全 文 ：第 １３卷第 ６期
２０１５年 １１月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ６
Ｎｏｖ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０６􀆰 ００２
收稿日期：２０１３－０３－２７
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１１ＡＡ０２Ａ２０５、２０１２ＡＡ０２１２０１）；教育部新世纪优秀人才支持计划（ＮＣＥＴ－１１－０６６５）
作者简介：汪兆峰（１９８７—），男，山东济南人，硕士研究生，研究方向：生物工程；石贵阳（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｇｙｓｈｉ＠ ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ
酿酒酵母产 Ｄ 乳酸重组菌的构建与发酵
汪兆峰，石贵阳，张　 梁
（江南大学 工业生物技术教育部重点实验室 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡 ２１４１２２）
摘　 要：采用基因工程方法对酿酒酵母进行代谢改造，使酵母产生乳酸代谢途径。 将来源于 Ｌ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ 和
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ的 Ｄ 乳酸脱氢酶基因，分别插入带有 Ｇ４１８抗性的酵母穿梭质粒 ｐＹＸ２１２ ｋａｎＭＸ上，电转化酵母，得到 ２株
生产 Ｄ 乳酸的酿酒酵母重组菌 Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＷＥ１５１０ 和 Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＷＢ１１８６。 进一步摇瓶发酵试验表明：重组菌
Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＷＢ１１８６在 ＹＥＰＤ培养基、２０ ｇ ／ Ｌ糖、ｐＨ ５的条件下生长条件最好，并具有更好的产乳酸能力。 经 ３ Ｌ
发酵罐条件下验证，Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＷＢ１１８６分批发酵 ９６ ｈ，最终乳酸积累量达到 １８􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ；发酵条件为培养基 ＹＥＰＤ，
接种量 １０％，溶解氧（ＤＯ）３０％，转速 １５０ ｒ ／ ｍｉｎ，初始葡萄糖质量浓度 １０ ｇ ／ Ｌ，控制 ｐＨ ５􀆰 ０，通气量 ３ Ｌ ／ ｍｉｎ，ＯＤ６００最
大值转为厌氧发酵。
关键词：Ｄ 乳酸；Ｄ 乳酸脱氢酶；Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ；酿酒酵母；代谢改造
中图分类号：ＴＱ８１２　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０６－０００６－０７
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｆｏｒ
Ｄ⁃ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ＷＡＮＧ Ｚｈａｏｆｅｎｇ，ＳＨＩ Ｇｕｉｙａｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｌｉａｎｇ
（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃｅｒｅａｌ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｅ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ，ｗｉｔｈ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ
ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ． Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｄｌｄｈ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｌ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｎｄ Ｅ． ｃｏｌｉ，
ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｙｅａｓｔ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ＰＹＸ２１２⁃ｋａｎＭＸ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＹＸ２１２⁃ｋａｎＭＸ⁃ＤＬＤＨ ｗａｓ
ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ Ｗ３０３⁃１Ａ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｗｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＷＥ１５１０
ａｎｄ Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＷＢ１１８６． Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ， ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｄ⁃ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｙｅａｓｔ ＷＢ１１８６ ｗａｓ
ｏｂｔａｉｎｅｄ，ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ａ ｂｅｔｔｅｒ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ Ｄ⁃ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ． Ｉｔ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ １８􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ
ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ３⁃Ｌ ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ９６ ｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ＹＥＰＤ， ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ ｒａｔｅ １０％， ＤＯ ３０％， ｓｔｉｒｒｉｎｇ ｒａｔｅ １５０
ｒ ／ ｍｉｎ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ １０ ｇ ／ Ｌ，ｐＨ ５􀆰 ０， ａｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ３ Ｌ ／ ｍｉｎ，ｗｈｅｎ ＯＤ６００ ｕｐ ｔｏ ｍａｘｉｍｕｍ， ｔｈｅ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗａｓ ｔｕｒｎｅｄ ｔｏ ａｎａｅｒｏｂｉｃ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｄ⁃ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ；ＤＬＤＨ；Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ
　 　 乳酸是自然界最小的手性分子，全世界近 ８０％
的厂家采用直接发酵法生产光学纯度 Ｌ 乳酸［１］。
Ｄ 乳酸是合成多种手性物质的前体，在医药、农药、
化工等方面的应用十分广泛［２－５］。 目前，世界乳酸
的总生产能力为 ２５万 ｔ ／年，总产量为 １３ 万ｔ ／年，并
以每年 ６％ ～ ８％递增，总消费量为 １０ 万ｔ ／年，Ｄ 乳
酸的市场前景广阔［６－７］。
Ｄ 乳酸的生产通常采用乳酸菌属的细菌，例如
乳酸杆菌，已有报道利用纤维素［８］和大米淀粉［９］为
原料生产 Ｄ 乳酸；另一方面，由于乳酸细菌难以在
高密度下培养，并且大多表现为生长营养缺陷，基
因工程改造的大肠杆菌产 Ｄ 乳酸渐渐发展起
来［１０－１１］。 Ｄ 乳酸发酵合成过程中，为了平衡不断
降低的 ｐＨ，常需要补加中和剂，如 ＣａＣＯ３、ＮａＯＨ、
Ｃａ（ＯＨ） ２等来中和所产生的乳酸［１２］。 而在产物提
取过程中，又需要用浓 Ｈ２ＳＯ４ 将乳酸盐进行酸化，
置换出乳酸，同时形成大量 ＣａＳＯ４的废杂，对环境造
