全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(12): 20812089 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由教育部博士点专项科研基金项目(20120182120031), 高等学校学科创新引智计划(B12006)和西南大学中央高校基本科研业务
费专项(XDJK2012C089, 2362014xk09)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 张洪博, E-mail: hbzhang@swu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: 1301095263@qq.com
Received(收稿日期): 2014-05-15; Accepted(接受日期): 2014-09-16; Published online(网络出版日期): 2014-10-20.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20141020.1510.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.02081
酵母表面展示系统的改进及其在筛选烟草 PMT基因启动子结合蛋白
中的应用
陈 红 牛海峡 王文静 马浩然 李加纳 柴友荣 张洪博*
西南大学农学与生物科技学院, 重庆 400716
摘 要: 筛选 DNA结合蛋白常用的酵母单杂交系统在应用中有时会因内源干扰而影响筛选结果。与之相比, 酵母表
面展示系统(yeast surface display system)将外源蛋白展示在细胞表面, 可通过接近体外实验的方法筛选 DNA结合蛋
白, 能在一定程度上避免酵母内源干扰, 但是, 该系统在 DNA 结合蛋白筛选研究中的应用还很有限。本研究对酵母
表面展示系统常用载体 pYD1进行改造, 使其与 Clontech公司的 Smart cDNA文库构建系统相匹配, 提高了 cDNA酵
母表面展示文库的构建效率, 并通过比较试验建立了一个以酵母表面展示系统筛选 DNA结合蛋白的试验体系。在以
酵母单杂交筛选烟草腐胺甲基转移酶基因 PMT (putrescine N-methyltransferase)启动子结合蛋白的研究中, 其茉莉素
信号应答元件GAG片段是一段筛选效率极低的DNA片段。本研究利用改进的酵母表面展示系统对GAG片段的DNA
结合蛋白进行了筛选, 并获得若干烟草蛋白基因, 其中包括 2个可能结合 GAG片段的 ERF (ethylene responsive factor)
转录因子。进一步研究发现, 这 2 个 ERF 转录因子可与 GAG 片段在体外结合, 但不能在酵母单杂交系统中激活由
GAG片段操纵的报告基因表达。本研究也证明酵母表面展示系统可有效克服酵母内源干扰, 弥补酵母单杂交系统在
筛选易受酵母内源干扰 DNA结合蛋白方面的不足。
关键词: 酵母表面展示; Smart cDNA文库; DNA结合蛋白; 酵母单杂交; PMT基因
Screening of Promoter-Binding Factors of Tobacco PMT Gene Using a Modi-
fied Yeast Surface Display System
CHEN Hong, NIU Hai-Xia, WANG Wen-Jing, MA Hao-Ran, LI Jia-Na, CHAI You-Rong, and ZHANG
Hong-Bo*
College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China
Abstract: Yeast surface display system is an important tool for studying molecular interaction of proteins, however, its application
in DNA-binding-protein screening is relatively limited. Yeast surface display system secretes exogenous proteins onto cell surface,
thus, it could be applied to determine protein interaction under in-vitro-like experiment conditions. Therefore, it may be more
efficient than yeast one-hybrid system in screening the DNA-binding proteins whose DNA-binding capability is affected by en-
dogenous yeast factors. In this study, we modified the pYD1 vector in yeast surface display system to make it compatible with the
Smart cDNA library construction kit from Clontech, which will be helpful to increase the library construction efficiency. An ex-
perimental procedure for DNA-binding protein isolation was established using the modified yeast surface display system. Then, it
was successfully applied in screening DNA-binding proteins of a jasmonate (JA) responsive element in the promoter of tobacco
PMT (putrescine N-methyltransferase) gene. Among the isolated genes, two encoded ERF transcription factors, which were found
to bind the JA responsive element in PMT promoter in vitro but unable to activate the expression of reporters in yeast-one-hybrid
system. Our study suggests that yeast surface display system is efficient in screening the DNA-binding proteins whose DNA-
binding capability in yeast-one-hybrid system is disrupted by endogenous factors.
Keywords: Yeast surface display; Smart cDNA Library; DNA-binding protein; Yeast one-hybrid; PMT gene
2082 作 物 学 报 第 40卷

