全 文 ：第 ３６ 卷第 １４ 期
２０１６年 ７月
生 态 学 报
ＡＣＴＡ ＥＣＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ
Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．１４
Ｊｕｌ．，２０１６
ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ．ｅｃｏｌｏｇｉｃａ．ｃｎ
基金项目：国家自然科学基金项目（４０９０１２８１）；北京市教育委员会科技计划面上项目（ＫＭ２０１３１００２８０１２）
收稿日期：２０１４⁃１２⁃１８； 　 　 修订日期：２０１５⁃０６⁃１５
∗通讯作者 Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ．Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｘｉａｏｙｕｃｎｕ＠ １２６．ｃｏｍ
ＤＯＩ： １０．５８４６ ／ ｓｔｘｂ２０１４１２１８２５１６
张琼琼， 黄兴如， 郭逍宇．基于 Ｔ⁃ＲＦＬＰ 技术的不同水位梯度植物根际细菌群落多样性特征分析．生态学报，２０１６，３６（１４）：４５１８⁃４５３０．
Ｚｈａｎｇ Ｑ Ｑ， Ｈｕａｎｇ Ｘ Ｒ， Ｇｕｏ Ｘ Ｙ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｔｅｒ ｌｅｖｅｌ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ
Ｔ⁃ＲＦＬＰ．Ａｃｔａ Ｅｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ，２０１６，３６（１４）：４５１８⁃４５３０．
基于 Ｔ⁃ＲＦＬＰ技术的不同水位梯度植物根际细菌群落
多样性特征分析
张琼琼， 黄兴如， 郭逍宇∗
首都师范大学资源环境与旅游学院， 北京　 １０００４８
摘要：为了解水位梯度控制下不同湿地植物根际细菌群落多样性，以北京市奥林匹克公园植物氧化塘人工湿地为例，采用末端
限制性片段长度多态性（Ｔ⁃ＲＦＬＰ）技术结合 ＡＮＯＶＡ分析，比较了水位梯度控制下三棱草、芦苇、香蒲、睡莲 ４种植物根际细菌群
落的多样性。 研究结果显示：随着水位梯度加深，根际细菌群落多样性呈现减少趋势， ＨｈａⅠ、ＭｓｐⅠ、ＲｓａⅠ ３种不同酶切所得
结果一致，且综合 ３种酶切的 ＰＡＴ比对中 ＲＦｓ组合数量随水位梯度加深也呈相应变化趋势。 进一步分析发现，随水位梯度加
深植物根际可培养细菌 ＲＦｓ数量变化较显著。 不同水位梯度下各植物根际细菌群落中差异显著的菌群为 Ｂｅｔａ变形杆菌纲，水
位梯度加深可能导致不同生态型植物根际泌氧能力降低，进而影响植物根际好氧细菌生存，从而出现三棱草根际属水平菌群丰
富度最高，其次为芦苇、香蒲，最少为睡莲。 各植物根际细菌群落的优势属多数为变形杆菌门，是脱氮除磷的功能性菌门，其中
产碱杆菌属和黄杆菌属为四种植物根际细菌的共同优势属，在碳氮循环中起重要作用。
关键词：水位梯度；湿地植物；细菌多样性；Ｔ⁃ＲＦＬＰ
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｔｅｒ ｌｅｖｅｌ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｔ⁃ＲＦＬＰ
ＺＨＡＮＧ Ｑｉｏｎｇｑｉｏｎｇ， ＨＵＡＮＧ Ｘｉｎｇｒｕ， ＧＵＯ Ｘｉａｏｙｕ∗
Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｏｕｒｉｓｍ， Ｃａｐｉｔａｌ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４８， Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｔｅｒ ｌｅｖｅｌ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ， ｗｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｏｌｙｍｐｉｃ Ｐａｒｋ ｐｌａｎｔ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｐｏｎｄ， ａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｗｅｔｌａｎｄ． Ｔｈｅ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｒｅｘ
ｐｈａｃｏｔａ ｓｐｒ．， Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ， Ｔｙｐｈａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ， ａｎｄ Ｎｙｍｐｈａｅａ ｔｅｔｒａｇｏｎａ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｔｅｒ ｌｅｖｅｌｓ
ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ （Ｔ⁃ＲＦＬＰ） ａｎａｌｙｓｉｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
ｖａｒｉａｎｃｅ （ＡＮＯＶＡ）． Ｏｕｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｗａｔｅｒ ｌｅｖｅｌｓ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ， ｉ．ｅ．， ＨｈａＩ， ＭｓｐＩ， ａｎｄ ＲｓａＩ， ｙｉｅｌｄｅｄ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ． Ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ｔｈｅｓｅ ｔｈｒｅｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ， ＲＦ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ｆｒｏｍ ＰＡＴ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｓｏ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｗａｔｅｒ ｌｅｖｅｌｓ，
ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ． Ｆｕｒｔｈｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＲＦ ｎｕｍｂｅｒｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ
ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｈａｎｇｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｌｅｖｅｌ； ｉｎ ｃｏｎｔｒａｓｔ， ｔｈｅ ＲＦ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ
ｂａｃｔｅｒｉａ ｄｉｄ ｎｏｔ ｃｈａｎｇｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ． Ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｔｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ， β⁃Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｐｌａｎｔｓ， ｐｏｓｓｉｂｌｙ ｂｅｃａｕｓｅ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｌｅｖｅｌ ｍａｙ ｈａｖｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｐｌａｎｔｓ ｔｏ ｓｅｃｒｅｔｅ ｏｘｙｇｅｎ， ｔｈｅｒｅｂｙ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｔｈｅ ｔｒｉａｎｇｕｌａｒ ｈａｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ
ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅｒａ， ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｒｅｅｄｓ， ｃａｔｔａｉｌｓ， ａｎｄ ｆｉｎａｌｌｙ ｗａｔｅｒ ｌｉｌｉｅｓ． Ｔｈｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｅｒｏｂｉｃ
ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ．ｅｃｏｌｏｇｉｃａ．ｃｎ
ｂａｃｔｅｒｉａ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．， Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．， Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．， Ｄｅｌｆｔｉａ ｓｐ．， Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．， Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｌｌｕｍ ｓｐ．，
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｐ．， ａｎｄ Ｐｅｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ｗｅｒｅ ｐｒｏｂａｂｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｒｏｏｔｓ ｔｏ ｓｅｃｒｅｔｅ ｏｘｙｇｅｎ． Ｍｏｒｅｏｖｅｒ， ｔｈｅ
ｏｘｙｇｅｎ⁃ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｓ ａｎｄ ｒｏｏｔ ｅｘｕｄａｔｅｓ ｖａｒｉｅｄ ｂｅｃａｕｓｅ ｗｅｔｌａｎｄ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｔｅｒ ｌｅｖｅｌ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ
ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ， ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ
ｍｏｓｔ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｆｏｕｒ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ， ｗｈｉｃｈ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ
ｔｈｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ． Ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｇｅｎｅｒａ ａｍｏｎｇ ｔｈｅｓｅ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ａｎｄ Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ， ｗｈｉｃｈ ｐｌａｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｃａｒｂｏｎ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｃｙｃｌｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｗｅｔｌａｎｄ ｗａｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ： ｗａｔｅｒ ｌｅｖｅｌ ｇｒａｄｉｅｎｔ； ｗｅｔｌａｎｄ ｐｌａｎｔ； ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ； Ｔ⁃ＲＦＬＰ
湿地是自然环境中自净能力最强的生态系统之一［１］，可利用基质⁃植物⁃微生物复合生态系统的物理、化
学、生物三重协同作用，通过过滤、沉淀、吸附、离子交换、植物吸收和微生物分解等多种途径实现对污水的高
效净化［２］。 湿地植物在污水净化过程中扮演着重要角色。 植物可以直接吸收利用水体中的氮磷等富营养化
元素，进而通过植物收割使其从湿地去除。 但通过植物吸收同化的去除量仅是一少部分，Ｏｏｓｔｒｏｍ等认为仅有
１３％的氮是通过基质的过滤和植物吸收作用被去除［３］。 栖息于湿地植物根际的多种微生物是水体中污染物
主要降解者，原因是根际是植物、微生物和基质共同作用最直接、最强烈的区域［４］，且植物根分泌物、通气条
件及凋落物的分解过程会影响植物根际微生物群落结构特性进而影响系统的净化效能［５⁃６］。 细菌在根环境
中对各种根分泌物利用率和敏感性远远超过真菌、放线菌及藻类等，在根际微生物活动中较活跃且占主导地
位，并能与根际联合生存、定殖及保持在根部［７］。
水位是影响湿地生态过程的关键因素［８］。 水位梯度变化是影响湿地植物空间异质分布的主导因子［９］，
湿地水位梯度变异影响植物氧气的供给，从而于湿地近岸带依次形成湿生植物、挺水植物、浮叶植物等生态型
的植物分布格局。 基于水位梯度变异的氧气供给调节导致不同类型的湿地植物生物地化循环中好氧和厌氧