成极大的污染［１３］。 酵母菌能够耐受较低的 ｐＨ 环
境，为开发在不补加中和碱的工艺下进行有机酸发
酵的工业菌种提供了可能［１４－１５］。 Ｉｓｈｉｄａ 等［１６］在酿
酒酵母菌株的染色体上整合 ２ 个拷贝的来自
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ的 ｄｌｄｈ编码基因，同时替换
掉丙酮酸脱羧酶编码基因 ｐｄｃ１，所获得的重组菌株
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＩＬＭ ２Ｂ 在补加碱中和发
酵液 ｐＨ的条件下，Ｄ 乳酸产量为 ６１􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ，发酵结
束时 ｐＨ为 ２􀆰 ８，糖酸转化率达到 ０􀆰 ６１２；在不补加碱
的发酵条件下，可发酵 ５３０ ｇ ／ Ｌ 的葡萄糖合成 ５４􀆰 ２
ｇ ／ Ｌ游离 Ｄ 乳酸，其产物光学纯度在 ９９􀆰 ９％以上。
此外，在马克斯克鲁维重组酵母 Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
ｍａｒｘｉａｎｕｓ ＣＤ５９０中异源表达 ＤＬＤＨ，也可发酵合成较
高浓度的 Ｄ 乳酸，且产酸速率较快［１５，１７］。
笔者以酿酒酵母为宿主菌，采用基因工程技术
构建可有效生产 Ｄ 乳酸的重组酵母，以期为利用
酵母发酵生产 Ｄ 乳酸进行有益探索。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌株与质粒
菌株 Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ Ｂ１１８６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ １５１０、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｗ３０３ １Ａ来源于中
国普 通 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中 心 （ ＣＧＭＣＣ
ＮＯ􀆰 １􀆰 １０３２７、ＮＯ􀆰 １􀆰 ８７３２和 ＮＯ􀆰 ２􀆰 ３８５３）；质粒载体 ｐＹＸ
２１２ ｋａｎＭＸ保存于工业生物技术教育部重点实验室。
１􀆰 １􀆰 ２　 培养基
ＹＥＰＤ培养基（ ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０，蛋白胨 ２０，酵
母膏 １０。 用于固体培养基时添加 １５ ～ ２０ ｇ ／ Ｌ 琼脂
粉；挑选转化子时添加 ２００ μｇ ／ ｍＬ 的 Ｇ４１８ 抗生素。
ＬＢ培养基（ ｇ ／ Ｌ）：ＮａＣｌ １０，蛋白胨 １０，酵母膏
５。 用于固体培养基时添加 ２０ ｇ ／ Ｌ 琼脂粉；挑选转
化子时添加终质量浓度为 ３０ μｇ ／ ｍＬ 的卡那霉素。
发酵培养基 １（ ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０，酵母膏 １０，蛋
白胨 ２０， （ ＮＨ４ ） ２ ＳＯ４ ５，ＭｇＳＯ４ ６􀆰 ５， Ｋ２ ＨＰＯ４ １􀆰 ５，
ＣａＣｌ２ ０􀆰 ５５ ｇ ／ Ｌ，ＮａＮＯ３ １，ＫＣｌ １，ＦｅＳＯ４ １［１８］。
发酵培养基 ２ （ ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０，酵母膏 １０，
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５，ＭｇＳＯ４ ６􀆰 ５，ＣａＣｌ２ ２􀆰 ０，ＫＨ２ＰＯ４ １􀆰 ５［１８］。
发酵培养基 ３（ ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０，蛋白胨 １５，酵
母粉 ２５，ＫＨ２ＰＯ４ ２􀆰 ４，Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ １６􀆰 ３４［１９］。
１􀆰 １􀆰 ３　 酶和试剂
Ｔａｑ酶、Ｔ４ 连接酶、限制性内切酶，购自大连
ＴａＫａＲａ公司；引物由上海生工技术服务有限公司
合成。
１􀆰 ２　 方法［２０］
１􀆰 ２􀆰 １　 细菌染色体的提取
取菌悬液 １􀆰 ５ ｍＬ，１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ２ ｍｉｎ，收
集菌体，无菌水洗涤 ２次，无菌水 ６００ μＬ，加 １０ ～ ２０
μＬ溶菌酶，轻轻混匀，３７ ℃培养箱放置 ３０ ｍｉｎ。 向