在DNA结合蛋白的筛选研究中, 酵母单杂交系
统是一个常用工具, 但该系统在应用中易受酵母内
源干扰而影响 DNA 结合蛋白的筛选效率[1-2]。酵母
表面展示系统(yeast surface display system)将外源基
因与酵母表面展示载体的酵母细胞壁甘露糖蛋白基
因融合, 从而使导入酵母的外源基因蛋白分子在信
号肽引导下分泌到酵母细胞表面[3-5], 可通过接近体
外实验的方法研究蛋白的分子间相互作用[6-9], 有利
于克服酵母内源干扰。同用于蛋白表面展示研究的
大肠杆菌和噬菌体相比, 酵母具有完整的蛋白修饰
系统, 更适合真核生物的蛋白功能研究[10-13]。虽然
已有不少应用酵母表面展示技术筛选蛋白互作分子
的研究[5,9,14], 但利用该系统筛选 DNA 结合蛋白的
研究还很有限。基于 pYD1 表达载体和 EBY100 菌
株的酵母表面展示系统是一个常用体系。该系统在
应用研究中, 需先构建质粒文库, 再将质粒文库导
入酵母获得表面展示文库, 这一过程费时费力, 对
酵母表面展示文库的构建效率影响较大。Clontech
公司的 Smart cDNA 文库构建系统是一个基于酵母
的简易高效率的文库构建系统。将 pYD1 载体改造
成一个可与 Clontech 公司的 Smart cDNA 文库构建
系统相匹配的酵母表达载体, 可极大地简化酵母表
面展示文库的构建工作。
烟草腐胺甲基转移酶基因 PMT (putrescine
N-methyltransferase)是尼古丁合成的关键基因 [15-16],
在烟草中有 5个成员(PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3
和 PMT4)[17], 控制着尼古丁分子的吡咯烷环合成代
谢[15-16]。茉莉素是调控尼古丁合成代谢的重要植物
激素, 包括 PMT在内的大部分尼古丁合成关键基因
都受茉莉素诱导表达 [18-22]。删除突变实验证明
PMT1a启动子中含有一段由 G-box、AT-rich和 GCC-
box-like 元件构成的茉莉素应答必要片段 [22-23], 该
DNA 片段也存在于其他 PMT 基因启动子中, 在后
来的研究中被称为 GAG片段[23-24]。虽然近期的研究
已鉴定了若干尼古丁合成调控因子, 如 ERF 转录因
子家族成员 ORC1 和 JAP1[25], bHLH 转录因子
NbbHLH1/2[26]和MYC2a/b等[27], 但是, 茉莉素途径
调控 PMT基因表达的分子机制仍不清楚, 还无法从
调控机制上解释GAG片段的 3个元件在茉莉素信号
应答中的必要性及其相互关系。因此, 进一步筛选
PMT基因启动子 GAG片段的 DNA结合蛋白对揭示
尼古丁合成代谢调控机理有重要意义。然而, 我们
近期利用酵母单杂交系统对 GAG 片段结合蛋白进
行的多次筛选, 结果均不理想, 而且已报道的 GAG
片段结合蛋白大多无法在酵母单杂交系统中激活
GAG 片段操纵的报告基因表达[23-24], 推测是由于酵
母内源因子干扰或 GAG片段的结构特殊性。在以酵
母筛选 PMT 基因启动子 GAG 片段结合蛋白的研究
中, 对酵母内源干扰的克服是影响筛选效率的一个
重要因素。
本研究对基于 pYD1 表达载体和 EBY100 菌株
的酵母表面展示系统的 pYD1 载体进行了改造, 使
其可与 Clontech 公司的 Smart cDNA 文库构建系统
相匹配, 简化了酵母表面展示文库的构建工作; 并
以烟草 PMT 基因启动子 GAG 片段的结合蛋白
MYC2a[24]作为阳性对照, 以 GAG片段作为 DNA探
针, 建立了利用酵母表面展示系统筛选 DNA 结合蛋
白的试验体系。然后, 利用改进的酵母表面展示系统
对 GAG 片段的结合蛋白进行了筛选, 并对筛选到的
DNA结合蛋白与 GAG片段的结合特性进行了分析。
1 材料与方法
1.1 研究材料
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株 DH5α由本实验
室 提 供 。 酵 母 (Saccharomyces cerevisiae) 菌 株
EBY100、pYD1载体、链亲和素磁珠及 TRIzol试剂
购自 Invitrogen 公司。pGADT7-Rec2 载体及酵母培
养所需试剂购自 Clontech 公司。其他生化试剂购自
生工生物工程公司。
1.2 pYD1-Rec载体构建
将 pYD1 和 pGADT7-Rec2 质粒分别用 EcoR I
和 Xho I 双酶切, 电泳分离酶切产物后, 回收 pYD1
载体骨架和 pGADT7-Rec2 载体酶切产物的 114 bp
长度片段, 经连接反应后转化大肠杆菌 DH5α, 筛选
阳性克隆并测序鉴定 , 所获得的重组质粒命名为
pYD1-Rec。
1.3 pYD1-MYC2a阳性对照载体的构建
依据前期研究报道的方法克隆烟草 MYC2a 基
因 [24], 然后用特异引物 5-AAAGGTACCGGGTC
AGTCCCATTTTGGG-3和 5-GCGCCTTGAGTCTTT
ACTAAC-3扩增 MYC2a 基因的 DNA 结合域片段,
经 Kpn I酶切后, 克隆至由 Kpn I和 Eco I CRI双酶
切的 pYD1-Rec 载体, 获得 pYD1-MYC2a 阳性对照
载体。
1.4 酵母转化
在YPD固体培养基上画线活化酵母菌株EBY100,
第 12期 陈 红等: 酵母表面展示系统的改进及其在筛选烟草 PMT基因启动子结合蛋白中的应用 2083