过程的相互影响。 高水位促进反硝化［１０］、甲烷生成［１１］等厌氧过程的速率，同时降低硝化作用等好氧过程的
速率［１２］。
基于末端限制性片段长度多态性技术（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｔ⁃ＲＦＬＰ）
可以定性和定量的进行微生物群落结构分析及不同群落结构间的比较［１３］，它是建立在 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基础上，其
数据输出形式在测序过程中直接数字化完成对大量信息的快速分析，前期限制性内切酶选择是影响分析结果
的关键因素［１４］，选择内切酶应考虑其消化后产生单峰具有特异性及可测定范围内末端片段长度（Ｔ⁃ＲＦｓ）的数
量［１５］。 在样品群落多样性超过 １００种时，使用单酶切可能只识别 ５０％的群落，适宜选择 ２—４种限制性内切
酶进行多重酶切，可检测 ５０％—７０％的群落丰富度表达［１６］。 研究表明，分析细菌 １６Ｓ ｒＤＮＡ 多态性时，ＭｓｐⅠ
最易得到可分辨的单一片段，ＨｈａⅠ和 ＲｓａⅠ可产生数量最多的 Ｔ⁃ＲＦｓ［１７］。 ＨｈａⅠ、ＭｓｐⅠ、ＲｓａⅠ 三种四碱基
限制性内切酶的酶切位点分别为 ＧＣＧ′Ｃ、Ｃ′ＣＧＧ、ＧＴ′ＡＣ，综合包括了 ＡＴ 和 ＧＣ 位点，且酶切位点特异性高，
可提高 １６Ｓ ｒＤＮＡ片段中的酶切频率、丰富酶切片段［１８⁃１９］。 由于双酶切不一定比单酶切产生更多 Ｔ⁃ＲＦｓ，甚至
可能少于单酶切，因此综合 ３种酶切在各自反应体系中进行分别酶切，提高操作分类单元的精确有效性［２０］。
近年来，已有学者尝试借用统计学方法在海量数据中挖掘数据的内在规律方面的优势对 Ｔ⁃ＲＦＬＰ 分析中
酶切片段进行分析。 储昭瑞等采用 Ｔ⁃ＲＦＬＰ 技术，选取合适的 ＨｈａⅠ和 ＲｓａⅠ限制性内切酶，使得不同厌氧氨
氧化细菌对应不同 Ｔ⁃ＲＦｓ，进而完成对厌氧氨氧化细菌群落组成的快速分析［２１］。 黄艺等借助加权平均回归方
法根据滇池流域 ３８个样品产生的 １１０个 Ｔ⁃ＲＦｓ片段对各环境因子的生态适宜性将其划分为对环境干扰的敏
感片段、中间片段和耐受片段，进而成功地对滇池流域浮游生物的完整性进行评价［２２］。 Ｄｉｎｇ Ｔ 等采用
Ａｖｅｒａｇｅ Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｐｅｒ Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ （ＡＰＥ）和部分主成分分析（ｐＣＣＡ）的方法对不同物种、不同季节、不同环境条
件下植物叶内生细菌群落所产生的 Ｔ⁃ＲＦｓ片段进行差异性分析，表明物种变异是影响 Ｔ⁃ＲＦｓ片段变异的主要
因素，其次是生长季节和生长环境［２３］。
９１５４　 １４期 　 　 　 张琼琼　 等：基于 Ｔ⁃ＲＦＬＰ 技术的不同水位梯度植物根际细菌群落多样性特征分析 　
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本文利用 Ｔ⁃ＲＦＬＰ 技术结合 ＨｈａⅠ、ＭｓｐⅠ、ＲｓａⅠ综合酶切结果的多样性指数、片段类型、片段丰度和基
于 ＭｉＣＡ的 ＰＡＴ比对分析比较不同水位梯度下湿地近岸带优势植物即湿生植物三棱草（Ｃａｒｅｘ ｐｈａｃｏｔａ Ｓｐｒ．）、
挺水植物芦苇（Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）和香蒲（Ｔｙｐｈａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、浮叶植物睡莲（Ｎｙｍｐｈａｅａ ｔｅｔｒａｇｏｎａ）的根际细
菌群落结构多样性差异，并尝试借助方差分析检验基于水位梯度变异的不同植物根际细菌群落属特征差异，
探讨同一水域不同水位梯度条件下植物根际细菌群落间变异关系及细菌群落与宿主植物根际微环境间响应
关系。 研究结果预期在多元统计分析与 Ｔ⁃ＲＦＬＰ 相结合的微生物生态学问题分析中进行有益尝试，并预期揭
示基于水位梯度湿地植物根际细菌群落多样性变异特征，对构建高效的湿地净化系统及改善和维护生态平衡
提供科学参考。
１　 研究区概况
奥林匹克公园南园湿地位于奥林匹克公园内，地处北京市区北部。 该区属暖温带半干旱半湿润大陆性季
风气候。 多年平均气温 １１—１２ ℃，极端最高气温 ４１．６ ℃，极端最低气温－２１．２ ℃；多年平均水面蒸发量在
１２００ ｍｍ左右；多年平均降雨量约 ６００ ｍｍ，年内分配不均，多集中在汛期 ６—９月，约占全年的 ８５％。 奥林匹
克公园以清河、北小河再生水处理厂的出水为补水水源，并循环利用，且补水入湖前流经南园湿地以改善水
质。 作为奥林匹克南园湿地的子系统之一，植物氧化塘水位梯度约 １—２ ｍ 之间，兼具好氧塘和厌氧塘的优
点，塘内各个部分均分布有大量水生植物，主要包括三棱草、芦苇、香蒲、睡莲等，集中分布于湿地近岸带 ０—
１０ ｍ处，并形成较为明显的近岸带植被分布格局。 植被覆盖度较高，可达 ７０％—９０％。 通过植物的净化作用
出水水质可以达到地表Ⅲ类水水质标准（ＧＢ３８３８—２００２）。
２　 材料与方法
２．１　 样品采集及 ＤＮＡ提取
２０１２年 ６月 １４日分别从奥林匹克公园南园湿地植物氧化塘基于塘中心到近岸带设置东、南、西、北四条
样带，并在样带上依据不同水位梯度下优势物种采集湿生植物三棱草（０—１ｃｍ水深）、挺水植物芦苇（约 １０ｃｍ
水深）和香蒲（约 １５ｃｍ水深）、浮叶植物睡莲（约 １００ｃｍ 水深）根际土壤样品，新鲜表面附着基质的各植物根
际样品装入消菌的三角瓶密封，立即带回实验室处理分析。 将三棱草、芦苇、香蒲、睡莲各根际新鲜泥土通过
真空抽滤泵过滤去除水分，滤膜上即留有植物根际微生物样品，随后将根际样品冷冻储藏于－２０ ℃备用。 采
用土壤样品提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）提取根际样品总 ＤＮＡ，操作步骤按照使用说明书进行。
提取总 ＤＮＡ经 ０．８％（ｍ ／ ｖ）琼脂糖凝胶电泳检测鉴定，提取的 ＤＮＡ放置于－２０ ℃条件下保存、备用。
２．２　 １６Ｓ ｒＤＮＡ的 ＰＣＲ扩增
本实验的细菌引物选用正向引物 ５′端带荧光物质 ＦＡＭ 标记的 ２７ｆ （ ６⁃ＦＡＭ⁃ ５′⁃ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣ
ＴＧＧＣＴＣＡＧ⁃３′）和反向引物 １４９２ｒ（５′⁃ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧ ＡＣＴＴ ⁃３′）对根际样品进行 １６Ｓ ｒＤＮＡ基因进行扩
增。 ＰＣＲ反应体系成分（５０ μＬ）包含 ２５ μＬ ２×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，２ μＬ正反向引物，４ μＬ根际土壤总 ＤＮＡ，
１７ μＬ ｄｄＨ２Ｏ。 ＰＣＲ反应条件：９５ ℃预变性 ５ ｍｉｎ；３０个循环的常规 ＰＣＲ（９５ ℃变性 ５０ ｓ，５５ ℃退火 ５０ ｓ，７２
℃引物延伸 １ ｍｉｎ）；７２ ℃延伸 ７ ｍｉｎ；４ ℃保存。 荧光 ＰＣＲ产物采用 １．０％的琼脂糖凝胶检测。
２．３　 末端限制性片段长度多态性（Ｔ⁃ＲＦＬＰ）分析