其中加入 ６０ μＬ ２００ ｇ ／ Ｌ 十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）溶
液混匀，立刻加入蛋白酶 Ｋ １０ μＬ，（注：前后时间不
得超过 ２ ｍｉｎ），６５ ℃水浴 ２ ～ ６ ｈ。 温浴完毕，加入
等体积的苯酚、氯仿（各 ３００ μＬ）振荡，１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ
离心 １０ ｍｉｎ。 取上清，再加入等体积的酚，氯仿抽
提，进行 ２ ～ ４ 遍。 取上清，加 １００％乙醇沉淀染色
体，待烘干后加 ３０ ～ ５０ μＬ 水溶解作为 ＰＣＲ 模板
待用。
１􀆰 ２􀆰 ２　 目的基因的 ＰＣＲ 扩增及克隆
根据 Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ Ｄ 乳酸脱氢酶基
因（ ｄｌｄｈ） 序列 （ ＧｅｎＢａｎｋ： Ｌ２９３２７􀆰 １ ） 设计引物。
ｄｌｄｈｂ１１８６ Ｕ：５′ ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴ⁃
ＧＣＴＴＡＣＧＧＣ ３′，ｄｌｄｈｂ１１８６ Ｄ：５′ ＡＣＧＣＧＴＣＧＡ⁃
ＣＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＴＡＧＣ ３′（下划线所示
分别为 ＢａｍＨⅠ、ＳａｌⅠ酶切位点）。 ＰＣＲ 反应体系
体积为 ５０ μＬ，扩增条件：９６ ℃预变性 ５ ｍｉｎ；９５ ℃
变性 ３０ ｓ，５３ ℃退火 ６０ ｓ，７２ ℃延伸 ９０ ｓ，共 ２５ 个
循环；最后 ７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎ。
根据 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｄ 乳酸脱氢酶基因（ｄｌｄｈ）
序列 （ ＧｅｎＢａｎｋ： Ｕ３６９２８ ） 设计引物如下。 ｄｌｄｈｅ
１５１０ Ｕ：５′ ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＣＴＣＧＣＣＧＴＴＴ⁃
ＡＴＡＧＣ ３′，ｄｌｄｈｅ１５１０ Ｄ：５′ ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡ⁃
ＡＣＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＧＧＧ ３′ （下划线所示分别为
ＥｃｏＲⅠ、ＢａｍＨⅠ酶切位点）。 ＰＣＲ 反应体系体积为
７　 第 ６期 汪兆峰等：酿酒酵母产 Ｄ 乳酸重组菌的构建与发酵
５０ μＬ，扩增条件：９５ ℃预变性 ５ ｍｉｎ；９４ ℃变性 ３０
ｓ，５５ ℃退火 ６０ ｓ，７２ ℃延伸 ６０ ｓ，共 ３０ 个循环；最
后 ７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎ。
１􀆰 ２􀆰 ３　 质粒的构建
将 ＰＣＲ 获得的 Ｄ 乳酸脱氢酶基因分别用
ＢａｍＨⅠ和 ＳａｌⅠ双酶切，ＥｃｏＲⅠ和 ＢａｍＨⅠ双酶切，
经纯化后与经同样酶切的质粒 ｐＹＸ２１２ ｋａｎＭＸ 连
接，按照质量比 １ ∶ １０ 的比例加入 １０ μＬ 连接体系，
于 １６ ℃培养箱连接过夜。 次日 ４２ ℃热击 ９０ ｓ 转
化 Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ 感受态细胞。 ３７ ℃温育 １ ｈ，涂布
终质量浓度 １００ μｇ ／ ｍＬ卡那霉素 ＬＢ 抗性平板，３７
℃培养 １０ ｈ。 挑取转化子，用引物进行菌落 ＰＣＲ，挑
取菌落 ＰＣＲ正确的转化子提取质粒，然后酶切验证
目的基因的大小。 构建重组质粒 ｐＹＸ ２１２ ｋａｎ ＭＸ
ｄｌｄｈｂ１１８６与 ｐＹＸ ２１２ ｋａｎＭＸ ｄｌｄｈｅ１５１０。 将验证
正确的转化子送华大基因进行测序。 电转化 Ｓ􀆰
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｗ３０３ １Ａ挑选转化子。
１􀆰 ２􀆰 ４　 酵母转化
将酵母接种于 ２０ ｍＬ 液体 ＹＥＰＤ 培养基，３０
℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ 培养过夜；转接 １０％ 菌液于 ５０ ｍＬ
ＹＥＰＤ 培养基中，３０ ℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ 培养 ８ ～ １０ ｈ；将
菌液冰浴 ３０ ｍｉｎ，４ ℃冷冻离心机中 ５ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离