并按照 Clontech 公司的酵母培养手册(Yeast Proto-
cols Handbook)提供的方法挑取酵母菌落制备热激
转化感受态。在进行常规酵母质粒转化时, 将 0.3 μg
质粒与 30 μg 鱼精 DNA加入 50 µL 酵母感受态中,
混匀后加入 6 µL DMSO和 300 µL含 40% PEG-4000
的 LiOAc/TE溶液(按 Clontech公司酵母培养手册方
法配制), 轻轻混匀, 于 30℃温箱孵育 30 min, 42℃
水浴热激 15 min, 离心收集酵母菌体, 涂布在营养
缺陷型培养基 SD/–Ura/–Trp平板上, 于 30℃培养。
酵母文库按照 Clontech公司 BD Matchmaker Library
Construction & Screening Kits操作手册提供的方法
制备。
1.5 DNA探针制备
依据前期报道的方法[24]克隆烟草 PMT1a 基因
启动子的GAG片段, 然后用生物素标记的正向引物
5-Biotin-ACTAGTCTAACCCTGCACG-3和反向引
物 5-TCTAGAAGTGGAGGGCGC-3进行 PCR扩增,
获得生物素标记的DNA探针, 通过电泳分离和切胶
回收纯化 DNA探针, 将探针终浓度稀释至 250~300
ng µL–1。
1.6 酵母表面展示系统筛选 DNA 结合蛋白的试
验体系
将分别导入pYD1-Rec (阴性对照)和pYD1-MYC2a
(阳性对照)载体的 EBY100 细胞在葡萄糖为碳源的
SD/–Ura/–Trp 培养基平板上画线培养后, 接种至相
同碳源的 SD/–Ura/–Trp 液体培养基, 30℃过夜振荡
培养。然后, 离心收集培养的酵母细胞, 重悬于半乳
糖为碳源的 SD/–Ura/–Trp 液体培养基 , 并稀释至
OD600=0.5, 于 20℃继续振荡培养 24 h诱导表面展示
蛋白表达。同时, 用葡萄糖为碳源的 SD/–Ura 液体
培养基培养 EBY100 细胞用于封闭试验体系的非特
异结合。
配制新鲜 DNA 结合酵母分离缓冲液 1×buffer
[25 mmol L–1 HEPES-KOH, pH 7.4, 30 mmol L–1 KCl,
5 mmol L–1 MgCl2, 1 mmol L–1 EDTA, 0.2 mg mL–1
poly(dI-dC)和 0.1% BSA]。离心收集完成了表面展示
蛋白诱导表达的酵母细胞, 并依据其 OD600 吸收值,
用 1×buffer 稀释至每毫升含 1×107个细胞备用。同
时 , 离心收集用作封闭菌液的 EBY100 细胞 , 以
1×buffer稀释至每毫升含 1×107菌液备用。
DNA结合酵母筛选方案如图 1所示。
方案一 : (1)将带链亲和素的磁珠 10 µL (约
100 µg磁珠)加入 1 mL 1×buffer, 混匀, 置磁力架上,
待磁珠被吸附后去上清液, 如此重复 3 次平衡磁珠;
(2)分别将上述制备的阴性对照和阳性对照菌液 1 µL,
加入 1 mL封闭菌液(即以 1∶1000的比例将对照菌
液用 EBY100 封闭细胞稀释), 混匀后加入生物素标
记的 DNA探针(1.5 µg, 约 20 pmol), 于 25℃自旋式
混匀仪上, 以 20转 min–1孵育 30 min, 使生物素标
记的 DNA探针与酵母细胞结合; (3)加入 20 µL平衡
处理的链亲和素磁珠, 继续在 25℃自旋式混匀仪上,
以 20 转 min–1孵育 30 min, 完成磁珠与 DNA 探针
复合物的结合; (4)在磁力架的帮助下, 移除未结合
菌液, 并用 1×buffer洗涤 3次, 将结合了酵母细胞的
磁珠悬于 100 µL 1×TE 溶液, 分别涂布于 YPD 及
SD/–Ura/–Trp 培养基平板, 于 30℃恒温箱培养 2 d,
观察统计菌落数。

