全 文 ：第 １２卷第 ４期
２０１４年 ７月
生 物 加 工 过 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ １２ Ｎｏ ４
Ｊｕｌ ２０１４
ｄｏｉ：１０ ３９６９ ／ ｊ ｉｓｓｎ １６７２－３６７８ ２０１４ ０４ ００８
收稿日期：２０１３－０１－１４
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１１ＣＢ７０７４００）；江苏省普通高校研究生科研创新计划（ＣＸＺＺ１１＿０３５８）
作者简介：郑 璐（１９８６—），女，浙江台州人，博士研究生，研究方向：生物化工；何冰芳（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｂｉｎｇｆａｎｇｈｅ＠ ｎｊｔｅｃｈ ｅｄｕ ｃｎ
Ｄ 乳酸高产菌菊糖芽胞乳杆菌 Ｙ２ ８磷酸果糖激酶
基因在大肠杆菌中的克隆和表达
郑 璐１，柏中中１，许婷婷２，何冰芳１
（１ 南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 ２１１８００； ２ 南京中医药大学 基础医学院，南京 ２１００４６）
摘 要：以 Ｄ 乳酸高产菌菊糖芽胞乳杆菌 Ｙ２ ８基因组 ＤＮＡ为模板，通过 ＰＣＲ扩增得到 ９６０ ｂｐ的磷酸果糖激酶
基因（ｐｆｋ）。 氨基酸序列比对分析表明，该磷酸果糖激酶（ＰＦＫ）与其他乳酸菌 ＰＦＫ具有保守的底物结合位点，但是
其变构效应物结合位点存在差异。 将 ｐｆｋ基因克隆到表达载体 ｐＳＥ３８０上，获得重组菌 Ｅ ｐＳＥ ｐｆｋ。 进一步通过
诱导条件的优化，重组菌的 ＰＦＫ比酶活达到 ４ ８９ Ｕ ／ ｍｇ，是优化前的 ４ ７９倍。 采用低温诱导策略有助于实现菊糖
芽胞乳杆菌 ｐｆｋ基因在大肠杆菌中可溶性表达。
关键词：Ｄ 乳酸；大肠杆菌；菊糖芽胞乳杆菌；表达；优化；磷酸果糖激酶
中图分类号：Ｑ９３３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０４－００３７－０６
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ
Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＺＨＥＮＧ Ｌｕ１，ＢＡＩ Ｚｈｏｎｇｚｈｏｎｇ１，ＸＵ Ｔｉｎｇｔｉｎｇ２，ＨＥ Ｂｉｎｇｆａｎｇ１
（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｒｅ⁃ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００４６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ （ ｐｆｋ） ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｉｎｕｌｉｎｕｓ Ｙ２⁃８ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｓ ａ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｗａｓ ９６０ ｂｐ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ
ｔｈａｔ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ （ＰＦＫ） ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ，ＰＦＫ ｆｒｏｍ
Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ Ｙ２⁃８ ｈａｄ ｓｔｒｉｃｔｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ，ｂｕｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｓｉｔｅｓ Ｔｈｅ ｐｆｋ ｇｅｎｅ
ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｐＳＥ３８０，ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ Ｅ⁃ｐＳＥ⁃ｐｆｋ Ａｆｔｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ＰＦＫ
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｒｅａｃｈｅｄ ４ ８９ Ｕ ／ ｍｇ， ｔｈｕｓ ｉｔ ｗａｓ ４ ７９⁃ｆｏｌｄ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ
ｐｒｉｍａｒｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｌｏｗ⁃ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｈｅｌｐｆｕｌ ｔｏ ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｌｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＦＫ ｆｒｏｍ Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ ｉｎ Ｅ ｃｏｌｉ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｄ⁃ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；
ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ
Ｄ 乳酸是一种重要的手性中间体，已被用于多
种手性物质的合成。 近年来高光学纯度的 Ｄ 乳酸
因为其在合成耐热性更高、机械强度更好的聚乳酸
材料方面的实际应用极大地带动了 Ｄ 乳酸的生产
研究［１］。 微生物发酵法生产 Ｄ 乳酸，不仅可以解
决传统化学合成法成本高、分离困难等问题，还可