心 ５ ｍｉｎ，收集菌体；弃上清，加入一定量提前预冷的
无菌水洗涤菌体，离心收集菌体；弃上清，加入一定
量提前预冷的山梨醇溶液（１ ｍｏｌ ／ Ｌ）洗涤菌体，离心
收集菌体；重复 ３次，离心收集菌体，吸净上清，加入
０􀆰 ２ ｍＬ 预冷的山梨醇混匀菌体；取 ０􀆰 ２ ｍＬ 菌悬液
分装 １􀆰 ５ ｍＬ 离心管，加入 ５０ μＬ 质粒 ＤＮＡ，混匀，
冰浴 １０ ｍｉｎ，将菌悬液全部转入已预冷的电转杯中，
１ ５００ Ｖ、５ ｍｓ电击 １ 次；电转之后立刻取出，用等体
积的 １ ｍｏｌ ／ Ｌ 山梨醇溶液将转化菌从电转杯中洗
出，取 １００ μＬ 涂布抗性平板。
１􀆰 ２􀆰 ５　 转化子验证
在 Ｇ４１８抗性平板上挑取较大的转化子，点种
高抗性平板传代培养，置 ３０ ℃培养箱培养 ３ ～ ５ ｄ；
挑取高抗性转化子转至 ０􀆰 ５ ｍＬ 离心管中，加水 ３０
μＬ混匀，沸水煮 １０ ｍｉｎ作为模板，进行菌落 ＰＣＲ验
证是否转入 Ｄ 乳酸脱氢酶基因。
１􀆰 ２􀆰 ６　 发酵 ＨＰＬＣ验证
１）种子液制备　 将 ＰＣＲ 验证得到的转化子接
种入 ＹＥＰＤ 培养基中（５０ ｍＬ 三角瓶，２０ ｍＬ 装液
量），加 Ｇ４１８至终质量浓度 ２００ μｇ ／ ｍＬ，培养 ２４ ｈ。
２）发酵液制备 　 接种种子液于发酵培养基
（２５０ ｍＬ 三角瓶，５０ ｍＬ 装液量），接种量 １０％，３０
℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ培养 ２４ ｈ，转入厌氧发酵，瓶口保鲜膜
密封，３０ ℃培养箱静置 ２ ～ ３ ｄ。 定时取样，高效液
相色谱法（ＨＰＬＣ）测定是否有乳酸。
３）分析方法　 生长量测定方法：对不同时间发
酵液取样，稀释一定倍数后用 ７２１ 型分光光度计于
６００ ｎｍ 处测其吸光值 ＯＤ６００。 残糖测定方法：生物
传感仪测定发酵液内残糖含量。 ＨＰＬＣ 法测定有机
酸：发酵液经 １２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎ，取 ７００ μＬ 上
清液加入 ７００ μＬ １０％的三氯乙酸，沉淀蛋白质 ２ ｈ
以上后，１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １５ ｍｉｎ，０􀆰 ４５ μｍ 混纤微
孔滤膜过滤后，通过 ＨＰＬＣ 进行测定。 分析条件为
色谱柱 Ｓｈｏｄｅｘ ＫＣ ８１１，流动相 ０􀆰 ０１ ｍｏｌ ／ Ｌ Ｈ２ＳＯ４，
流速 ０􀆰 ８ ｍＬ ／ ｍｉｎ，进样量 １５ μＬ，柱温 ６０ ℃，紫外检
测器，检测波长 ２１０ ｎｍ。
１􀆰 ２􀆰 ７　 重组菌摇瓶发酵实验
１）种子液制备 　 将重组菌从 ＹＥＰＤ 抗性平板
上刮取一单菌落至 ＹＥＰＤ 液体培养基（５０ ｍＬ 三角
瓶，装液量为 １０ ｍＬ）中，添加 Ｇ４１８ 至终质量浓度
２００ μｇ ／ ｍＬ，３０ ℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ 培养 ２４ ｈ，即为种子
液，转接发酵液时接种量为 １０％。
２）培养基对转化子生长的影响 　 接种转化子
Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｗ３０３ １Ａ ／ ｐＹＸ２１２ ｋａｎＭＸ ｄｌｄｈｂ１１⁃
８６（ＷＢ１１８６）和 Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｗ ３０３ １Ａ ／ ｐＹＸ２１２
ｋａｎＭＸ ｄｌｄｈｅ１５１０（ＷＥ１５１０）分别于发酵培养基 １、
２、３和 ＹＥＰＤ中，３０ ℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ 培养 ４８ ｈ，每隔 ６
ｈ取样，于分光光度计 ６００ ｎｍ 处测定其生长情况，
Ｗ３０３ １Ａ作为空白对照。
３）糖浓度对转化子生长的影响　 采用 ＹＥＰＤ培
养基，以葡萄糖作为碳源，接种转化子 ＷＢ１１８６ 与
ＷＥ１５１０于初始糖质量浓度为 ２０、６０、１００、１４０、１８０和
２００ ｇ ／ Ｌ的培养基，３０ ℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ 培养 ４８ ｈ，每隔 ６
ｈ取样，于分光光度计 ６００ ｎｍ处测定其生长情况。
４）ｐＨ对转化子生长的影响　 采用初始糖质量
浓度 ２０ ｇ ／ Ｌ 的 ＹＥＰＤ 培养基，用乳酸调节培养基
ｐＨ分别为 ３、４、５、６ 和 ７，接种转化子 ＷＢ１１８６ 与
ＷＥ１５１０，３０ ℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ 培养 ４８ ｈ，每隔 ６ ｈ取样，
