全 文 ：Feb．2006
·30·
生物加工过程
ChineseJoumalofBi叩mcessEn舀neering
第4卷第1期
2006年2月
木糖异构酶在酿酒酵母表面表达及对木糖
代谢影响的初步研究
侯 进，沈 煜，鲍晓明
(山东大学 微生物技术国家重点实验室，济南250100)
摘 要：利用小型酿酒酵母(妣^ⅡrDrny∞s凹M心妇)表面展示系统的载体，将来源于嗜热细菌z勉珊l蝤舭册Dp^以琳的
木糖异构酶基因戈似，插入到酿酒酵母蔗糖酶信号肽序列与廿凝集素的c端编码序列之间，形成融合表达框，构建
重组质粒pSY-Xy222，转化酿酒酵母H158。含重组质粒的菌株H158．SⅪ木糖异构酶活性测定表明，细胞壁上酶活测
定值为1．53u，木糖异构酶在酿酒酵母细胞壁上得到活性表达。木糖葡萄糖共发酵结果显示，重组菌株木糖利用
率较出发菌株提高了17．8％。
关键词：酵母表面展示；a一凝集素；木糖异构酶；酿酒酵母
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2006)0l一0030—05
E】甲刚ssion碍l嬲eis伽∞均seon＆蛾慨玳硼)，c甜cE陀V豇缸PceUs眦face
锄ditsiIlfluenceon】|日加semetaboHsm
HOUJin，S瑚1NYu，BAOXiao—Ining
(StateK yIJaboracoryofMicmbialTec}lIlolo口，ShandongU血versity，JinaIl250100，C11ina)
Abs蛔ct：ThexyloseisomerELsegen 夥伪f而m觋e丌n凇舭，7礼op危iZ凇wasfused埘t}lt}lesequenceencoding
thea—ag醴utininC-temlinalofA即p肌dthesi驴alpeptideofS．cer∞如i∞invertasecom inedi t}leyeasta—
a耐utininsu如cedisplayVectorpPGAl．nefus dgenewasunderthecontmlofPGKpmrnoter．Theecom—
bin肌tplasrnidwaSt瑚sfo册edintotheyeastainH158by‰l汕iumacetateme山0d．强er co埘IbinaIlt
stminexpfessingthefusionproteinw鹪n舢edH158一SxI．1heXIactivitydetectedoncell州1w鹪40．33U／g
dryweight．GlucoseaIldxyloseco—femlen诅tionbyH158一SⅪconsuH浏4．8∥Lxylose，whichis17．8％higer
山anparentstIainH158．
Keywords：yeastsuIf如edisplay；a-agdutinin；xyloseisomerase； (h∞7mro，n妒豁cer删蠡i伽
随着汽油醇的应用与推广，将大大提升燃料乙
醇的需求，而以粮食为原料生产乙醇的模式也会随
之受到极大的冲击。拓展乙醇生产的底物和提高原
料的转化率，是乙醇生产的必要技术储备。木糖是
木质纤维水解物中含量仅次于葡萄糖的单糖，但目
收稿日期：2005_12—28
基金项目：国家自然科学基金委员会资助项目(№：50273019)
作者简介：侯进(1982．)，女，硕士研究生，研究方向：代谢工程。
联系人：鲍晓明，E一嘶l：b煳@sdu．edu．cn
前生产技术尚不能很好地将木糖转化为乙醇。酿酒酵母(眦r0，彬彤∞删拈泌)是传统的乙
醇发酵生产菌株，由于没有专一性转化木糖为木酮
糖的酶系，不能很好地利用木糖。根据代谢工程原
理，采用加法原则，已将自然界中利用木糖的两条途
万方数据
2006年2月侯进等：木糖异构酶在酿酒酵母表面表达及对木糖代谢影响的初步研究 ·31．
径引入了酿酒酵母并得到活性表达，但工程菌的木
