j)$%% E,JCL转化 # i0! <(
""协同转化"在上述有机相介质中#菌丝体 & 先转
化约&% <后#添加菌丝体 $再转化$# i! <#条件
不变(
&303"放大制备实验
""0 只& N锥形瓶#装液量$%% JN#投料质量浓度 X,N( 反应结束后#集中 0 瓶反应液#$ 倍体积乙
酸乙酯萃取#萃取液置旋转蒸发仪浓缩#试样结晶)
柱层析#得目标产物#烘干至恒质量#称质量)计算
得率(
D=R?分析方法
""利用 5N*法和 S=N*法#按文献*&%+中方法
进行(
B?结果与讨论
B=D?有机溶剂对生物转化的影响
""构建有机溶剂生物转化反应体系的关键是有
机溶剂的选择*&+ ( 不同的有机溶剂对底物和产物
的溶解度及生物催化剂的活性和稳定性都有不同
程度的影响( 为了选择较优的有机溶剂#本研究
以乙醇为对照#考察常用于甾体生物转化的有机
溶剂对单菌转化和协同转化 4].制 S*的影响
$溶剂的比例以有机溶剂体积,总转化液体积进行 配制%#结果见图 &( 由图 & 可知"与常规溶剂乙醇 相比#蓝色犁头霉单菌转化时仅&#$ 丙二醇对产
率有所提高#这与文献*#+报道的相符&对于新月
弯孢霉#溶剂 &#$丙二醇和丙三醇显著提高了产 率#且在此溶剂体系中#常被认为脱乙酰活性弱的 #& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷" 新月弯孢霉表现出较强的将 4].水解为脱氧皮质 酮$4]%的能力#产物积累量和蓝色犁头霉单独转
化4].时水平相当( 这表明该有机溶剂添加底物
的转化介质有利于新月弯孢霉菌丝体酶法水解
4].为 4]#并继而转化为产物 S*#这很有利于同
国内现有工艺整合#但与文献*&&+报道有别( 对
于协同转化#使产率有明显提高的溶剂仍然是
&#$丙二醇和丙三醇&对底物有较大溶解度的氯 仿和二氯甲烷#在单菌转化中能明显抑制转化反 应体系的活性#因此未能在转化液中检测到产物 的生成&而在两菌构成的协同转化中#可进一步提 高催化剂的活性和稳定性#检测到 S*的产率分别 达 0$g(f和 00f#这表明氯仿和二氯甲烷与水相
构成的双液相协同转化体系较单菌转化在该系统
维持转化稳定性方面具有明显的优势#与文献
*&$+报道相符( &#f氯仿&$&(f二氯甲烷&&%f&#$丙二醇&0&%f丙三醇&(#f四氢呋喃&#$%f正庚烷&6(f乙醇&!f甲醇
图 D?有机溶剂对生物转化的影响
Q.;=D?#70:F12724;5/.:126A0/F12/J.2F45/1724I5F.2/
""以丙三醇为溶剂的转化体系中#产物量较 &#$丙二醇条件下低#但生成的副产物也偏少( 因此在 工业生产中#如底物不能定量转化#在转化过程达 动态平衡时#宁可中止转化反应#回收剩余底物#阻 止生成副产物是可取的( 为了选择更合理的底物 添加体系#继续对$ 种有机溶剂的相关参数作进一
步实验考察(
B=B?转化体系的再优化选择
""目前用于生物转化的有机溶剂转化体系#一般
不是将有机溶剂直接与水相$缓冲液或发酵液%混 合#而是在溶有一定量的底物后#再添加到反应液 中呈微结晶颗粒态进行转化( 上述选择的 &#$ 丙
二醇和丙三醇#有别于乙醇通过加热就能很好溶解
底物#此处须将底物 4].在溶剂中制成均匀悬浮
物#即借助5_HHL-!% 表面活性剂的作用#在研磨条
件下制成混悬浮液添加底物*&+ (