于分光光度计 ６００ ｎｍ处测定其生长情况。
５）转化子乳酸耐受性 　 ＹＥＰＤ 培养基，２０ ｇ ／ Ｌ
初始糖，初始 ｐＨ 为 ５，接种转化子 ＷＢ１１８６ 于分别
添加乳酸 ５、１０、１５、２０ 和 ２５ ｇ ／ Ｌ 的培养基，３０ ℃、
１５０ ｒ ／ ｍｉｎ 培养 ４８ ｈ，每隔 ６ ｈ 取样，于分光光度计
６００ ｎｍ处测定其生长情况。
８ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
１􀆰 ２􀆰 ８　 重组菌 ３ Ｌ罐发酵实验
１）种子液制备　 将重组菌ＷＢ１１８６从 ＹＥＰＤ 抗
性平板上刮取一单菌落至 ＹＥＰＤ 液体培养基（２５０
ｍＬ 三角瓶，装液量为 ５０ ｍＬ） 中，添加 Ｇ４１８至终质
量浓度 ２００ μｇ ／ ｍＬ，３０ ℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ 培养 ２４ ｈ，即为
种子液，转接发酵液时接种量为 １０％。
２）３ Ｌ 发酵罐初步发酵试验　 发酵采用 ＹＥＰＤ
培养基，装液量 ２ Ｌ，控制发酵温度 ３０ ℃，ｐＨ控制在
５（１００％氨水调节），溶氧（ＤＯ）维持在 ３０％左右，转
速 １５０ ｒ ／ ｍｉｎ；当菌体达到一定 ＯＤ 不再生长后，其
他条件不变，停止通气，转为厌氧发酵，厌氧发酵时
间 ７２ ｈ；整个过程中葡萄糖为碳源，发酵液糖浓度控
制在 ２％以下。 每隔一定时间取样，ＯＤ６００测定生长
情况，测定残糖，计算耗糖速率；发酵液经处理后，４
℃放置 ２ ｈ以上，ＨＰＬＣ法测定乳酸含量。
３）３ Ｌ 发酵罐延长厌氧发酵试验 　 同以上条
件，延长厌氧发酵时间至 １４０ ｈ，并用 ＨＰＬＣ 法测定
酒精含量。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 产乳酸酿酒酵母菌株构建
２􀆰 １􀆰 １　 Ｄ 乳酸脱氢酶基因的获得
通过游离表达将乳酸脱氢酶 ＤＬＤＨ 基因引入
酿酒酵母 Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｗ３０３ １Ａ，使其可以再生
ＮＡＤＨ，酵母体内代谢碳流一部分转向乳酸生成途
径，使胞内丙酮酸直接还原为乳酸，导致乙醇和乳
酸同时积累。 分别以 Ｅ． ｃｏｌｉ 和Ｌ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ的乳
酸脱氢酶基因为模板，ＰＣＲ 扩增获得乳酸脱氢酶基
因 ｄｌｄｈｅ１５１０和 ｄｌｄｈｂ１１８６。
Ｍ—ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒ；１—ｄｌｄｈｂ１１８６；２—ｄｌｄｈｅ１５１０
图 １　 ＤＬＤＨ基因电泳图
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
扩增的琼脂糖电泳图谱如图 １所示。 由图 １ 可
知：２种来源的基因经 ＰＣＲ 扩增后，在约 １ ０００ ｂｐ
处均有单一的扩增片段，与目的基因片段大小（９９６
ｂｐ）基本一致，经测序验证，２ 条基因片段为乳酸脱
氢酶基因 ｄｌｄｈｅ１５１０和 ｄｌｄｈｂ１１８６。
２􀆰 １􀆰 ２　 乳酸脱氢酶基因表达质粒的构建
选择阳性克隆子提取质粒，对 ｐＹＸ２１２ ｋａｎ
ＭＸ ｄｌｄｈｂ１１８６ 进行 ＢａｍＨⅠ、ＳａｌⅠ双酶切，对 ｐＹＸ２１２
ｋａｎＭＸ ｄｌｄｈｅ１５１０进行 ＥｃｏＲⅠ、ＢａｍＨⅠ双酶切，结果如
图 ２所示。 图 ２结果显示重组质粒构建成功。
１—ＢａｍＨⅠ和 ＳａｌⅠ双酶切质粒 ｐＹＸ ２１２ ｋａｎＭＸ ｄｌｄｈｂ１１８６结果；
２—ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒ；３—标准 ＤＮＡ；４—ＥｃｏＲⅠ和 ＢａｍＨⅠ双酶切质粒
ｐＹＸ ２１２ ｋａｎＭＸ ｄｌｄｈｅ１５１０ 的结果
图 ２　 重组质粒双酶切电泳
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ
２􀆰 １􀆰 ３　 电转化及验证
Ｍ—ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒ；１—Ｗ３０３ １Ａ；２—ＷＢ１１８６；３—ＷＥ１５１０
图 ３　 菌落 ＰＣＲ验证
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
通过电转化构建的质粒 ｐＹＸ２１２ ｋａｎＭＸ
ｄｌｄｈｂ１１８６ 与 ｐＹＸ２１２ ｋａｎＭＸ ｄｌｄｈｅ１５１０ 到 Ｓ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｗ３０３ １Ａ，转化后的酵母涂布在含 ２００