采用限制性内切酶 ＨｈａⅠ、ＭｓｐⅠ、ＲｓａⅠ分别对 ＰＣＲ产物进行酶切，酶切体系成分（２０ μＬ）包含：１ μＬ内
切酶，２ μＬ １０×ｂｕｆｆｅｒ，１０ μＬ ＰＣＲ产物，７ μＬ ｄｄＨ２Ｏ。 将体系混匀后，置于恒温培养箱 ３７ ℃反应 ４ ｈ。 然后，在
６５ ℃条件下水浴 １５ ｍｉｎ使限制性内切酶失活，终止消化反应。 之后将消化产物经 ＡＢＩ测序仪扫描检测，得到
Ｔ⁃ＲＦＬＰ 图谱。
２．４　 数据处理与统计分析
依据 Ｔ⁃ＲＦＬＰ 图谱文件（选择末端限制性片段（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｔ⁃ＲＦｓ）在 ５０—６６０ ｂｐ 范围内
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ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ．ｅｃｏｌｏｇｉｃａ．ｃｎ
且荧光强度超过 １００ Ｕ的峰［２４］）运用 Ｐｅａｋ Ｓｃａｎｎｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ１．０软件进行分析，将其分析结果输入 Ｔ⁃ＲＥＸ程
序（ｈｔｔｐ： ／ ／ ｔｒｅｘ．ｂｉｏｈｐｃ．ｏｒｇ ／ ）进行处理，输出 Ｔ⁃ＲＦｓ类型及相对丰度的组成矩阵，将每个 Ｔ⁃ＲＦ所占的百分比作
为权重输入 Ｐｒｉｍｅｒ ５． ０ 软件进行等级多元聚类分析及非度量多维标度分析 （ ｎｏｎ⁃ｍｅｔｒｉｃ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ
ｓｃａｌｉｎｇ，ＭＤＳ）。 基因多样性指数分析即利用 Ｍａｒｇａｌｅ 指数（Ｓ）评价物种丰富度，均匀度指数（Ｊ ′）计算均匀度，
Ｓｈａｎｎｏｎ⁃ｗｅａｖｅｒ指数（Ｈ ′）评价细菌群落综合多样性。
基于 ＨｈａⅠ、ＭｓｐⅠ、ＲｓａⅠ三种限制性内切酶消化的 Ｔ⁃ＲＦｓ 类型及相对丰度组成矩阵，依据 ＭｉＣＡ３
（ｈｔｔｐ： ／ ／ ｍｉｃａ． ｉｂｅｓｔ． ｕｉｄａｈｏ． ｅｄｕ ／ ） 数据库，利用 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ （ ＰＡＴ） 程序 （ ｈｔｔｐｓ： ／ ／ ｓｅｃｕｒｅ．
ｌｉｍｎｏｌｏｇｙ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ ／ ｔｒｆｌｐ ／ ｎｅｗｕｓｅｒ．ｊｓｐ）比对分析细菌菌群系统发育关系。 依据比对结果构建基于属水平的 ０、１
数据矩阵（将特定样品中出现的属定义为 １，未出现的属定义为 ０），从而构建了样品数×ＲＦｓ 数（１６×４６４６）的
矩阵和样品数×属数的 １６×１９９ 的原始 ０、１ 数据矩阵。 在数据矩阵的基础上，方差分析采用 ＳＰＳＳ １６．０ 中的
ＡＮＯＶＡ方法（所有统计学显著水平指数 Ｐ＜０．０５）。
２．５　 水质检测
于 ２０１２年夏（６月 ６日、１５日、２３日）对奥体公园植物氧化塘进出口主要水质指标进行常规检测，氨态氮
（ＮＨ＋４ ⁃Ｎ）、硝态氮（ＮＯ
－
３ ⁃Ｎ）由离子色谱仪（ＩＣＳ⁃ １５００、ＩＣＳ⁃ ９０，Ｄｉｏｎｅｘ，ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）测定，水体化学需氧量
（ＣＯＤ）、总磷（ＴＰ）采用国标法测定， ＴＮ采用 Ｎ ／ Ｃ 分析仪测定（Ｍｕｌｔｉ Ｎ ／ Ｃ， Ａｎａｌｙｔｉｋ－ｊｅｎａ， Ｇｅｒｍａｎｙ），ｐＨ、氧
化还原电位（ＯＲＰ）、溶解氧（ＤＯ）采用水质仪（Ｈｙｄｒｏｌａｂ Ｄａｔａｓｏｎｄｅ５、５Ｘ，Ｈａｃｈ，ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）在采样现场
测定。
３　 结果与分析
３．１　 基于水位梯度的植物根际细菌群落分类和排序
基于 ＨｈａⅠ、ＭｓｐⅠ、ＲｓａⅠ三种酶切的 Ｔ⁃ＲＦＬＰ 图谱分类排序结果见图 １和图 ２。 聚类分析能反应样品间
微生物群落结构的相似度。 从图 １可以看出，基于相似性系数为 ５０％—５５％对 ３ 种酶切结果分群并类，各酶
切结果均表现为湿生植物三棱草根际细菌群落、挺水植物芦苇根际细菌群落、挺水植物香蒲根际细菌群落和
浮叶植物睡莲根际细菌群落四大类。 其次，随不同生态型植物立地水位梯度加深，其根际细菌群落相似性降
低。 不同酶切具有相同的结论，表明基于 Ｔ⁃ＲＦＬＰ 的酶切分型效果具有稳定性。
基于 ３种酶切的 ＭＤＳ排序图的压力系数均在正常范围内，即配合度适宜。 从图可以看出随着水位梯度
的变化各生态型植物根际群落细菌结构具有独立的分布范围。 其次，不同生态型植物根际细菌群落分布格局
及其范围表现出差异性，具体表现为三棱草因其适应干湿交替的水环境波动幅度较大的立地条件而具较宽生
态幅度，在排序图上具较广分布格局和范围；芦苇和香蒲在挺水界面范围内分布较为集中，在排序图上具较为
相似的分布格局和范围；睡莲因其对水位深度要求较为严格使其在排序图上表现为较窄的生态幅度和分布格
局。 基于排序的分析结果与分类结果具一致性。
３．２　 基于水位梯度的植物根际细菌群落多样性分析
３．２．１　 基于单一酶切的多样性分析
依据上述聚类结果，计算不同聚类菌群中 Ｔ⁃ＲＦｓ的平均丰度。 在此基础上定义 Ｔ⁃ＲＦ片段丰度值＞４％的
类型为优势菌群，片段丰度值＜１％的类型为偶见菌群，其余为非优势菌群［２５］。 采用多样性指数、片段数和片
段丰度 ３种指标描述基于水位梯度的植物根际细菌群落多样性变异（表 １），并对其分析结果进行差异显著性
检验。 从表中多样性指数变化趋势可以看出，随水位梯度加深各植物根际细菌群落物种丰富度指数、均匀度
指数、多样性指均呈递减趋势。 结合不同菌群片段数和片段丰度和可知睡莲根际细菌群落不仅具有最丰富优
势菌群片段数和最高优势菌群丰度和，而且具有最低的偶见菌群片段数和最低偶见菌群丰度和，二者综合作
用使得睡莲根际细菌群落具最低均匀度指数。 三棱草根际细菌群落因其具最低优势菌群片段数和较高偶见
菌群片段数使其具最高群落均匀度指数。 不同酶切类型相比较，ＭｓｐⅠ较其它两种酶切类型对基于水位梯度
１２５４　 １４期 　 　 　 张琼琼　 等：基于 Ｔ⁃ＲＦＬＰ 技术的不同水位梯度植物根际细菌群落多样性特征分析 　
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图 １　 基于 Ｔ⁃ＲＦＬＰ图谱的植物样品根际细菌群落结构的聚类分析
Ｆｉｇ．１　 Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｔ⁃ＲＦＬＰ ｐａｔｔｅｒｎｓ
图 ２　 植物根际细菌群落结构的ＭＤＳ分析
Ｆｉｇ．２　 ＭＤＳ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
的多样性变化更为敏感；不同多样性表征参数相比较，多样性指数较片段数及片段丰度和对基于水位梯度的
多样性变化更为敏感；不同多样性指数相比较，对基于水位梯度多样性变化的敏感程度依次为物种丰富度指
数、均匀度指数和综合多样性指数的减小趋势。
２２５４ 　 生　 态　 学　 报　 　 　 ３６卷　