图 1 酵母表面展示技术分离 DNA结合蛋白实验方案示意图
Fig. 1 Schematic diagram of DNA-binding protein isolation
using yeast surface display

方案二: (1)用方案一之(1)的方法平衡磁珠; (2)
将平衡过的磁珠和 1.5 µg (约 20 pmol)生物素标记的
DNA探针加入 1 mL 1×buffer (DNA探针的终浓度为
20 pmol 100 µg–1磁珠), 混匀后于 25℃自旋式混匀
仪上以 20转 min–1孵育 30 min, 然后在磁力架的帮
助下除去未结合的 DNA探针, 用 1×buffer洗涤 3次
后重悬于 100 µL 1×buffer备用; (3)在 1 mL封闭菌液
中, 加入 20 µL结合了 DNA探针的磁珠, 于 25℃自
旋式混匀仪上以 20转 min–1孵育 30 min, 在磁力架
的帮助下移除封闭菌液, 用 1×buffer 洗涤 3 次备用;
(4)在封闭过的磁珠探针复合体中分别加入上述制备
的阴性对照和阳性对照菌液 1 µL, 加入 1 mL封闭菌
液, 混匀后于 25℃自旋式混匀仪上以 20转 min–1孵
2084 作 物 学 报 第 40卷

育 30 min, 然后, 在磁力架的帮助下移除未结合的
菌液, 用 1×buffer洗涤 3次, 将结合了酵母细胞的磁
珠悬于 100 µL 1×TE 溶液, 分别涂布于 YPD 和
SD/–Ura/–Trp 培养基平板, 于 30℃恒温箱培养 2 d,
观察统计菌落数。
1.7 烟草 cDNA酵母表面展示文库构建
以 TRIzol试剂提取茉莉素处理 6 h的烟草根总
RNA, 将总 RNA在无 RNase活性的 DNaseI作用下,
去除 DNA污染, 进行纯化, 获得构建 cDNA文库所
需 RNA。然后, 按照 Clontech公司 BD Matchmaker
Library Construction & Screening Kits的操作手册进
行烟草根 RNA的 cDNA合成、扩增和纯化。
用 Sma I限制性内切酶对 pYD1-Rec载体酶切后,
电泳切胶回收载体 DNA, 使载体 DNA 浓度达到
1 µg µL–1; 将纯化后的双链 cDNA与 pYD1-Rec载体,
按照 Clontech 公司 BD Matchmaker Library Con-
struction & Screening Kits操作手册提供的酵母转化
方案共转化酵母 EBY100, 涂布于 SD/–Ura/–Trp 培
养基平板上, 于 30℃培养 24~48 h, 待酵母菌落生长
至直径约 0.5~1.0 mm时, 将酵母菌落通过刮板的方
式悬浮于葡萄糖为碳源的 SD/–Ura/–Trp液体培养基,
并于 30℃振荡培养 5 h, 获得烟草 cDNA的酵母表面
展示文库。然后, 离心收集酵母文库, 并重悬于半乳
糖为碳源的 SD/–Ura/–Trp 液体培养基, 诱导表达酵
母表面展示蛋白。
1.8 酵母表面展示文库筛选
根据 1.6 中的筛选方案二 , 以生物素标记的
GAG 片段作 DNA 探针, 对完成表面展示蛋白诱导
表达的 1×107酵母表面展示文库细胞进行筛选, 将筛选
到的酵母单菌落分别培养后, 提取酵母质粒转化大肠
杆菌 DH5α, 然后从阳性菌株分离质粒并测序。
1.9 蛋白与 DNA探针的体外结合分析
按照前期报道的方法 [24]进行阳性对照 MYC2a
的DNA结合域蛋白表达载体构建、蛋白表达及纯化,
其 PCR 扩增引物为 5-AAAACCATGGAGAATAAG
AAGAAGAAAAGGTCAC-3和 5-AAAACTCGAG