μｇ ／ ｍＬ Ｇ４１８ 抗生素的 ＹＥＰＤ 平板上，挑选转化子
进行菌落 ＰＣＲ 扩增，电泳验证，结果如图 ３ 所示。
由图 ３可知，２株重组菌均得到大小 １ ０００ ｂｐ 左右
片段，而原始菌 Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｗ３０３ １Ａ 没有，证明
已成功转入重组质粒。
９　 第 ６期 汪兆峰等：酿酒酵母产 Ｄ 乳酸重组菌的构建与发酵
２􀆰 ２　 产乳酸酵母发酵性能的研究
为对比不同 Ｄ 乳酸脱氢酶来源的产乳酸酵母
ＷＥ１５１０和 ＷＢ１１８６ 的产乳酸能力，利用摇瓶发酵
进行初步探究。 因为 Ｄ 乳酸是在厌氧的情况下积
累，此时菌体已经基本停止生长，故在转厌氧前积
累较高的 ＯＤ，有利于乳酸的积累，以下为在摇瓶发
酵条件下确定转化子的最优生长条件。
２􀆰 ２􀆰 １　 转化子在不同培养基中的生长情况
比较重组菌在多种培养基中的生长情况，结果
如图 ４所示。 由图 ４ 可知，２ 株重组菌在 ＹＥＰＤ 培
养基中生长情况最好，培养约 ５０ ｈ时，ＯＤ值分别达
到 １３􀆰 ３和 １３􀆰 ７，所以选择 ＹＥＰＤ 作为下一步研究
所用培养基。
图 ４　 转化子在不同培养基中的生长情况
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ
２􀆰 ２􀆰 ２　 转化子在不同糖浓度下的生长情况
在 ＹＥＰＤ培养基的基础上，比较重组菌在不同糖
浓度下的生长情况，结果如图 ５ 所示。 由图 ５ 可知，
重组菌在 ２０ ｇ ／ Ｌ糖培养基中的生长情况优于其他糖
浓度的，ＷＢ１１８６的最高 ＯＤ６００高于ＷＥ１５１０的。
图 ５　 转化子在不同糖浓度下生长情况
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｓｕｇａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
２􀆰 ２􀆰 ３　 转化子在不同 ｐＨ下的生长情况
在含糖质量浓度 ２０ ｇ ／ Ｌ 的 ＹＥＰＤ 培养基中，比
较重组菌在不同 ｐＨ条件下的生长情况，结果如图 ６
所示。 由图 ６可知，在 ｐＨ为 ５的培养基中，ＯＤ值能
达到最高值，ＷＢ１１８６的最高 ＯＤ６００高于ＷＥ１５１０的。
２􀆰 ２􀆰 ４　 转化子摇瓶发酵验证
对转化子进行初步发酵性能测试，ＹＥＰＤ培养基，
２０ ｇ ／ Ｌ糖，ｐＨ ５，３０ ℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ培养 ２４ ｈ，接种量为
１０％，之后保鲜膜封口转至培养箱厌氧发酵。 测定
ＷＢ１１８６与ＷＥ１５１０产乳酸情况，结果如图 ７所示。 由
图 ７可知，ＷＢ１１８６具有更好的产乳酸能力，所以选择
ＷＢ１１８６作为下一步上罐发酵的研究菌株。
０１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
图 ６　 不同 ｐＨ下转化子生长情况
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ
图 ７　 转化子摇瓶发酵验证
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ
ｉｎ ｔｈｅ ｆｌａｓｋ
２􀆰 ２􀆰 ５　 重组菌 ３ Ｌ罐发酵实验
上罐培养基 ＹＥＰＤ，溶氧 （ ＤＯ） ３０％，接种量
１０％， １５０ ｒ ／ ｍｉｎ，初始糖质量浓度 １０ ｇ ／ Ｌ，控制 ｐＨ
５，通气量 ３ Ｌ ／ ｍｉｎ，ＯＤ最大值时转为厌氧发酵，２ 个
阶段总发酵时间 ９６ ｈ。 定时取样测定菌体 ＯＤ 值、
乳酸浓度、耗糖速率，结果见图 ８。 由图 ８ 可知，最
终乳酸积累量达到 １８􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ。
图 ８　 重组菌 ３ Ｌ罐发酵实验
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｉｎ ａ ３⁃Ｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔａｎｋ
２􀆰 ２􀆰 ６　 重组菌 ３ Ｌ罐延长发酵时间发酵实验
上罐培养基 ＹＥＰＤ，溶氧（ＤＯ）３０％，接种量 １０％，
１５０ ｒ ／ ｍｉｎ，初始糖质量浓度 １０ ｇ ／ Ｌ，控制 ｐＨ ５，通气
量 ３ Ｌ ／ ｍｉｎ，ＯＤ最大值时转为厌氧发酵。 延长发酵
时间至 １４０ ｈ，定时取样测定菌体 ＯＤ６００值、乳酸浓
度、耗糖速率，Ｄ 乳酸积累量，结果如图 ９ 所示。 由