糖利用率并不高，尚不能达到工业生产要求nJ，其中
木糖的跨膜运输被认为是工程菌利用木糖的障碍之
一。酿酒酵母没有专一性木糖转运蛋白，木糖运输
是由非专一性的已糖转运蛋白完成，而此类蛋白对
于木糖的亲和力远低于葡萄糖-2J，H锄acherb3和
MiroslavHo对己糖转运蛋白参与木糖运输的亲和性
进行了研究，结果表明H)(t7p、H)(t5p、№t4p及Gal2p
等运输蛋白对木糖的亲和力相对较高，但
Harnacher。3o及本课题组(结果未报道)的研究结果，
表明超表达一两个此类转运蛋白并不能很好的改善
木糖的运输情况。
细胞表面工程(ceUsu由ceengineering)是近几
年兴起的一种外源基因表达体系，这一表达体系是
通过将目标蛋白基因与天然表面蛋白基因起锚定作
用的结构域编码序列融合，形成融合表达框，同时并
在上游加上信号肽序列(图1)，实现目标蛋白在细
胞表面表达，因此也称为表面展示系统。目前已报
道的酿酒酵母表面展示系统有两类bj，分别以a或
a．凝集素为融合骨架。a．凝集素由A∞1基因编码，
其C．末端320个氨基酸的结构域的功能，是通过与
细胞壁多糖接合锚定在a．型酿酒酵母细胞表面。d．
型酵母表面展示系统是将目标蛋白编码框与d．凝集
素c．末端编码序列融合，实现目标蛋白在酿酒酵母
细胞的表面表达(图2)。
口信号肽序列
囵 目标蛋白编码序列
团 凝集素c一端编码序列
图1融合基因的构建
Fig．1Constnlction《thefusiongen
Protein
图2廿接合型表面展示系统
F唔．2叶type叫由cedisplaysystem
木糖异构酶催化木糖直接转化为木酮糖，不需
要任何辅助因子，是自然界木糖代谢的途径之一。
目前只有z阮肌凇舭舢p矧瑚。60及Rrom雠5印。刊的
木糖异构酶基因戈似在酿酒酵母中得到了活性表
达。本文的思路是将木糖异构酶表达在酿酒酵母细
胞表面，在细胞体外将木糖转化成较易运输并可被
酿酒酵母直接利用的木酮糖，以绕过木糖运输困难
的问题。本实验室已通过Invitmgen的商品质粒
pYDl，以a一接合型表面展示系统实现了嗜热细菌
r．￡船肌o 矧w的木糖异构酶在酿酒酵母的表面表
达旧j，由于此商品化展示系统需半乳糖诱导，同时带
有检测所需的标签序列，不利于在酿酒酵母工业菌
株中进行遗传操作，为便于在工业菌株中应用，本文
利用a．接合型表面展示系统组成型表达木糖异构
酶，以期提高酿酒酵母对木糖的利用。
1材料与方法
1．1菌株和质粒
E．c0矗DH5a(F—re041e，艄1凰勰17l《miJ
s印E44A一抚乒1gy甜96re从1)用于亚克隆。Js．唧．e一
酶i伽H158(J)l烈71a如u2—3拓u2-112啪3-52f伊1 289
觚4—519pr61c扩)用于转化的酵母受体菌株。
质粒pBⅪ用于克隆基因戈似旧J。质粒
pP(A1-1⋯，由日本1baka教授馈赠，o【．接酿酒酵母表
面展示系统载体，用于基因石似在酿酒酵母细胞表
面的展示。
1．2培养基及培养条件
添加50nlg／rIlL氨卞青霉素的LB培养基，37℃
培养用于选择E．co丘转化子。
YNB选择培养基，用于筛选酿酒酵母转化子。
其配方为1．7g／L无氨基酸的酵母基础氮源(yeast
nitrogenbaSe，YNB)、5∥L(NH4)：s04、20∥L葡萄糖，
同时根据质粒的选择标记添加相应的氨基酸混合物
造成选择压力。
1．3分子生物学操作
常规分子生物学操作根据各公司手册进行。酵
母转化采用醋酸锂完整细胞转化法⋯J。PCR引物
合成由英俊生物技术有限公司完成。扩增戈砌基
因的引物如下：
sensePriⅡler：57．ArITllCG6℃CGAA‘rACGAGCCC
AAACCGGAG一37：
antisensePriHler：5’一TTTTAG(；CCZ’cACCCC
CGCACCCCCAG．37。
其中斜体部分分别为鲰工和＆u工酶切位点。
