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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
启动子作为基因表达的重要调控元件，通过
与转录因子相互作用控制基因转录的起始和表达水
平［1］，在转录水平上起重要作用，因而启动子活性
的高低在较大程度上影响着蛋白的表达水平。Qin
等［2］对酵母 PGAP 启动子深入研究，并利用随机突变
收稿日期 ：2012-10-17
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（20976062，31170031）， 广东省自然科学基金项目（S2011020001457）
作者简介 ：张轩薇，女，硕士研究生，研究方向 ：发酵工程 ；E-mail ：zhangxuanwei88@yahoo.cn
通讯作者 ：林影，女，教授，研究方向 ：酶学与酶工程 ；E-mail ：feylin@scut.edu.cn
毕赤酵母新启动子 GCW14 在细胞表面展示
CALB 中的应用
张轩薇 叶燕锐 刘晓肖 鲁柳柳 林影
（华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006）
摘 要 ： 以毕赤酵母内源壁蛋白 Gcw14p 为锚定蛋白，分别以新的内源组成型启动子 PGCW14 与诱导型启动子 PAOX1、组成型启
动子 PGAP 和 PTEF1 4 种启动子将南极假丝酵母脂肪酶 B（CALB）展示于毕赤酵母细胞表面，通过检测 4 种重组细胞的 CALB 酶活比
较这 4 个启动子在毕赤酵母中的转录活性。结果显示，PGCW14 的启动子活性与 PAOX1 相当，最高菌体酶活力分别在发酵 48 h 和 168
h 时达到 694.8 U/g（Dry cell weight）和 684.3 U/g（Dry cell weight），以 PGCW14 为启动子的重组菌产酶周期大大缩短 ；组成型启动子
PGAP 和 PTEF1 的最高菌体酶活分别在发酵 24 h 和 168 h 达到 266.7 U/g（Dry cell weight）和 449.2 U/g（Dry cell weight），可见 PGCW14 的
启动子活力性要高于 PGAP 和 PTEF1。此外，以 PGCW14 为启动子，利用壁蛋白 Gcw14p 自身的信号肽代替载体上的 α-信号肽使重组菌
的菌体酶活力提高了约 4%。
关键词 ： 巴斯德毕赤酵母 启动子 南极假丝酵母脂肪酶 B 酵母表面展示
Application of Pichia pastoris Original Constitutive Strong Promoter
GCW14 in Candidn antarctic Lipase B Yeast Surface Display
Zhang Xuanwei Ye Yanrui Liu Xiaoxiao Lu Liuliu Lin Ying
（College of Biology Science and Technology，South China University of Technology，Guangzhou 510006）
Abstract: To compare the transcription activity of original promoter PGCW14 with other promoters, Candidn antarctic lipase B（CALB）
was displayed on the cell surface of Pichia pastoris using PGCW14, PAOX1, PGAP and PTEF1 as promoter respectively. Anchor protein was a cell wall
protein named Gcw14p, which was obtained originally from P. pastoris. In shake-flask cultivation, the activity of PGCW14 was equal to that of PAOX1.
Under control of PGCW14 and PAOX1, the highest lipase hydrolytic activities of recombinant yeasts reached 694.8 U/g（Dry cell weight）and 684.3
U/g（Dry cell weight）after cultivation for 48 h and 120 h, respectively. The fermentation period of recombinant yeast using PGCW14 as promoter
was shortened significantly. While the highest lipase hydrolytic activities of recombinant yeasts controlled by constitutive promoter PGAP and PTEF1
reached 266.7 U/g（Dry cell weight）and 449.2 U/g（Dry cell weight）respectively after cultivation for 48 h. This means that the activity of
PGCW14 was higher than that of PGAP and PTEF1. Furthermore, replacing the α-factor with signal peptide from protein Gcw14p, the lipase hydrolytic
activity increased about 4%.