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表 １　 ＨｈａⅠ、ＭｓｐⅠ、ＲｓａⅠ三种单一酶切的植物根际细菌群落多样性分析
Ｔａｂｌｅ １　 Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＨｈａⅠ、ＭｓｐⅠａｎｄ ＲｓａⅠｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
群落组成
Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
内切酶
Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ
三棱草
Ｃａｒｅｘ ｓｐ．
芦苇
Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ ｓｐ．
香蒲
Ｔｙｐｈａ ｓｐ．
睡莲
Ｎｙｍｐｈａｅａ ｓｐ．
Ｔ⁃ＲＦ类型数 非优势菌群 ＨｈａＩ ５．５０±１．２０ａｂ ４．５０±０．５３ａ ６．５０±０．５３ｂ ８．３０±０．８９ｃ
Ｔ⁃ＲＦ ｔｙｐｅ ｎｕｍｂｅｒ Ｎｏｔ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ＭｓｐＩ ６．００±１．３１ａ ５．５０±１．１９ａ ６．００±１．３１ａ ６．７５±０．８９ａ
ＲｓａＩ ４．５０±０．５３ａ ６．７５±１．３９ｂ ４．７５±１．５８ａ ７．００±０．７６ｂ
优势菌群 ＨｈａＩ １７．００±２．９３ａ ２７．７５±１．５８ｂ １５．００±２．３９ａ １５．２５±２．７６ａ
Ｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ＭｓｐＩ １７．００±３．２９ｂ ２８．７５±３．３３ｄ ２３．２５±３．０６ｃ １０．００±１．６９ａ
ＲｓａＩ １３．２５±４．６２ａ １７．７５±２．５５ａ １５．５０±４．４４ａ １２．５０±２．２０ａ
偶见菌群 ＨｈａＩ ２４．２５±１３．８２ａ ２０．５０±９．８７ａ １６．５０±５．０４ａ ９．５０±１．２ａ
Ｒａｒｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ＭｓｐＩ １９．７５±１２．１７ｂ ２６．５０±４．１７ｂ １．００±１．８５ａ １．２５±１．３８ａ
ＲｓａＩ ８．２５±４．０３ｂ １．２５±１．３８ａ ９．７５±４．２３ｂ １．２５±１．３８ａ
相对丰度 ／ ％ 优势菌群 ＨｈａＩ ５０．７４±１３．６ｂ ３２．０６±５．１９ａ ６０．４±８．９６ｂ ５８．９８±７．０６ｂ
Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ＭｓｐＩ ５６．０８±４．５５ｂ ３０．３１±７．２８ａ ７０．３１±２３．２ｂｃ ７７．５２±５．５２ｃ
ＲｓａＩ ６８．０９±８．９６ａ ７２．０３±１２ａ ６４．２０±６．４５ａ ７３．５７±６．４６ａ
非优势菌群 ＨｈａＩ ３７．０８±６．３６ａ ６０．７２±６．８３ｂ ３１．１６±６．８６ａ ３１．１４±４．８１ａ
ＭｓｐＩ ３０．７５±６．８１ａ ５１．８４±７．７５ｂ ４２．４３±７．９２ｂ ２７．０９±５．６１ａ
ＲｓａＩ ２５．０５±９．４７ａ ２８．３０±９．８８ａ ２９．４９±１０．３４ａ ２９．９４±２．９９ａ
偶见菌群 ＨｈａＩ ９．９６±２．３６ａ １０．４１±４．３５ｂ ９．１５±２．８９ａ ５．３５±０．７４ａ
ＭｓｐＩ １３．１４±７．９２ｂ １７．６９±１．４１ｂ １．６５±１．９２ａ １．２７±１．０３ａ
ＲｓａＩ ７．１１±４．４２ｂ １．６０±１．１７ａ ５．１８±０．７１ａｂ ２．５０±０．２５ａ
多样性指数 Ｍａｒｇａｌｅ 指数 ＨｈａＩ １１．００±３．８３ａ １０．７１±２．５３ａ ６．０３±１．９３ｂ ３．３４±３．８１ｃ
Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ Ｍａｒｇａｌｅ ｉｎｄｅｘ ＭｓｐＩ ８．０４±３．０６ｂ １２．２３±０．６９ｃ ４．７１±３．０５ａｂ １．８９±１．７５ａ
ＲｓａＩ ６．６６±１．４８ａ ２．９０±１．７２ｂ ７．３１±２．５９ａ １．９９±２．４９ｃ
均匀度指数 Ｅｖｅｎｅｓｓ ｉｎｄｅｘ ＨｈａＩ ０．９１±０．０２ａ ０．８５±０．０９ａ ０．７６±０．０６ｂ ０．７８±０．１４ｂ
ＭｓｐＩ ０．８９±０．０２ａ ０．８２±０．０４ａ ０．６５±０．０７ｂ ０．４５±０．０７ｃ
ＲｓａＩ ０．７８±０．０３ａ ０．５７±０．１０ｂ ０．５３±０．１３ｂ ０．５４±０．０９ｂ
Ｓｈａｎｎｏｎ⁃Ｗｅａｖｅｒ 指数 ＨｈａＩ ３．３４±０．３５ａ ３．１９±０．５７ａ ２．８５±０．３９ａ ２．７０±０．５３ａ
Ｓｈａｎｎｏｎ⁃ｗｅａｖｅｒ ｉｎｄｅｘ ＭｓｐＩ ２．９４±０．３７ａｂ ３．５９±０．２０ｂ ２．５０±０．６４ａ ２．１８±０．２９ａ
ＲｓａＩ ２．５３±０．３２ａ ２．４３±０．２１ａ １．５４±０．２５ｂ １．０１±０．７７ｂ
　 平均值±标准差；不同字母表示处理间差异显著性（Ｐ＜０．０５）
３．２．２　 基于多酶切综合比对的多样性分析
为进一步检验分析基于水位梯度的植物根际细菌群落多样性的变异规律，以样品数×ＲＦｓ 数（１６×４６４６）
数据矩阵为原始数据得到各植物根际可培养细菌与非培养细菌的酶切组合 ＲＦｓ结果（表 ２）。 从表中 ＲＦｓ 组
合数在不同 ＲＦｓ组成类型和水位梯度控制下的不同植物类型条件下具显著差异，其中基于 ３ 种酶切的 ＰＡＴ
比对 ＲＦｓ组合数量随水位梯度变异呈显著的变化趋势，即近岸带的湿生植物根际细菌 ＲＦｓ 丰富度最高，由挺
水植物向浮叶植物过度过程中植物根际细菌 ＲＦｓ 丰富度呈减少趋势。 依据可培养和非培养对 ３ 种酶切的
ＰＡＴ比对 ＲＦｓ组合进行菌种划分，采用 ＡＮＯＶＡ分析可以看出基于水位梯度变化的植物根际细菌群落多样性
变化主要是由植物根际可培养细菌 ＲＦｓ片段数的差异引起（Ｐ＜０．０５）；其次基于 Ｔ⁃ＲＦＬＰ 分析中可培养 ＲＦｓ片
段数占到总细菌 ＲＦｓ片段数量 ４％—１０％，符合可培养细菌种类低于细菌总量 １％—１０％的研究结果，进一步
证明了基于 Ｔ⁃ＲＦＬＰ 方法本试验结果的可靠性。 基于多酶切综合多样性分析结果可客观的反应基于水位梯
度变异的湿地植物根际细菌群落结构变化规律。
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表 ２　 基于水位梯度植物根际细菌 ＲＦｓ组合数量
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ＲＦｓ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｗａｔｅｒ ｌｅｖｅｌ ｇｒａｄｉｅｎｔ
基于 ＲＦｓ组合的 ＰＡＴ比对
Ｂａｓｅｄ ｏｎ ＲＦｓ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＡＴ
湿生植物
Ｈｙｇｒｏｐｈｙｔｅ
挺水植物
Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ｍａｃｒｏｐｈｙｔｅｓ