万方数据
万方数据
2006年2月侯进等：木糖异构酶在酿酒酵母表面表达及对木糖代谢影响的初步研究 ·33·
表l细胞不同部分xI酶活、测定结果 达到最大生长量。
Tablel XIactivitesndifrerempartofcells
2．4利用木糖平板生长试验
平板生长试验(图4)结果显示，重组菌株H158．
SxI可以在以木糖为唯一碳源的培养基中良好生
长，而出发菌株H158却几乎没有生长，重组菌株获
得了利用木糖的能力，进一步表明木糖异构酶在酿
酒酵母重组菌株中得到了活性表达。
图4木糖为唯一碳源的平板生长实验
Fig．4Gro叭hontheSCnledi啪contai血ng20∥Lxylose
2．5重组菌株葡萄糖木糖共底物发酵试验
以2％葡萄糖和2．5％木糖为发酵底物，摇瓶限
氧发酵。以DD咖检测生长量，高压液相监测发酵底
物及产物，对发酵进程进行分析。结果表明，出发菌
与重组菌表现出相似的生长曲线(图5)，24h左右
喜萎
蕤
言弓
3结论
一●一H158：一●一H158一sxI
图5不同菌株的生长曲线
Fig．5Gm叭hofdi自feremy aSts mins
代谢产物分析表明(图6)，出发菌株H158几乎
不能利用木糖，将xI表达在细胞表面的重组菌株
H158-SXI木糖利用量为4．8∥L，虽然这一数值较
低，但相对于出发菌株提高了17．8％。木糖利用率
依然较低的主要原因可能为来源于嗜热细菌丁．￡棚矗姚的菇埘虽然能够在酿酒酵母中活性表
达，但是其最适反应温度较高，而在酵母常规培养温
度(30℃)下活性较低。6j，这给重组菌株对木糖的利
用造成一定的障碍。
摹薹
簧
善善
(a)Hl58 (b)Hl58一SXI
一·一ducose；一·一xylose；一▲一ethan01；一。一xylitol；一△一glyceml
图6重组菌株葡萄糖木糖共底物发酵试验
Fig．6co{bHnemationofduc sea11dxylosebytherecorrlbinemstrajns
通过a一展示系统展示XI的重组酿酒酵母在发
酵木糖生产乙醇的过程中木糖利用率虽比出发菌株
有较大提高，但依然较低。形成这一结果的主要原
因可能有二，其一，xI是多亚基蛋白，虽然由于细胞
表面物质一定的流动性或者多个细胞之间的空间距
万方数据
·34· 生物加工过程 第4卷第l期
离很近，蛋白各个亚基在细胞表面相互结合，能够形
成相应的高级结构，并表现出生物活性，但相对于通
常用此体系表达的单亚基蛋白，生物活性的形成相
对困难；其二，来源于嗜热细菌丁．fk，7聊胁i沁的
戈懒虽然能够在酿酒酵母中活性表达，但是其最适
反应温度较高(85℃)，而在常规酵母培养温度(30
℃)下活性较低№J，这又给重组菌株对木糖的利用造
成一定的障碍。
通常认为，表面展示系统仅适合表达单来基蛋
白，但是通过a．凝集素表面展示系统，成功的将四亚
基蛋白xI锚定表达在酿酒酵母细胞壁上，并获得了
活性。通过发酵试验分析，重组菌株的木糖利用率
较出发菌株有较大提高。该系统可使xI组成性表
达，与Invitmgen公司商业化a一接合型表面展示系统
相比，具有不需半乳糖低温诱导，表达量高等优势，
本试验室研究数据也验证了这一点。该工作为解决
酿酒酵母代谢工程菌株的木糖运输问题作出了新的
研究和尝试。
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据P450BM．3突变体能够催化吲哚生成靛蓝，采用了
底物平板活性预选择加微孔板活力定量比较的双重
筛选方法，有效地扩大了筛选库容量，降低了筛选强
度，获得进化酶对吲哚的催化活力也显著高于野生
型和亲本酶。这种双重筛选方法也可适用于其他具
有生色底物的酶，或能够在固体培养基上催化底物
产生可见溶解环的酶。
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