GCGTGTTTCAGCAACTCT-3。筛选出的 2 个 ERF
转录因子 ERF71 和 ERF72, 分别用特异引物扩增
(ERF71: 5-AAACCATGGAAGATCATCAACAAAG-3
和 5-AAACTCGAGAAAATCCCAAATAGATTCATG
ATG-3; ERF72: 5-ATGGACTCCAACGAAGATC-3
和 5-AAACTCGAGAAAATACTCAAATTCAATAAC
CTTCTCTTC-3; 下画线标记序列为引入的酶切位
点), 并通过 Nco I和 Xho I酶切位点构建至 pET28b
原核蛋白表达载体(Novagen 公司); 克隆 ERF72 时,
pET28b载体的 Nco I切点酶切后需要补平。构建完
成的原核表达载体被导入大肠杆菌菌株 BL21(DE3),
在含 1 mmol L–1 IPTG的 LB培养基中于 37℃培养
3 h 诱导蛋白表达。按 Invitrogen 公司 Ni+亲和柱的
说明书纯化带组氨酸标签的重组蛋白。
在 Gel-shift (凝胶迁移率滞阻试验)试验中, 将
4 μg纯化蛋白与 5 ng生物素标记的 GAG片段 DNA
探针在 30 μL结合缓冲液[25 mmol L–1 Hepes-KOH,
pH 7.4, 50 mmol L–1 KCl, 0.1 mmol L–1 EDTA, 5%甘
油, 0.5 mmol L–1 DTT和 200 ng poly(dI-dC)]中混匀,
于室温孵育 15 min, 用 0.5×TBE 缓冲液配制的 4%
(w/v)聚丙烯酰胺凝胶分离, 然后通过半干电转移方法
将分离的反应物转移至尼龙膜上, 并用紫外交联后,
以 Roche公司的生物素检测试剂盒检测试验结果。
1.10 蛋白与 DNA探针在酵母中的结合分析
通过酵母单杂交试验检验筛选出的 DNA 结合
蛋白与GAG片段在酵母中的相互作用, 所用试验系
统为Clontech公司的MATCHMAKER酵母单杂交系
统, 所用激活域表达载体为 pGADT7-Rec2。GAG片
段的 4 次重复序列被分别克隆至 pHISi-1 和 pLacZi
载体的报告基因启动子中, 随后这 2个载体被共同
导入酵母菌株 YM4271, 获得酵母单杂交所需的报
告菌株。MYC2a、ERF71和 ERF72的 DNA结合域
片段用 1.9 的克隆方法导入酵母单杂交激活域表达
载体 pGADT7-Rec2, 然后分别转化酵母报告菌株 ,
在营养缺陷型培养基 SD/–Leu/–Ura/–His 上于 30℃
培养, 在用于检测蛋白与DNA互作的培养基中加入
15 mmol L–1 3-AT (3-氨基-1, 2, 4-三唑)。酵母培养所
需营养缺陷型培养基的配制及蛋白与 GAG 片段在
酵母中的相互作用分析按照 Clontech 公司 Match-
Maker酵母单杂交系统提供的方法操作。
2 结果与分析
2.1 酵母表面展示系统的改造
通过 EcoR I和 Xho I双酶切将酵母单杂交系统载
体 pGADT7-Rec2中的 Smart重组片段转移至酵母表
面展示载体 pYD1, 获得了重组载体 pYD1-Rec, 其结
构如图 2 所示。pYD1-Rec 载体具有 Clontech 公司
Smart文库构建系统必须的 Smart III和 CDS III引物
序列, 并有线性化 pYD1-Rec载体的 Sma I酶切位点,
可与 Smart文库构建试剂盒匹配用于酵母表面展示文
库构建, 简化了酵母表面展示文库的构建过程。
第 12期 陈 红等: 酵母表面展示系统的改进及其在筛选烟草 PMT基因启动子结合蛋白中的应用 2085