浮叶植物
Ｌｅａｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈｙｔｅ
三棱草
Ｃａｒｅｘ ｓｐ．
芦苇
Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ ｓｐ．
香蒲
Ｔｙｐｈａ ｓｐ．
睡莲
Ｎｙｍｐｈａｅａ ｓｐ．
综合种的数量
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｌ ｓｐｅｃｉｅｓ １９７０．５０±７３７．７９ｂ １３６９．００±６５２．４０ａｂ １７０８．２５±１５０．２５ｂ ７５０．２５±１６３．５２ａ
可培养种的数量
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅｌ ｓｐｅｃｉｅｓ ２４８．２５±９４．００ｃ １０３．７５±１５．５４ｂｃ １６９．２５±２４．６９ａｂ ４４．７５±２１．６４ａ
非培养种的数量
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｕｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ ｓｐｅｃｉｅｓ １７２２．２５±６４８．６９ｂ １２１５．２５±５４６．９１ａｂ １５３９．００±１４０．２６ｂ ７０５．５０±１７２．５６ａ
属的数量 Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｇｅｎｕｓ ９７．７５±１５．８５ｂ ９０．００±３９．２９ｂ ７２．５０±１１．４７ｂ ３２．００±３．３８ａ
门的数量 Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｈｙｌｕｍ １０．００±２．７２ｂ ８．７５±０．８８ａｂ ７．５０±１．９２ａｂ ５．５０±１．７７ａ
３．３　 基于水位梯度变异的植物根际细菌群落组成特征分析
３．３．１　 基于水位梯度变异的湿地植物根际菌群差异分析
（１）基于门水平的植物根际菌群差异分析
为进一步分析基于门水平的不同水位梯度下的植物根际细菌群落多样性变异特征，以样品数×属数（１６×
１９９）矩阵和样品数×ＲＦｓ数（１６×４６４６）数据矩阵为原始数据，采用 ＡＮＯＶＡ 分析对基于属数的门水平的细菌
丰富度进行差异检验。 属的结果表明 Ｂｅｔａ、Ａｌｐｈａ、Ｇａｍｍａ 变形杆菌纲（β、α、γ⁃Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）在不同水位梯度
条件下由岸边向塘中心呈递减趋势（Ｐ＜０．０１），其余门类不具有统计学意义的变异特征。 ＲＦｓ 数的结果表明
Ｂｅｔａ变形杆菌纲（β⁃Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）在不同水位梯度条件下由岸边向塘中心呈现相应减少趋势（Ｐ＜０．０１），其余
门类不具有统计学意义的变异特征。 基于 ＲＦｓ数的门水平的细菌丰富度的差异检验与属数的分析结果具有
部分相似的变化趋势，但后者分辨率低于前者。 β⁃Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ 细菌丰富度较其余门类差异性极显著，包括
多种好氧或兼性细菌。
图 ３　 不同水位梯度下基于属数（ａ）和 ＲＦｓ数（ｂ）的门水平的植物根际细菌群落多样性条形图
Ｆｉｇ．３　 Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｔｅｒ ｌｅｖｅｌ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ ｎｕｍｂｅｒｓ （ ａ） ａｎｄ ＲＦｓ
ｎｕｍｂｅｒｓ （ｂ）
▲▲和●●分别为图 ａ和图 ｂ中不同水位梯度下基于门水平的同一菌群在不同植物根际细菌群落结构中的极显著差异（０．０１）分布
４２５４ 　 生　 态　 学　 报　 　 　 ３６卷　
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（２） 基于属水平的植物根际菌群差异分析
基于 ＲＦｓ片段数的属水平的菌群丰富度进行差异检验，结果表明不同水位梯度条件下 Ｂｅｔａ 变形菌纲
（β⁃Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）中具有显著差异的属为产碱杆菌属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（Ｐ＜０．０１）、伯克氏菌属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）（Ｐ＜
０．０１）、无色杆菌属 （ Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ） （ Ｐ ＜ ０． ０１ ）、戴尔福特菌属 （ Ｄｅｌｆｔｉａ ） （ Ｐ ＝ ０． ０４３ ）、紫色杆菌属
（Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（Ｐ＜０．０１）、草螺菌属（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｌｌｕｍ）（Ｐ ＝ ０．０２７）、罗尔斯通氏菌属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ） （Ｐ＜０．０１）、
Ｐｅｌｏｍｏｎａｓ（Ｐ＝ ０．０１９），且显著差异的属数随水位梯度增加呈减少趋势，其余门类中不具显著差异属。
图 ４　 不同水位梯度下植物根际细菌群落中 Ｂｅｔａ变形杆菌纲的菌属多样性条形图
Ｆｉｇ．４　 Ｂａｒ ｇｒａｐｈ ｓｈｏｗｉｎｇ β⁃Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｗａｔｅｒ ｌｅｖｅｌ ｇｒａｄｉｅｎｔ
▲▲和▲分别为不同水位梯度下基于属水平的同一菌群在不同植物根际细菌群落结构中的极显著差异（０．０１）分布和显著差异（０．０５）分布
３．３．２　 基于优势属的植物根际细菌菌群组成特征分析
依据 ＨｈａⅠ、ＭｓｐⅠ、ＲｓａⅠ三种酶切优势片段，以 Ｔ⁃ＲＦ片段丰度＞４％的类型为优势菌群，筛选出不同水位
梯度下的植物根际细菌菌群中优势菌属（表 ３）。 从表中看出，不同水位梯度下各植物根际细菌优势属呈现数
量差异，其中近岸带湿生植物三棱草根际细菌优势属数量少为 ３ 种，低于深水位其余植物根际细菌优势属数
量，芦苇根际细菌优势属数量最多，同时各植物根际细菌优势属呈现类型差异，产碱杆菌属和黄杆菌属
（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）为 ４种植物根际细菌群落的共有优势属，伯克氏菌属为除睡莲之外 ３种植物根际细菌菌群的
优势属，而节杆菌属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）为除 ３棱草之外 ３种植物根际细菌菌群的优势属。 由于环境因素或植物根