Key words: Pichia pastoris Promoter Candidn antarctic lipase B Yeast cell-surface display
启动子 PGAP 的方式建立了一个启动子库，在毕赤酵
母中分别表达 β-半乳糖苷酶基因和甲硫氨酸腺苷转
移酶（MAT）基因，结果显示，报告基因的转录水
平和蛋白水平均受启动子活性影响。因此，在外源
蛋白表达的研究中，寻找启动活性较高的启动子对
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期130
提高外源蛋白的表达量具有重要意义。
毕赤酵母表达系统具有操作简单，表达量高，
对大部分外源基因可进行正确翻译和修饰等优点。
甲醇诱导型启动子 PAOX 是该表达系统中应用最为广
泛的启动子，已成功诱导各种来源的蛋白尤其是人
源蛋白在毕赤酵母中高效表达［3-5］。但诱导物甲醇
不适用于食品生产，在大规模生产中，存在火灾安
全隐患，这在一定程度上限制了 PAOX 启动子的使用。
因此毕赤酵母非甲醇诱导的启动子不断被开发，如
启动子 PGAP、PTEF1、PPEX8 和 PYPT1
［6］。其中组成型强
启动子 PGAP 在以葡萄糖为碳源时可以达到与 PAOX1 相
当的表达水平［7］，许多外源蛋白以 PGAP 为启动子在
毕赤酵母的表达已达到每升克级（g/L）的水平［8］。
根 据 本 实 验 室 对 毕 赤 酵 母 转 录 组 的 研 究 数
据，在以甘油为碳源的培养基中，转录水平最高
的 细 胞 壁 蛋 白 基 因 被 命 名 为 GCW14（NCBI 登 录
号 ：XM_002490678），该基因为组成型表达，推断
GCW14 具有潜在高活性的启动子。本研究克隆该基
因的启动子 PGCW14，与启动子 PAOX1、PGAP、PTEF1 比较，
分别展示南极假丝酵母脂肪酶 B（Candidn antarctic
lipase B，CALB），旨在获得较高的表达效率。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒 菌株 E. coli Top10、Pichia past-
oris X33 由 本 实 验 室 保 存。 含 有 CALB 基 因 的 质
粒 pPIC9K-CALB， 含 有 启 动 子 PGCW14 序 列 的 质 粒
pPGCW14-EGFP，含有启动子 PGCW14 序列和壁蛋白
Gcw14p 信 号 肽 的 质 粒 pPSPGCW14， 含 有 启 动 子
PGAP 序列的质粒 pPGAP-EGFP，含有启动子 PTEF1 序
列的质粒 pPTEF1-EGFP 均由本实验室构建，质粒
pPICZαA 购自 Invitrogen 公司。
1.1.2 试 剂 DNA 聚 合 酶 Premix Prime STAR、T4
DNA 连接酶、DNA Marker 和限制性内切酶购自大连
宝生物有限公司 ；试验中所用试剂盒购自 OMEGA、
Biomega 和 QIAGEN 公 司 ；无 氨 基 酸 酵 母 基 础 氮
源 YNB 和蛋白胨均购自 Difco 公司 ；酵母提取物购
自 Oxford 公司 ；对硝基苯酚丁酸酯（pNPB）购于
Sigma 公司 ；引物由上海捷瑞公司合成 ；其他试剂均
为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 CALB 基因与壁蛋白基因 GCW14 的融合 采
用重叠延伸 PCR（Overlap extension PCR，OE PCR）
的方式将壁蛋白基因 GCW14 连接到 CALB 基因的 3
端。设计引物 CALB-F ：5-ATGAATTCCTGCCTTCC-
GGTTCGGACCCT-3（下划线为酶切位点）和 CALB-
Rm ：5-ACGTTAGAGTAAGCGATTATGGGGGTGAC-
GATGCCGGAG-3 扩 增 CALB 基 因 ；引 物 GCW14-