图 ９可知，乳酸最终积累量 １４􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ。 由此可知，单
纯延长发酵时间并不会使乳酸有效积累。
图 ９　 重组菌 ３ Ｌ罐延长发酵时间发酵实验
Ｆｉｇ􀆰 ９　 Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ３⁃Ｌ
ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇｅｒ ｔｉｍｅ
３　 结论
成功地将 Ｌ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ和 Ｅ． ｃｏｌｉ来源的 Ｄ 乳
酸脱氢酶基因在酿酒酵母中进行表达，构建了 ２株重
组菌 Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＷＥ１５１０和 Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＷＢ１１８６。 在
摇瓶发酵试验条件下，重组菌 Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＷＢ１１８６在
ＹＥＰＤ培养基、２０ ｇ ／ Ｌ糖和 ｐＨ５的条件下生长条件最
好，并具有更好的产乳酸能力。 选取 Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＷＢ１１８６进行下一步 ３ Ｌ发酵罐发酵验证。 ＹＥＰＤ培
养基、接种量 １０％、溶氧 ３０％、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ、初始葡萄糖
１１　 第 ６期 汪兆峰等：酿酒酵母产 Ｄ 乳酸重组菌的构建与发酵
质量浓度 １０ ｇ ／ Ｌ，控制 ｐＨ５，通气量 ３ Ｌ ／ ｍｉｎ，ＯＤ６００最
大值时转为厌氧发酵，在此分批发酵条件下，乳酸最
终积累量达到 １８􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ。
参考文献：
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ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ｗｉｔｈ ａ ｇｅｎｏｍｅ⁃ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｌ⁃ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ［ Ｊ］ ．Ａｐｐｌ
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Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０００，２６（２ ／ ３ ／ ４）：８７⁃１０７．
［１４］ 　 Ａｄａｃｈｉ Ｅ，Ｔｏｒｉｇｏｅ Ｍ，Ｓｕｇｉｙａｍａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｂｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｔａｔｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｔ ｌｏｗ ｐＨ ｖａｌｕｅ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｆｅｒｍｅｎｔ
Ｂｉｏｅｎｇ，１９９８，８６（３）：２８４⁃２８９．
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ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ
Ｂｉｏｅｎｇ，２００６，１０１（２）：１７２⁃１７７．
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ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ⁃ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｙｅａｓｔ： ＵＳ， ７５３４５９７ ［ Ｐ ］． ２００９⁃
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（责任编辑　 荀志金）
２１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