""以 $g& 中优选出的&#$ 丙二醇和丙三醇为有
机溶剂#分别与底物 4].混合#并加入一定量的
5_HHL-!% 助溶#然后加入 =` ] 稀释#构成底物,助溶
剂,有机溶剂,=`]的4].$0% JX,JN%投料体系#这 就显著减少了有机溶剂的使用量#降低对生物催化 剂的毒性#细胞及酶的活性得到保护#可有效提高 生物催化体系的操作稳定性#催化时间缩短了 &! i$0 <#有利于提高生产效率(
$3$3&"底物前处理方式对协同转化的影响
""采用研磨法)超声波法)研磨超声复合法#分别
对5_HHL-!%,有机溶剂,4].以体积质量比 &l&l&进
行处理#结果如图 $所示( 由图$ 可知"经过研磨超
声复合处理制备的底物添加体系#转化产率相对较
高( 这可能是投料底物微结晶颗粒较单一的研磨
法)超声波法处理后更微细化#以至于能更充分地
与生物催化体系触发反应#生成的羟化产物因为甾
体分子疏水性降低#而易于扩散进入菌丝胞外水
相#转化时间较单一处理缩短 &$i&! <#生物转化 更趋完全($g$g$"有机溶剂配制比例对转化的影响
""]@LB<@L@J等*&0+报道转化体系中有机溶剂所占
比例对转化有着显著的影响( 本实验在助溶剂和
底物浓度相同的条件下#改变有机溶剂量来配制不
同的底物添加体系#结果如表 & 所示( 由表 & 可知#
较低和较高比例的有机溶剂都不利于转化( 如果
溶剂量太少#底物溶解性差&溶剂量多则对生物催
6&"第 # 期 范林萍等"改进底物添加体系制备氢化可的松
化剂的毒性加大#均达不到较理想的转化效果( 本
实验所考察的 5_HHL-!%,有机溶剂,4].底物添加
体系#在有机溶剂为 &#$丙二醇和丙三醇)配制比 例均为 &ll&时#有相对较高的目标产物产率#分别 达$6g% o&g0%f和$6!g% o$g!%f( 从工业应用角
度出发#考察目标产物和副产物的产率#且考虑丙三
醇比 &#$丙二醇价格便宜#选定>$5_HHL-!%%l>$丙 三醇%l;$4].% n&ll&组合为合理的底物添加体系(
图 B?处理方式对底物添加体积系转化的影响
Q.;=B?#70:F127I0F-2G1724F405F./; F-013J1F45F02/10^30/F.56J.2:2/A041.2/
表 D?有机溶剂配制比例对协同转化的影响
E5J60D?#70:F127F-0G.7040/F45F.2127EN00/H>CY126A0/FYX!*2/F-0J.2:2/A041.2/
有机溶剂 >$5_HHL-!%%l >$有机溶剂%l;$4].% ;$4].%,f ;$4]%,f ;$S*%,f ;$副产物%,f &#$ 丙二醇 &l&l%g( g( o$g& &g( o%g6 #6g( og($6g( o0g7
&#$丙二醇 &l&g(l& &g% o%g% %g( o%g6 6&g( o0g7$6g% o0g$&#$ 丙二醇 &ll& $g% o&g0 % 6g% o&g0$(g% o$g! &#$ 丙二醇 &l0l& $g% o%g% % 6$g( o%g6 $(g( o%g6 丙三醇 &l&l& g( o%g6 % 6%g( o%g6$#g% o%g%
丙三醇 &l&g(l& g% o$g! % 6#g% o%g%$&g% o$g! 丙三醇 &ll& &g% o%g% % 6!g% o$g! $&g% o$g!