Fm ：5-GCATCGTCACCCCCATAATCGCTTACTCTAA-
CGTAACTTAC-3 和 GCW14-R ：5-CCGCTCGAGG-
CTCTAGATTACAAGAAGTAAGCAGCGGCAG-3 扩
增 壁 蛋 白 基 因 GCW14， 模 板 分 别 为 质 粒 pPIC9K-
CALB 和 P. pastoris X33 基 因 组 DNA。PCR 反 应 体
系为 ：模板 1 μL，10 μmol/L 的上下游引物各 1 μL，
2×Premix Prime STAR 25 μL，加无菌水至总体积为
50 μL。反应条件为 ：98℃ 5 min ；98℃ 10 s，55℃
10 s，72℃ 1 min，30 个循环 ；72℃ 10 min。将二者
的 PCR 产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回
收纯化，然后等摩尔比混合作为第二次 PCR 的模
板，以 CALB-F 和 GCW14-R 为引物，扩增得到融合
基因 CALB-GCW14。PCR 反应体系为 ：模板为第一
次 PCR 产物等摩尔比混合，10 μmo/L 的上下游引物
各 1 μL，2×PrimeSTAR Premix 25 μL，加无菌水至
总体积为 50 μL。反应条件 ：98℃ 5 min ；98℃ 10 s，
55℃ 10 s，72℃ 1.5 min，30 个循环 ；72℃ 10 min。
PCR 产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收
纯化。
1.2.2 毕 赤 酵 母 表 面 展 示 CALB 重 组 质 粒 的 构
建 本实验室构建的质粒 pPGCW14-EGFP、pPGAP-
EGFP 和 pPTEF1-EGFP 是在 pPICZαA 的基础上改造
的，分别以 PGCW14、PGAP 和 PTEF1 为启动子，绿色荧
光蛋白 EGFP 为报告基因。质粒 pPSPGCW14 则是
PGCW14 为启动子，使用壁蛋白 GCW14 自带的信号肽。
将质粒 pPICZαA、pPGCW14-EGFP 与融合基因
CALB-GCW14 的 PCR 产物均使用 EcoR I 与 Xba I 双
酶切，构建重组质粒 pZαA-CALB、pPG14-CALB（图
1-A、图 1-B）。质粒 pPSPGCW14 与 PCR 产物均使
用 EcoR I 与 Xho I 双酶切，构建重组质粒 pPSPG14-
CALB（图 1-C）。后用 CaCl2 法转入 E. coli 感受态细
2013年第4期 131张轩薇等 ：毕赤酵母新启动子 GCW14 在细胞表面展示 CALB 中的应用
胞，在 Zeocin+ LBL（25 mg/L）平板上涂板，过夜培养。
提取阳性转化子质粒进行 EcoR I 与 Xba I（或 Xho I）
双酶切鉴定。
重 组 质 粒 pPGAP-CALB（ 图 1-D） 和 pPTEF1-
CALB（图 1-E）的构建在 pZαA-CALB 的基础上进行。
使用 Bgl II 和 BspT104 I 分别双酶切 pPGAP-EGFP 和
pPTEF1-EGFP，回收启动子片段，与经过相同双酶
切的质粒 pZαA-CALB 进行连接，将 PAOX1 片段替换
成 PGAP 或 PTEF1 片段。后用 CaCl2 法转入 E. coli 感受
态，在 Zeocin+ LBL（25 mg/L）平板上涂板，过夜培养。
提取阳性转化子质粒进行 Bgl II 与 BspT104 I 双酶切
鉴定。以上重组质粒双酶切鉴定正确后，委托上海
A ：重组质粒 pZαA-CALB ；B ：重组质粒 pPG14-CALB ；C ：重组质粒 pPSPG14-CALB ；D ：重组质粒 pPGAP-CALB ；E ：重组质粒 pPTEF1-CALB
图 1 不同启动子的 CALB 重组质粒示意图
EcoR I
CALBPme I
pUC ori
pZαA-CALB
α-factor
5 A˃OX1
AOX1 TT