图 2 pYD1-Rec 载体结构
Fig. 2 Structure of pYD1-Rec vector

2.2 以酵母表面展示系统筛选 DNA 结合蛋白试
验体系的建立
采用2种试验方案进行了比较研究。如1.6所述,
方案一先让DNA探针和酵母细胞结合, 然后用链亲
和素磁珠分离结合了DNA探针的酵母细胞; 方案二
则用预先结合了 DNA 探针的磁珠分离可结合 DNA
探针的酵母细胞。表1所示为按照1.6所述试验方案
通过3次重复试验得到的筛选效率对比结果。图3所
示, 为筛选结果的酵母生长情况。从对阳性对照的
筛选结果中可以看出, 用方案二的方法筛选DNA探
针结合酵母的效率较高, 更有利于分离含有DNA探
针结合蛋白的酵母细胞。同时, 对阴性对照的筛选
结果显示2种实验方案都会有极少数非特异结合酵
母得到分离。
上述结果说明本研究设计的试验方案在利用酵
母表面展示系统筛选 DNA 结合蛋白的研究中具有
可行性。由于应用方案二筛选 DNA探针结合酵母细
胞的效率较高, 因此, 在利用酵母表面展示系统筛
选烟草 PMT 基因启动子 GAG 片段结合蛋白的研究
中采用了方案二的试验体系。
2.3 PMT基因启动子 GAG片段结合蛋白的酵母
表面展示系统筛选
利用启动子元件分析比较详细的烟草尼古丁合
成基因 PMT 启动子的茉莉素应答核心元件 GAG 片
段作为 DNA探针, 对烟草 cDNA酵母表面展示文库
进行了筛选。由于烟草尼古丁在根部合成, 且 PMT
基因受茉莉素诱导表达[15-16,18-20,22,27], 因此, cDNA
酵母表面展示文库的构建选用从茉莉素处理的烟草

表 1 DNA结合蛋白筛选对照试验结果
Table 1 Result of DNA-binding protein isolation
方案一 Strategy I 方案二 Strategy II
阴性对照
Negative control
阳性对照
Positive control
阴性对照
Negative control
阳性对照
Positive control
YPD 70±13 113±24 89±14 184±42
SD/–Ura/–Trp 5±4 32±11 7±3 116±17
2086 作 物 学 报 第 40卷


图 3 酵母生长情况
Fig. 3 Growth of yeast cells

根中提取的总 RNA 以增加 PMT 基因调控因子在酵
母表面展示文库中的比例。按照方案二的试验体系
对烟草根 cDNA 酵母表面展示文库进行了2次筛选,
每次筛选约1×107酵母细胞。为更好地去除非特异结
合细胞, 在筛选中用1×buffer 洗涤了4次。通过2次
筛选共获得约180个阳性克隆 , 对阳性克隆载体中
插入的 cDNA 片段长度分析后对其中80个克隆进行
了测序分析, 其中有 bHLH转录因子基因 1个, ERF
转录因子基因 2个, 这 2类转录因子可能与 GAG片
段中的 G-box 和 GCC-box-like 元件互作; 在其余克
隆中还有 1 个 MYB 转录因子基因及一些非转录因
子基因。
2.4 筛选出的 ERF 转录因子的原核蛋白表达及
纯化
为验证筛选出的 DNA 结合蛋白与所用 DNA 探
针的特异结合, 通过蛋白与 DNA 的体外结合试验检
测了筛选的 ERF转录因子与 GAG片段的相互作用。
将筛选到的 ERF转录因子的DNA结合域分别克隆到
pET28b 载体中与载体的 6×His 标签融合, 并导入大
肠杆菌 BL21 中, 进行原核蛋白诱导表达。同时, 将
前期报道的 GAG片段结合蛋白MYC2a[24]的 DNA结
合域按照文献所述方法进行原核蛋白诱导表达, 作
为检测转录因子蛋白与 GAG片段互作的阳性对照。
经过 IPTG 诱导原核蛋白表达后, 利用 Ni2+离子琼脂
糖树脂对含有上述蛋白表达载体的大肠杆菌 BL21细
胞裂解物进行纯化, 获得相应纯化蛋白。图 4所示为
克隆到的 2 个 ERF 转录因子的序列结构。图 5 所示
为纯化的 ERF转录因子及 MYC2a转录因子蛋白。