丙三醇 &l0l& %g( o%g6 % 66g( o%g6 $$g% o&g0 B=O?底物添加体系对X!*负荷量的考察 ""工业生产 S*时 4].底物添加量一般在 %g$(f$乙醇热溶%左右( 张金红等*#+报道丙二醇 转化体系可使底物质量浓度提高到0g! X,N( 本实 验也采用 >$乙醇%l;$4].% n$(l&底物体系为对 照#考察底物添加体系 >$5_HHL-!% % l>$丙三 醇%l;$4].% n&ll&对转化的影响#结果如表 $ 所示( ""由表 $ 可知"在 5_HHL-!%,丙三醇转化体系中# 4].添加量在( X,N时#&%0 <内#底物仍能基本定量 转化#产率达 ##f&而对照组 4].添加量在 X,N 时#转化时间长达&#! <#仍有大部分的 4].和 4] 未转化为S*#且副产物多( 可见#随着4].添加量 的增加#因5_HHL-!%,丙三醇,4].体系所含丙三醇 量相对较低#与乙醇,4].构成的转化体系相比#对 生物催化剂的毒性影响相对较低( 因为 5_HHL-!%, 丙三醇,4].转化体系中非离子型表面活性剂 5_HHL-!% 有助于改进亲脂性底物 4].生理水相的 溶解性能&丙三醇这种多羟基化合物使活性菌丝细 胞* && % 羟化酶分子活性结构催化性能更趋专一稳 定#有助于底物负荷量的提高#这就使转化产物 S* 积累量提高( !& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷" 表 B?X!*添加量对转化体系的影响 E5J60B?#70:F127F-05I23/F2713J1F45F05GG0G2/F-0J.2:2/A041.2/ 溶剂 " $底物%,$X!N?&% 7,< ;$4].%,f ;$4]%,f ;$S*%,f ;$副产物%,f 5_HHL-!%,丙三醇 $ # &g% o%g% % 60g( o%g6 $0g( o%g6 5_HHL-!%,丙三醇 0# &g( o%g6 % 6g( o%g6 $(g% o%g% 5_HHL-!%,丙三醇 0 6$ g% o&g0 % 6%g( o%g6 $#g( o%g6 5_HHL-!%,丙三醇 0g( !% 0g% o&g0 % 6%g( o%g6 $(g( o%g6 乙醇 ( &%0 (g( o%g6 % ##g% o$g! $!g( o$g& 乙醇 $ 7% 0g% o&g0 $g( o%g6 6g( o%g6 $%g% o&g0 乙醇 $g( &00 (g% o%g% 6g( og( #%g% o%g% $6g( og( 乙醇 &#! &#g( o$g& &g% o&g0 ($g% o$g! &!g( o%g6 B=P?游离协同催化体系在EN00/H>CY丙三醇转化 介质中的多次利用考察 ""以首轮添加底物质量浓度为 X,N进行实验#发 现底物在 0 <内基本转化完全#转化液经过滤分离# 菌体再次投入到相同转化体系中进行多轮转化( 本 实验设计了 种方式来考察菌丝体对底物的耐受性# 方式 &指第 &轮至第 轮的投料质量浓度分别为 )$ 和& X,N&方式 $ 指第 & 轮至第 0 轮的投料质量浓度 分别为 )&g()&和& X,N&方式 指第 &轮至第 0轮的 投料浓度分别为 )&)&和& X,N#所得结果见图 ( 图 O?O 种方式对产率和转化时间的影响 Q.;=O?#70:F127F-400I36F.H43/J.2:2/A041.2/12/F-0K.06G5/GJ.2:2/A041.2/F.I0 ""图 结果表明"方式 & 中第 $ 轮不同的底物浓 度对菌丝体的稳定性和对底物的转化时间具有明 显的影响#$ X,N的底物质量浓度使菌丝体在第 轮 转化中菌体开始自溶#转化液渐呈黏稠状*&(+ #出现 混溶#导致催化活性降低#副产物明显增加#S*产 率明显降低#转化时间延长达&$% <#还剩余一定量 的底物4].和中间体4]&方式 $ 和方式 中分别以 &g()& X,N进行投料#均是在菌丝体进入第 0 轮转化 7&"第 # 期 范林萍等"改进底物添加体系制备氢化可的松 时#才呈现副产物明显增加和转化时间明显延长的 现象( 可见#高浓度的甾体底物引入量在一定范围 内仍然限制生物催化介质体系的稳定性及活性*$+ # 以高底物浓度添加底物#显然呈现酶促反应中的底 物抑制效应( 此外#由于 种方式能使相对有效的 投料总质量浓度达到( X,N左右$不累加最后一轮的 投料质量浓度%#推测可能是菌丝静息细胞吸附中 间体4]#作为底物4]的存在#构成该菌丝活细胞在 .饥饿/介质转化底物过程中#继续诱导合成羟化酶 而起作用#延长其催化寿命*&&+ ( 综观 种方式#方 式 $ 投料质量总浓度达(g( X,N#较好地发挥了生物 催化体系的使用效率#可设计择优方案进行克量制 备合成实验( B=R?