GCW14
Xba I
CYC1 TT
Zeocin PEM7
PTEF1
EcoR I
CALBBln I
pUC ori
pPGAP-CALB
α-factor
5 A˃OX1
AOX1 TT
GCW14
Xba I
CYC1 TT
Zeocin PEM7
PTEF1
EcoR I
CALB
Sca I
pUC ori
pPTEF1-CALB
α-factor
5 A˃OX1
AOX1 TT
GCW14
Xba I
CYC1 TT
Zeocin
PEM7
PTEF1
EcoR I
CALBBstP I
Pst I
pUC ori
pPGCW14-CALB
α-factor
5 G˃CW14
AOX1 TT
GCW14
Xba I
CYC1 TT
Zeocin PEM7
PTEF1
EcoR I
CALB
BstP I
Pst I
pUC ori
pPSPGCW14-CALB
GCW14-SP
5 G˃CW14
3 G˃CW14
AOX1 TT
GCW14
Xho I
CYC1 TT
Zeocin
PEM7
PTEF1
A B
D E
C
美吉生物医药科技有限公司进行测序。
1.2.3 重组毕赤酵母的构建和筛选 以 Pme I 线性
化 重 组 质 粒 pZαA-CALB ；BstP I 线 性 化 重 组 质 粒
pPG14-CALB 和 pPSPG14-CALB ；Bln I 线 性 化 重 组
质粒 pPGAP-CALB ；Sca I 线性化重组质粒 pPTEF1-
CALB。之后采用电转法转化宿主菌 P. pastoris X33，
于 Zeocin+ YPDS（100 mg/L）平板上涂板，30℃培养
2-3 d，随机挑选转化子点种于三丁酸甘油酯平板进
行培养，30℃培养 3-4 d 后观察水解圈。根据重组
菌的启动子不同，三丁酸甘油酯平板碳源也做相应
调整。组成型启动子 PGCW14、PGAP 和 PTEF1 的重组菌
以甘油为碳源，诱导型启动子 PAOX1 的重组菌以甲醇
为碳源。
1.2.4 重组菌的摇瓶发酵及 CALB 酶活力测定 将
筛 选 得 到 的 重 组 转 化 子 X33/pZαA-CALB 接 种 于
10 mL BMGY 培 养 基 中，X33/pPG14-CALB、X33/
pPSPG14-CALB、X33/pPGAP-CALB 和 X33/pPTEF1-
CALB 接 种 于 10 mL YPD 中，30℃，200 r/min 振
荡 培 养 16-20 h 至 OD600=2-6。 离 心 收 集 菌 体， 再
将 X33/pZαA-CALB 悬浮于 25 mL BMMY 培养基中，
X33/pG14-CALB、X33/pPSPG14-CALB、X33/pPGAP-
CALB 和 X33/pPTEF1-CALB 悬 浮 于 BMGY 培 养 基
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期132
4500
bp
M 1 2 3
3000
2250
1500
1000
750
500
4500
bp
M 4 5 6 7
3000
2250
1500
1000
750
500
4500
bp
M 8 9
3000
2250
1500
1000
750
500
250
A B C
A ：CALB 基因与 GCW14 基因的 PCR 电泳图 ；B，C ：重组质粒双酶切电泳图 ；M ：250 bp DNA Marker ；1 ：CALB 基因 ；
2 ：GCW14 基因 ；3 ：重叠延伸 PCR 产物 CALB-GCW14 ；4 ：pZαA-CALB 经 EcoR I 与 Xba I 双酶切图 ；5 ：pPG14-CALB
经 EcoR I 与 Xba I 双酶切图 ；6 ：pPSPG14-CALB 经 EcoR I 与 Xho I 双酶切图 ；7 ：融合基因 CALB-GCW14 的 PCR 产物（对
照）；8 ：pPGAP-CALB 经 Bgl II 与 BspT104 I 双酶切图 ；9 ：pPTEF1-CALB 经 Bgl II 与 BspT104 I 双酶切图