系差异导致了芦苇和睡莲根际细菌菌群中红长命菌属（Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ）和 二氧化碳嗜纤维菌属（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）
等特有属的出现。
表 ３　 不同水位梯度下植物根际细菌群落可能优势属
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｇｅｎｅｒａ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｗａｔｅｒ ｌｅｖｅｌ ｇｒａｄｉｅｎｔ
ＯＵＴ类型 ＯＴＵ ｔｙｐｅｓ （ｂｐ）
ＨｈａＩ ＭｓｐＩ ＲｓａＩ
可能的属
Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｇｅｎｕｓ
三棱草
Ｃａｒｅｘ ｓｐ．
芦苇
Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ ｓｐ．
香蒲
Ｔｙｐｈａ ｓｐ．
睡莲
Ｎｙｍｐｈａｅａ ｓｐ．
６８ ４８７ ４２０ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ． ＋ ＋ ＋ ＋
８７ ８４ ３０４ Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＋ ＋ ＋ ＋
６６ ４２９ ４６８ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＋ ＋ ＋ －
７９ ６６ ４６８ Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． － ＋ ＋ ＋
２０５ １４０ ４６８ Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ ｓｐ． － ＋ － －
８９ ８４ ３０４ Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ． － － － ＋
　 　 ＋优势属；－未出现
３．４　 基于水位梯度的植物根际细菌群落与水质状况的响应关系
水生态系统的水质与微生物群落结构之间存在某种联系，微生物对外部环境变化非常敏感，在一定程度
５２５４　 １４期 　 　 　 张琼琼　 等：基于 Ｔ⁃ＲＦＬＰ 技术的不同水位梯度植物根际细菌群落多样性特征分析 　
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上反应水环境状况［２６］。 本研究区的水质参数统计特征见表 ４。 各水质样点的均值代表该研究区水体理化环
境。 将植物氧化塘各指标均值与进水水质均值相比，可看出人工湿地的 ＮＨ＋４ ⁃Ｎ、ＴＮ、ＴＰ 均显著低于进水水
质，ＮＨ＋４ ⁃Ｎ、ＴＮ值更是低于进水水质的十分之一，且均达到地表水环境质量标准。 对氮、磷污染去除中微生物
发挥重要作用［２７］，不同水位梯度的 ４种植物根际细菌群落优势属为产碱杆菌属、黄杆菌属、伯克氏菌属及节
杆菌属，均为除氮特效菌，部分具有聚磷作用，且不同程度分布于 ４种植物根际，除氮细菌数量较多，说明植物
根际细菌与水质状况具有一定响应关系。
表 ４　 研究区主要水质指标及水环境质量标准
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｗａｔｅｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｒｅｇｉｏｎ
参数
Ｐａｒａｍｅｔｅｒ
再生水源
Ｒｅｃｌａｉｍｅｄ
ｗａｔｅｒ
均值
氧化塘进水
Ｉｎｆｌｏｗ ｏｆ
ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｐｏｎｄ
均值
氧化塘出水
Ｏｕｔｆｌｏｗ ｏｆ
ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｐｏｎｄ
均值
水环境质量标准
ｗａｔｅｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｔａｎｄａｒｄｓ
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
酸碱度 ｐＨ ８．５７８ ７．９１９
氧化还原电位 ＯＲＰ ／ ｍＶ ３４０ ３８０
溶解氧 ＤＯ ／ （ｍｇ ／ Ｌ） ７．５９ ７．６５ ７．５０ ６．００ ５．００ ３．００ ２．００
化学需氧量 ＣＯＤ ／ （ｍｇ ／ Ｌ） ２５．００ １７．４５ １９．７９ １５．００ １５．００ ２０．００ ３０．００ ４０．００
氨态氮 ＮＨ＋４ ⁃Ｎ ／ （ｍｇ ／ Ｌ） ５．００ ０．１３５ ０．１２５ ０．１５ ０．５０ １．００ １．５０ ２．００
硝态氮 ＮＯ－３ ⁃Ｎ ／ （ｍｇ ／ Ｌ） ０．９７３ ０．１５８ ５．００ １０．００ ２０．００ ２３．００ ２５．００
总氮 ＴＮ ／ （ｍｇ ／ Ｌ） ２０．００ ２．５６５ ０．８０８ ０．２０ ０．５０ １．００ １．５０ ２．００
总磷 ＴＰ ／ （ｍｇ ／ Ｌ） ０．５０ ０．０８３ ０．０５６ ０．０２ ０．１０ ０．２０ ０．３０ ０．４０
４　 讨论
４．１　 水位梯度控制下植物根际细菌群落多样性差异分析
本试验采用 Ｔ⁃ＲＦＬＰ 技术结合单一酶切及综合酶切结果分析不同水位深度的 ４ 种典型植物的根际细菌
群落多样性差异，基于 ＡＮＯＶＡ方法检测表明基于水位梯度变化各植物根际细菌群落间多样性差异均具有统
计学意义，试验结果显示，基于单一酶切不同植物间根际细菌群落的物种丰富度指数、均匀度指数及综合多样
性指数均存在一定差异；综合 ３种酶切可见湿生植物三棱草根际细菌群落中菌种数量、属数量及门数量最多，
其次为挺水植物芦苇和香蒲，睡莲所占数量最少。 导致此差异结果的主要因素与水位深度、植物种类、根系泌
氧及根际分泌物等生态因子有关［２８］。
４．１．１　 水位深度对植物根际细菌群落多样性差异影响
水位深度决定了植物生长分布格局［２９］，而不同植物类型的根际微生物多样性会有所不同，本试验中三棱
草、芦苇、香蒲和睡莲根际细菌群落多样性指数、Ｔ⁃ＲＦｓ 数量及相对丰度均存在一定差异。 封晔等通过 Ｔ⁃
ＲＦＬＰ 方法对神木县六道沟流域 ８种植物根际细菌群落多样性的研究结果表明，８ 种植物根际细菌数量和大
小均表现出一定差异［３０］。 赵庆节等采用 ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ 方法对不同植物人工湿地土壤微生物特性研究同样指
出芦苇与香蒲根际土壤微生物多样性存在差异，且芦苇高于香蒲［３１］。 同时水位条件直接影响水中基质氧的
可利用率、气体扩散率［３２］，进而影响植物根系的生长及微生物活性。 随水位深度增加，基质中含氧量减少，降
低了水体及基质中有机污染物降解效率［３３］，导致有机负荷的相对增加带来微生物多样性的减少［３４］，本文 ４
种植物中三棱草根际细菌群落多样性最丰富，可能由于三棱草地处干湿交替的水分环境，人工基质疏松，含氧
量充足，有助于提高植物根际氧气利用率，促进基质中硝化作用与反硝化作用的偶联，加速营养物质分解，减
少基质中有机负荷，增加细菌生长繁殖速率，促使其根际细菌多样性增加。 冯胜等认为细菌群落多样性与水