图 4 ERF转录因子的序列结构
Fig. 4 Sequences of ERF transcription factors
灰色背景部分为 ERF结构域。Sequences in gray block are the ERF domains.
第 12期 陈 红等: 酵母表面展示系统的改进及其在筛选烟草 PMT基因启动子结合蛋白中的应用 2087



图 5 ERF转录因子的蛋白表达纯化
Fig. 5 Purified proteins for ERF transcription factors
Marker为蛋白分子量标准。
Marker indicates protein molecular weight marker.

2.5 筛选出的 ERF转录因子与 PMT基因启动子
GAG探针的体外结合
Gel-shift (凝胶迁移率滞阻实验)是体外检测蛋
白与 DNA 互作的主要方法。在获得筛选到的 ERF
转录因子及阳性对照 MYC2a转录因子 DNA结合域
的原核表达蛋白后, 利用生物素标记的GAG片段作
为 DNA 探针, 通过 Gel-shift 试验检测这些蛋白与
GAG 片段的相互作用。如图 6 所示, 无蛋白的泳道
没有滞阻条带, 有 MYC2a 转录因子 DNA 结合域蛋
白的阳性对照泳道及有 ERF 转录因子 DNA 结合域
蛋白的泳道都有滞阻条带。这些结果说明筛选到的
ERF转录因子可以与GAG片段互作, 也表明本研究
建立的酵母表面展示系统试验体系可以成功应用于
DNA结合蛋白的筛选。
2.6 筛选出的 ERF转录因子与 PMT基因启动子
GAG片段在酵母中的互作分析
将 MYC2a、ERF71和 ERF72分别导入 GAG片

图 6 ERF转录因子与 GAG片段的体外互作分析
Fig. 6 Interaction in vitro between ERF transcription factors
and GAG fragment
Control: 未加蛋白阴性对照; MYC2a: 阳性对照。
Control: negative control without protein; MYC2a: positive control.
段的酵母单杂交报告菌株, 检测其与GAG片段的相
互作用。图 7 所示, 分别导入 MYC2a、ERF71 和
ERF72的酵母均无法在含 15 mmol L–1 3-AT的 SD/–
Leu/–Ura/–His/3-AT 营养缺陷型培养基上生长 (图
7-B), 而且在无 3-AT 的 SD/–Leu/–Ura/–His 营养缺
陷型培养基上生长的菌落也无法激活 β-半乳糖苷酶
报告基因的表达(图 7-C)。表明 ERF71 和 ERF72 同
MYC2a一样虽然可在体外试验中与 GAG片段结合,
但都不能在酵母单杂交试验中与 GAG片段互作。

图 7 ERF转录因子与 GAG片段在酵母中的互作分析
Fig. 7 Interaction in vivo between ERF transcription factors
and GAG fragment
A: 酵母在 SD/–Leu/–Ura/–His培养基上的生长; B: 酵母在
SD/–Leu/–Ura/–His/3-AT培养基上的生长; C: β-半乳糖苷酶活性
分析; D: 平板上的酵母菌株分布图; MYC2a为 GAG结合蛋白
对照。
A: growth of yeast on SD/–Leu/–Ura/–His plate; B: growth of yeast
on SD/–Leu/–Ura/–His/3-AT plate; C: β-galactopyranoside activity
assay; D: labeling of yeast strains; MYC2a is used as a control that
binds GAG fragment.
3 讨论
酵母表面展示系统将外源蛋白展示在细胞表面,
在克服酵母内源因子干扰方面具有独特优势。将酵
母表面展示系统应用于DNA结合蛋白筛选, 可以克
服酵母单杂交系统的不足, 提高对易受酵母内源干
扰 DNA结合蛋白的筛选效率。然而, 酵母表面展示
系统的应用目前还主要局限于蛋白间相互作用研究
及蛋白结合小分子的筛选[5,9,14], 并未在 DNA 结合
蛋白筛选研究中得到广泛应用, 这在一定程度上受
到现有酵母表面展示系统的文库构建困难及筛选试
验体系不成熟的影响。本研究对酵母表面展示系统
常用载体 pYD1进行了改造, 如图 2所示, 改造后获
得的 pYD1-Rec 载体具有 Clontech 公司的 Smart
2088 作 物 学 报 第 40卷