图 2 不同启动子的 CALB 重组质粒的构建
中，并使起始 OD600=1，继续振荡培养，每隔 24 h
向 BMMY 培养基和 BMGY 培养基中分别补加 1% 的
甲醇或甘油，并分析重组菌的生长曲线和 CALB 的
酶活力。试验以 P. pastoris X33 作为阴性对照，所有
试验数据均重复 3 次。
CALB 酶活力的测定方法采用吸光光度法［9］。
2 结果
2.1 CALB基因与壁蛋白基因GCW14的融合及表达
载体的构建
分别以质粒 pPIC9K-CALB 和 P. pastoris X33 基
因 组 DNA 为 模 板 扩 增 CALB 基 因 与 壁 蛋 白 基 因
GCW14（图 2-A），产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定
后切胶回收扩增产物。通过重叠延伸 PCR 的方式
将 GCW14 连接到 CALB 的 3 端（图 2-A），按方法
“1.2.2” 构 建 重 组 质 粒 pZαA-CALB、pPG14-CALB、
pPSPG14-CALB、pPGAP-CALB 和 pPTEF1-CALB，
双酶切鉴定结果符合预期（图 2-B 和图 2-C），送上
海美吉生物医药有限公司测序，测序结果正确。重
组质粒 pZαA-CALB、pPG14-CALB、pPSPG14-CALB、
pPGAP-CALB 和 pPTEF1-CALB 的结构示意图如图 1
所示。
2.2 重组毕赤酵母菌株的构建和筛选
按方法“1.2.3”构建重组毕赤酵母并在三丁酸
甘油酯平板观察水解圈的形成情况，挑选水解圈较
大的菌株用于下一步的发酵试验。图 3 显示，其中
对照菌株为 P. pastoris X33，不能产生水解圈，重
组 菌 株 X33/pZαA-CALB、X33/pPG14-CALB 和 X33/
pPSPG14-CALB，其周围已经形成了明显的水解圈，
但从水解圈的大小来看很难区分此 3 株 CALB 重
组 菌 的 产 酶 能 力。 重 组 菌 株 X33/pPGAP-CALB 和
X33/pPTEF1-CALB，其周围形成的水解圈大小与对
照菌株 X33 相比有明显差别，但不如其他 3 株重组
菌形成的水解圈大，以此可初步推断 X33/pPGAP-
CALB 和 X33/pPTEF1-CALB 的产酶能力较其他重组
菌株小。
2.3 五株CALB表面展示重组菌株的摇瓶发酵
以上筛选获得的 5 株菌株与阴性对照菌 P. pas-
toris X33 进行摇瓶发酵产酶比较分析，CALB 发酵产
酶曲线如图 4-A，细胞生长曲线如图 4-B 所示。
1 2 1 3 4
1 5 6
1 ：X33 ；2 ：X33/pZαA-CALB ；3 ：X33/pPG14-CALB ；4 ：X33/
pPSPGCW14-CALB ；5 ：X33/pPTEF1-CALB ；6 ：X33/pPGAP-CALB
图 3 五株 CALB 重组菌株在三丁酸甘油酯平板上
形成的水解圈
2013年第4期 133张轩薇等 ：毕赤酵母新启动子 GCW14 在细胞表面展示 CALB 中的应用
1000
900
800
700
600
500
400
300A
ct
iv
ity
U/g
200
100
0
0 24 48 72ᰦ䰤 h 96 120 144 168
A
120
100
80
60
O
D
60
0
40
20
0
0 24 48 72ᰦ䰤 h 96 120 144 168
B
2.3.1 菌体酶活力比较 图 4-A 显示，启动子同为
PGCW14 的重组菌株 X33/pPG14-CALB 和 X33/pPSPG14-
CALB 在甘油培养基中发酵 48 h 时达到菌体酶活力
达最高，分别为 694.8 U/g（Dry cell weight）和 721.3
U/g（Dry cell weight），此时 OD600 约为 55，之后菌
体酶活力停止增长。继续发酵 96 h 之后菌体浓度达