协同菌丝体在EN00/H>CY丙三醇转化介质中 的克量制备实验 ""用 $g0 中方式 $ 的生物转化模式进行 批次的 摇瓶放大制备实验#产物得率 6n) A ,$) @ ?) : % p &%%f#式中") @ 为总投料质量#X&) : 为回收底物质 量#X&) A 为S*质量#X( 结果如表 所示( ""由表 可知"每批次经产物回收#所得总甾体结 晶物试样质量分别为 0g$)g# 和0g$( X#收率达 7#f以上( 每批次试样经重结晶)柱层析分离#得目 标产物 S*质量分别为 $g&)&g# 和$g$ X#产物得率 分别为 (&g$f)(&g#f和 (g6f#均值 ($f#较国内 现行业内产物收率 0(f高出 (f i6f#所测熔点及 理化常数值均符合药典标准*&#+ ( 表 O?协同转化的克量制备实验 E5J60O?S409545F.A0H1:560390V904.I0/F5FF-060A0627;45II05I23/F2/F-0:229045F.A0J.2:2/A041.2/ 批次 转化轮次 ) @ ,X )$回收总甾体%,X ) : ,X ) A ,X 6,f 产物熔点,j & 0g0 0g$ %g $g& (&g$ $&$ i$&0 $ $ g# g(% %g# &g# (&g# $&% i$&0 0g0 0g$( %g $g$ (g6 $%! i$&% O?结?论 ""本文建立的有机相成分构成底物添加介质生 物转化体系#可实用于国内现有 S*生产体系的工 艺改进#结论如下" ""&%&#$ 丙二醇和丙三醇作为有机相成分构成 4].底物添加介质体系#生物催化活性和稳定性较 佳#目标产物 S*积累量高#副产物量降低&氯仿对 4].的溶解度高#但对菌丝体有较强的毒性#导致 单菌双液相转化很快失去活性#但在协同双液相转 化条件下仍保留有 0$g(f的 S*目标产物生成#说 明协同较单菌转化在应对外界恶劣环境有更好的 耐受性和生物催化稳定性( $%&#$ 丙二醇和丙三醇介质中#单菌新月弯孢 霉对底物4].表现出了较好的水解活性#在相同转 化时间生成S*的结果与单菌蓝色犁头霉转化4]. 相当#这有助于与国内现有生产工艺整合( %4].底物体系经研磨和超声复合处理后#转 化效果明显比单一处理显著#转化时间可缩短 &$ i&! <( 0% 5_HHL-!%,丙三醇,4].配制最佳比例为 &ll&#生物转化产率达$6!g% o$g!%f( 4].添加 总量达( X,N时#协同转化菌丝体于&%0 <内仍能定 量完成4]. $ 4] $ S*的主要反应过程#较常规 0f 乙醇体系添加$ X,N4].负荷量有成倍提高( (%克量实验制备实验表明"在使用 5_HHL-!%, 丙三醇体系生物转化条件下#4].初始投加质量浓 度高达 X,N#协同菌丝体重复利用 $ i 轮#生成的 目标产物S*收得率平均达 ($f#较国内现行业内 产物收得率 0(f高出 6f( ""总之#本实验研究结果对提高国内薯蓣皂素资 源利用率)促进行业生物制造生产皮质甾体激素 S*的技术进步具有重要意义( 参考文献" *&+"杨顺楷#易奎星#杨亚力#等3甾体微生物转化 *&& % 羟基化的 研究进展*W+3生物加工过程#$%%##0$$ %"6-&03
U@LX]*&&
%
-W` CF2EFAZLX#$%%##0$$%"6-&03 *$+"夏鹏3精细化学品系列丛书"药物*Q+3北京"中国物资出版
社#&77!"(7-#%3
*+"杨顺楷3应用酶学新进展"有机溶剂中的酶*W+3生命科学#
&77$#0$$%"&$-&03
%$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
U@LX]B*0+"QFXC/qLCB1aCVQ#)F1AEF:CF/FXCA@/BE@L1IFEJ@BCFL FIEHCA<1BHCLq11G:1B@LAH] @LD CB1$&-
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LF/#$%%#$ $#%"#!!-6%(3 *#+"张金红#张秀明#陈长治#等3有机相中梨头霉菌催化 && 脱氧 皮质醇转化成氢化可的松的研究*W+3南开大学学报"自然科 学版#&77!#&$0%"&&-&03
R<@LXWCLAFLMHE1CFL FI&&-DHFbKAFEBHbF/FLHCLBF(&+4%-CL @L FEX@LCA1F/MHLB*W+3.AB@]ACHLBC@EGJ8@BGE@/CGJ
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*&%+ 易奎星#杨亚力#杨顺楷#等3静息细胞连续两批次生物催化生
产氢化可的松*W+3生物加工过程#$%%(#$0%"0%-003
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