cDNA 文库构建系统所需的全部载体元件, 可以与
之相匹配, 完成 cDNA 酵母表面展示文库的构建,
从而简化了酵母表面展示文库的构建步骤, 降低了
其构建难度, 并提高了构建效率。同时, 本研究利用
结构分析比较清楚的烟草PMT基因启动子茉莉素应
答核心元件 GAG 片段作为 DNA 探针, 以前期证明
的 GAG 片段结合蛋白 MYC2a 作为阳性对照, 通过
对 2种试验方案的 DNA结合蛋白分离效率比较, 建
立了一个比较高效的利用酵母表面展示系统分离
DNA 结合蛋白的试验体系。在该试验体系中, 先将
带链亲和素的磁珠与生物素标记DNA探针结合, 并
以 EBY100酵母菌液封闭磁珠和DNA探针复合物的
非特异结合位点, 然后, 用该复合物从表达表面展
示蛋白的酵母细胞中分离结合 DNA 探针的酵母细
胞。与先让 DNA探针和酵母细胞结合, 然后用链亲
和素磁珠分离结合 DNA 探针的酵母细胞的试验方
案相比, 该方案的优点可能在于DNA与磁珠的预先
结合降低了试验体系对 DNA 探针和磁珠之间相互
作用的干扰, 从而提高了磁珠对结合酵母DNA探针
的分离效率。上述两方面的研究工作为酵母表面展
示系统在 DNA 结合蛋白筛选研究中的应用奠定了
技术基础。
在利用改进的酵母表面展示系统进行的 DNA
结合蛋白筛选应用研究中, 我们对烟草 PMT基因启
动子 GAG片段的 DNA结合蛋白进行了筛选。PMT
基因启动子GAG片段的结构分析比较清楚, 但是其
DNA 结合蛋白的酵母单杂交筛选效率极低, 即使一
些已经证明的 GAG 片段结合蛋白也无法在酵母单
杂交体系中激活报告基因表达(图 6)[23-24]。一个可以
克服酵母内源干扰的 DNA 结合蛋白筛选系统, 对
PMT基因启动子结合蛋白的分离及分子调控机制研
究具有重要推动作用。本研究以 GAG 片段为 DNA
探针对烟草根 cDNA 酵母表面展示文库进行筛选,
并获得若干转录因子蛋白, 其中包括 2个可能结合
GAG 片段 GCC-like-box 的 ERF 转录因子。通过
Gel-shift 试验证明这 2 个 ERF 转录因子可与 GAG
片段互作。然而, 在酵母单杂交试验中, 这 2个 ERF
转录因子与 MYC2a 一样, 无法在酵母中结合 GAG
片段并激活由 GAG片段操纵的报告基因表达。这一
研究结果充分证明酵母表面展示系统可以有效克服
酵母内源干扰, 弥补酵母单杂交技术的不足, 用于
分离以酵母单杂交系统无法筛选的 DNA 结合蛋白,
因此, 该研究为易受酵母内源因子干扰DNA结合蛋
白的筛选提供了一个新路径。
4 结论
在改造蛋白表达载体 pYD1 基础上, 建立了以
酵母表面展示系统筛选 DNA 结合蛋白的试验体系,
并成功应用这一系统对烟草PMT基因启动子茉莉素
应答核心元件 GAG片段的 DNA结合蛋白进行了筛
选, 获得若干在体外结合GAG片段但不能在酵母中
结合 GAG片段的 DNA结合蛋白。研究结果表明酵
母表面展示系统可以克服内源干扰, 弥补酵母单杂
交技术在 DNA结合蛋白筛选方面的不足。
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