到 OD600 约为 90，之后增长缓慢。
启动子为 PAOX1 的重组菌株 X33/pZαA-CALB 在
甲醇培养基中发酵到 96 h 后菌体浓度增长缓慢，但
菌体酶活力不断增长，发酵到 144 h 后菌体酶活力
基本保持不变，144 h 和 168 h 的菌体酶活力分别
为 662.3 U/g（Dry cell weight）和 684.3 U/g（Dry cell
weight）。
启动子 PGAP 和 PTEF1 的重组菌株的发酵生长曲线
与 PGCW14 的重组菌株一致（图 4-B）。重组菌株 X33/
pPGAP-CALB 在整个发酵过程中菌体酶活力的变化
幅度不大，发酵 24 h 即达到最高菌体酶活力 266.7 U/g
（Dry cell weight），此时 OD600 约为 26，之后的菌体
酶活力在 230 U/g（Dry cell weight）附近波动。启动
子为 PTEF1 的重组菌株 X33/pPTEF1-CALB 发酵到 144
h 后酶活力基本保持不变，144 h 和 168 h 的菌体酶
活力分别为 429.2 U/g（Dry cell weight）和 449.2 U/g
（Dry cell weight）。
5 株重组菌的菌体酶活力比较结果（表 1）显示，
X33/pPG14-CALB 的 最 高 菌 体 酶 活 力 与 X33/pZαA-
CALB 相当，但高于其他两株组成型启动子的重
组菌 X33/pPGAP-CALB 和 X33/pPTEF1-CALB，说明
PGCW14 的启动子活性与诱导型启动子 PAOX 相当，且高
于组成型启动子 PGAP、PTEF1。而 X33/pPSPG14-CALB
的最高菌体酶活力高于 X33/pPG14-CALB 约 4%，说
明 Gcw14p 自身的信号肽要优于 α-信号肽。
2.3.2 产酶效率比较 从单位体积发酵液得到的总
酶 活 力 来 看， 在 发 酵 48 h 时 X33/pPG14-CALB 和
X33/pPSPG14-CALB 的酶活力分别为 9.2 U/mL 和 9.7
U/mL，而此时 X33/pZαA-CALB 的酶活力为 2.6 U/mL，
远低于 X33/pPG14-CALB 和 X33/pPSPG14-CALB。继
续发酵到 168 h，X33/pZαA-CALB 的酶活力到达 7.6
U/mL，但仍低于 X33/pPG14-CALB 和 X33/pPSPG14-
CALB 在发酵 48 h 的水平。X33/pPG14-CALB 和 X33/
pPSPG14-CALB 到 168 h 时酶活力可分别达到 15.7
U/mL 和 17.0 U/mL。X33/pPGAP-CALB 在 24 h 时 单
位体积的酶活力为 2.4 U/mL，之后随着菌体浓度增
加在 168 h 时酶活力增长到 5.8 U/mL。X33/pPTEF1-
CALB 发酵到 48 h 时酶活力为 4.2 U/mL，直到 120 h
其酶活力才达到 X33/pPG14-CALB 在 48 h 的水平约
9.4 U/mL，在 168 h 时酶活力增加到 11.1 U/mL。
以上结果说明在相同的时间内，启动子 PGCW14
能比其他 3 种启动子得到更多的总酶活力，具有更
高的产酶效率。以发酵得到最高菌体酶活力的时间
计算的发酵产酶效率结果如表 1 所示，X33/pPG14-
CALB 分别是 X33/pZαA-CALB、X33/pPGAP-CALB 和
X33/pPTEF1-CALB 的 4.3 倍、1.9 倍和 1.9 倍。
3 讨论
使用高效的启动子是提高毕赤酵母外源蛋白表
达和节约生产成本的有效途径之一。南极假丝酵母
脂 肪 酶 B（Candidn antarctic lipase B，CALB） 是 用
● ：X33/pZαA-CALB ；■ ：X33/pPG14-CALB ；▲ ：X33/pPSPGCW14-CALB ；◆ ：X33/pPGAP-CALB ；× ：X33/pPTEF1-CALB.