体营养水平呈负相关性［３５］。 同理可解释随水位深度增加，芦苇、香蒲、睡莲根际细菌多样性在属水平上呈减
少趋势。 武钰坤等对人工湿地芦苇和香蒲根际微生物群落多样性的研究结果表明，芦苇根际微生物具有最多
的常见物种及最大的物种均匀性［３６］。 可见，水位深度变化会通过影响植物类型及饱和基质的含氧量来改变
６２５４ 　 生　 态　 学　 报　 　 　 ３６卷　
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微生物活性［３２］，间接影响湿地植物间根际环境细菌群落多样性。
４．１．２　 水位梯度控制下植物根际微环境对其根际细菌群落多样性差异影响
根际微生物群落结构多样性受宿主植物的影响，可能是由于不同植物类型形成独特的根际微环境，如植
物根际泌氧、分泌物等对细菌具有趋化、富集作用［３７］，会导致不同植物间根际细菌群落种类及数量的变化，使
微生物多样性与宿主植物呈现专一性［３０］。 本文中基于水位梯度植物根际细菌 ＲＦｓ 组合数量，湿生植物三棱
草综合种的数量最多，其次为挺水植物芦苇和香蒲，睡莲最少。 原因是湿地植物具有根系生物量大及通气组
织发达等特点，增加植物根在饱和基质中的输氧能力。 植物根际泌氧在根际还原态介质中形成氧化态的区域
环境［３８］，促使根际形成好氧微生物生存的微氧环境［３９］。 根际泌氧能力与植物根系生物量及通气组织呈正相
关关系［４０⁃４１］，且根际泌氧速率因不同植物种类存在差异，导致植物根际土壤性质发生明显变化［６，４２］，从而形
成根际微生物群落多样性差异。 研究表明，５月份和 ８ 月份芦苇根系生物量增幅均高于香蒲［４３］，且芦苇的泌
氧能力高于香蒲［４４］，同时根茎型湿地植物根系生物量显著高于须根型湿地植物［４５］，由此进一步说明，三棱
草、芦苇（根茎型）根际细菌群落属数量及门数量均高于香蒲、睡莲（须根型）。
基于属水平的植物根际细菌群落间存在一定差异，显著差异属主要包括产碱杆菌属、伯克氏菌属、无色杆
菌属、戴尔福特菌属、紫色杆菌属、草螺菌属、罗尔斯通氏菌属和 Ｐｅｌｏｍｏｎａｓ，其中产碱杆菌属为专性好氧，紫色
杆菌属为兼性好氧，伯克氏菌属、罗尔斯通菌属为好氧，其它均为微好氧［４６］，这些属的分布程度均随水位梯度
加深呈递减趋势，且均与植物根泌氧能力呈正相性。 不同水位梯度下植物根际细菌群落可能优势属产碱杆菌
属、黄杆菌属、伯克氏菌属及节杆菌属均以好氧菌为主，符合人工湿地优势属的分布特征［４７］。
植物根际分泌的有机、无机化合物是刺激根际微生物繁殖的重要能源和养分源［５］，其中脂肪族和芳香族
的碳氢化合物、氨基酸及糖类物质的改变会直接影响根际分泌物的种类和数量，间接影响不同植物根际间微
生物的种类及数量［４８］，且细菌较真菌、放线菌等对植物根际分泌物具更高的敏感性及利用率［７］。 植物根际分
泌物对根际微生物的作用是松散的、非特异性的，主要是促进革兰氏阴性无芽胞杆菌在根际的聚积［４９］，本文
中各植物根际优势属产碱杆菌属和黄杆菌属均为革兰氏阴性无芽胞杆菌［５０］，且随水位梯度加深呈丰富度减
少趋势。 产碱杆菌属可利用不同有机酸和氨基酸作为碳源，伯克氏菌属可氧化分解单糖、双糖、多糖，并可利
用作为唯一碳源。 唐利等利用连续收集装置对芦苇和香蒲根际分泌物比较分析结果表明，香蒲根际微生物数
量多于芦苇［５１］。 不同水位梯度植物根际优势属出现共性及细菌群落相似性特征，这可能与该 ４ 种植物间根
际微环境的相似性，促使其根际细菌群落结构呈现相似性。
４．２　 湿地植物根际细菌群落组成特征与水环境质量的关系
根际微生物的存在是湿地植物进行水体修复的关键［５２］，细菌群落结构与水环境质量呈现协同变化特
征［５３］。 本研究区水体中 ＮＨ＋４ ⁃Ｎ、ＮＯ
－
３ ⁃Ｎ、ＴＮ、ＴＰ 均显著低于进水水质，表明植物氧化塘对氮、磷有明显去除机
制。 氧化还原性质是影响碳氮磷生物地质循环的重要因素，湿地中 Ｃ、Ｎ 的去除在很大程度上受氧化还原电
位的影响，Ｗｉｅｂｎｅｒ等对人工湿地长期运行的结果得出，随着氧化还原电位升高，氨氮浓度降低［５４］。 湿地植物
根际泌氧及分泌物会改变氧化还原电位、ｐＨ值等根际环境，间接决定根际微生物种类和数量［５５］，而且不同的
微生物直接作用于具体的目标污染物。 在本试验中不同水位梯度控制下各植物根际细菌群落中产碱杆菌属、
黄杆菌属、伯克氏菌属及节杆菌属为优势属，其中伯克氏菌属具有较强脱氮能力；节杆菌属也有固氮能力［５６］；
产碱杆菌属具有好氧反硝化的功能，可提高人工湿地中脱氮效率。 黄杆菌属是去除有机物的功能菌，可降解
复杂的高分子量有机物质［５７］，在碳循环中起重要作用。 也有研究表明产碱杆菌属等快生型细菌在有机污染
物的分解代谢中起着十分重要的作用［４７］。 植物根际细菌优势属大多属于 β⁃Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ，其丰富度与低分子
量营养物质有关。 人工湿地污水处理系统是高含氮环境，大量微生物参与氮素物质的转化［５８⁃５９］，不同水位梯
度条件下植物根际细菌群落多样性差异促使不同植物对氮磷去除率的差异。 依据不同水位梯度植物根际功
能性差异属分布特征可知，对 ＴＮ、ＮＨ＋４ ⁃Ｎ、ＣＯＤ 去除率由大到小表现为芦苇＞香蒲＞睡莲，芦苇根际特有的红
长命菌属在光自养条件下亦可固氮；三棱草对 ＮＨ＋４ ⁃Ｎ 具有很好去除率，对 ＴＰ 去除率为香蒲＞芦苇＞睡莲，且
７２５４　 １４期 　 　 　 张琼琼　 等：基于 Ｔ⁃ＲＦＬＰ 技术的不同水位梯度植物根际细菌群落多样性特征分析 　
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对比 ＴＮ、ＴＰ 去除比率为脱氮率大于除磷率，此结果与相关文献表现一致［６０⁃６２］。 因此，本研究中植物根际优势
属的存在可能促进了水体碳、氮、磷等污染物降解，且不同水位梯度下各植物根际细菌群落对污染物的去除率
存在差异性，其去除机制有待进一步深入研究。
５　 结论
本研究采用 Ｔ⁃ＲＦＬＰ 技术分析水位梯度控制下湿地植物根际细菌群落多样性特征，并结合 ＡＮＯＶＡ 解释
了植物间根际细菌群落多样性差异，通过实验结果统计分析得出：（１）文中选取 ＨｈａⅠ、ＭｓｐⅠ、ＲｓａⅠ三种不同
酶切产生结果一致，均为随水位梯度加深各植物生态幅逐渐变窄，根际细菌群落多样性逐渐减少，且基于 ３ 种
酶切的 ＰＡＴ比对 ＲＦｓ组合数量随水位梯度变化呈相应变化趋势，其差异结果主要是由植物根际可培养细菌
ＲＦｓ片段数的变异引起。 （２）不同水位梯度控制下各生态型植物根际的 Ｂｅｔａ 变形杆菌纲中属水平的菌群丰
富度随水位梯度增加而减少，且差异性显著，产碱杆菌属、伯克氏菌属、无色杆菌属、戴尔福特菌属、紫色杆菌
属、草螺菌属、罗尔斯通氏菌属和 Ｐｅｌｏｍｏｎａｓ 均为好氧菌，其丰富度可能与各植物根系泌氧能力密切相关。 湿
生植物泌氧能力最强的三棱草根际属水平的菌群丰富度最高，其次为芦苇、香蒲，最少为睡莲。 （３）水位梯度
控制下四种植物根际细菌群落的多数优势属属于变形杆菌门，是脱氮除磷的功能性菌门，其中产碱杆菌属和
黄杆菌属为四种植物根际细菌共同优势属，在碳氮循环中起重要作用，有助于人工湿地水体净化。
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０３５４ 　 生　 态　 学　 报　 　 　 ３６卷