图 4 五株 CALB 重组菌的摇瓶发酵产酶曲线（A）和生长曲线（B）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期134
途最广泛的脂肪酶之一，将 CALB 表面展示于酵母
细胞表面成为全细胞催化剂可以有效降低成本［10］。
本实验室以质粒 pPIC9K 为载体，已成功利用毕赤
酵母内源的壁蛋白为锚定蛋白将 CALB 展示于毕赤
酵母细胞表面并获得较高酶活，但启动子 PAOX1 需要
甲醇诱导，而甲醇原料的运输和储存会给工业生产
带来一定不便。
本研究以毕赤酵母自身壁蛋白 Gcw14p 为锚定蛋
白，比较了在 PGCW14、PAOX1、PGAP 和 PTEF1 4 种启动子
的指导下表面展示 CALB 的酶活力。摇瓶发酵结果显
示 ：X33/pPG14-CALB 和 X33/pZαA-CALB 的 菌 体 酶
活力可分别达到 649.8 U/g（Dry cell weight）和 684.3
U/g（Dry cell weight），说明 PGCW14 的启动子活力与
PAOX1 的 相 当 ；X33/pPGAP-CALB 和 X33/pPTEF1-
CALB 的菌体酶活力可分别达到 266.7 U/g（Dry cell
weight） 和 449.2 U/g（Dry cell weight）， 说 明 PGCW14
的启动子活力要高于 PGAP 和 PTEF1。且从发酵达到最
高菌体酶活力的时间以及相应的单位体积总酶活力
来看，相对于其他 3 种启动子来说，以 PGCW14 为启
动子的重组菌可以在较短的时间内得到高的总酶产
量，这对于工业生产来说提高了生产效率，并且大
幅度降低了成本。此外，PGCW14 属于组成型启动子，
发酵时避免了转换培养基的不便，且不需甲醇诱导，
为加强生产及产品的安全性提供了新的途径。
此 外， 重 组 酵 母 X33/pPSPG14-CALB 与 X33/
pPG14-CALB 在发酵过程中生长曲线一致，但前者
的最高菌体酶活力要高于后者 4% 左右，说明对于
CALB 以 GCW14 为锚定蛋白展示于毕赤酵母细胞表
面来说，壁蛋白 Gcw14p 自身的信号肽要优于载体
上的 α- 信号肽，可能是由于信号肽与启动子来源于
同一基因更有利于外源基因的表达，但酵母对信号
肽的选择没有严格的专一性［11］，具体原因有待进一
表 1 五株 CALB 重组菌株的摇瓶发酵酶活力比较
菌株 启动子 信号肽
最大菌体酶活力
（U/g）
菌体浓度
（OD600）
单位体积总酶活
（U/mL）
发酵时间
（h）
产酶效率
［U/（L·h）］
X33/ pPG14-CALB PGCW14 α-factor 649.8 54 9.2 48 192
X33/pPSPGCW14-CALB PGCW14 GCW14-SP 721.3 55 9.7 48 203
X33/pZαA-CALB PAOX1 α-factor 684.3 44 7.6 168 45
X33/pPGAP-CALB PGAP α-factor 266.7 37 2.4 24 100
X33/pPTEF1-CALB PTEF1 α-factor 449.2 99 11.1 168 102
步研究。
基于启动子功能的研究，未来的工作可以对
PGCW14 内部的作用元件进行分析以及对 PGCW14 进行改
造，以使其在毕赤酵母表达系统中更好地发挥功能，
进而为高效表达外源蛋白奠定基础。
4 结论
本试验以实验室新发现的组成型强启动子 PGCW14
成功地将 CALB 展示于细胞表面，并与常用的甲醇
诱导型启动子 PAOX1 和组成型启动子 PGAP、PTEF1 比较。
各重组菌的最高菌体酶活力说明 PGCW14 的活力与
PAOX1 接近，且高于 PGAP、PTEF1 ；从相同时间各重组
菌得到的总酶活力来看，PGCW14 具有更高的产酶效率，
是 PAOX1 产酶效率的 4 倍左右，分别是 PGAP、PTEF1 产
酶效率的 2 倍 ；使用 Gcw14p 自身的信号肽要优于 α-
信号肽，菌体酶活力提高约 4%。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）