以摆脱对石化资源的依赖，减少环境污染［２］。 菊糖
芽胞乳杆菌（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ）是典型的同
型发酵 Ｄ 乳酸的优势菌株，适合大规模生产高纯
度的 Ｄ 乳酸。 国内外许多学者对该菌株的菌种改
良做了大量研究，取得了一定可喜的成效，但这些
研究主要通过诱变筛选结合发酵工艺的优化来获
得高产突变株，存在易退化和生产强度低等缺
陷［３－４］。 因此，这就需要对该菌株在分子水平上进
行解析，进而通过基因工程改造使之更适合于工业
化生产的要求。
磷酸果糖激酶 （ ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ， ＰＦＫ， ＥＣ
２ ７ １ １１）是糖酵解途径中的限速变构调控酶，以
ＡＴＰ 作为磷酸基供体催化 ６ 磷酸果糖（Ｆ ６ Ｐ）的
磷酸化［５］。 笔者所在课题组的前期研究发现，
Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ糖酵解代谢流和 Ｄ 乳酸产量提高的同时，
ＰＦＫ酶活也显著提高［３，６］。 Ａｎｄｅｒｓｅｎ 等［７］发现乳酸
乳球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＰＦＫ酶活的降低将直接导
致生长速率和糖酵解代谢流的强烈抑制。 但是，关于
Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ ＰＦＫ是如何调控糖酵解和 Ｄ 乳酸生产还
未见报道。 ＰＦＫ对糖酵解代谢流有重要调控作用，通
常不同生物来源的 ＰＦＫ 有不同的变构调控性质［５］。
一般细菌来源的 ＰＦＫ 是相对分子质量为３ ５×１０４左
右的同源四聚体，ＡＤＰ 或 ＧＤＰ 通过提高酶对底物 Ｆ
６ Ｐ 的亲和力激活该酶，同时磷酸烯醇式丙酮酸
（ＰＥＰ）对该酶具有显著的抑制作用［８］。
本研究中笔者克隆 Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ Ｙ２ ８ 的 ｐｆｋ 基
因，并在大肠杆菌进行异源表达，考察重组菌的 ＰＦＫ
比酶活变化，以期为后续对该酶进行纯化和变构调控
机制的研究奠定基础。
１ 材料与方法
１ １ 材料
１ １ １ 菌株与质粒
质粒 ｐＳＥ３８０ 和大肠杆菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１
（ＤＥ３）由笔者所在实验室保存； Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｉｎｕｌｉｎｕｓ Ｙ２ ８ ＣＣＴＣＣ ２０８０５２为笔者所在实验室研
究人员自行筛选获得的 Ｄ 乳酸高产菌。
１ １ ２ 主要试剂
ｐｆｕ酶购自 Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，限制性内切酶和 Ｔ４
ＤＮＡ连接酶均购自 ＴａＫａＲａ 公司，小量胶回收试剂
盒、质粒提取试剂盒购自 Ａｘｙｇｅｎ 公司，ＰＣＲ 引物由
英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，ＡＴＰ、ＡＤＰ、
Ｆ ６ Ｐ、ＮＡＤＨ、醛缩酶（ ａｌｄｏｌａｓｅ）、丙糖磷酸异构
酶（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、α 甘油磷酸脱氢酶
（α⁃ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）均购自 Ｓｉｇｍａ 公
司，其余常规试剂采用进口分装或国产分析纯。
１ １ ３ 培养基及培养条件
ＬＢ培养基（ｇ ／ Ｌ）：胰蛋白胨 １０、酵母膏 ５、ＮａＣｌ
１０。 重组大肠杆菌添加氨苄青霉素至终质量浓度为
１００ μｇ ／ ｍＬ。
平板培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０、酵母膏 ２、蛋白
胨 ２、ＫＨ２ＰＯ４ １、Ｎａ２Ａｃ ２、ＭｇＳＯ４ ０ ２、琼脂粉 ２０；玉
米浆 ２ ｍＬ，ｐＨ ７ ２。
１ ２ 方法
１ ２ １ 基因组 ＤＮＡ的提取和 ｐｆｋ基因的克隆
将 Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ Ｙ２ ８ 接种于 ３７ ℃厌氧培养 ４８
ｈ，收集菌体，基因组 ＤＮＡ 的提取采用酚 氯仿抽
提法［９］。
以 Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ Ｙ２ ８ 基因组 ＤＮＡ 为模板，依据
本课 题 组 前 期 克 隆 获 得 的 Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ ＤＸ１２ 的 ＰＦＫ 基因 （ ｐｆｋ） 序列 （ ＮＣＢＩ 登录号
ＥＵ８７８３００）设计引物如下（下划线代表酶切位点）：
正向 ５′ ＧＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＡＡＡＡＡＡＴＴＧＧＡＧＴＴＣ⁃
ＴＧ ３′（包含 Ｎｃｏ Ⅰ位点），反向 ５′ ＧＣＣＣＴＣＧＡＧ⁃
ＴＴＡＴＡＴＧＧＡＴＡＡＴＡＣＴＴ ３′（包含 ＸｈｏⅠ位点），利
用 ＰＣＲ扩增 ｐｆｋ基因。 ＰＣＲ扩增条件：９５ ℃预变性
５ ｍｉｎ；９４ ℃变性 ３０ ｓ，６０ ℃退火 １ ｍｉｎ，７２ ℃ 延伸 １
ｍｉｎ ２０ ｓ，３０个循环；７２ ℃ 延伸 ５ ｍｉｎ，冷却至 ４ ℃。
１ ２ ２ ｐｆｋ基因的生物信息学分析
从 ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ ｎｃｂｉ ｎｌｍ ｎｉｈ ｇｏｖ ／ ）数据
库中选择 ９种不同来源的典型乳酸菌的 ＰＦＫ 序列，
采用 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ（ｖｅｒｓｉｏｎ １ ８），将 Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ Ｙ２ ８ 的
ＰＦＫ序列与其他 ９种来源的 ＰＦＫ序列进行比对，考
察其底物结合位点和变构调控位点。 序列相似性
比较采用 ＮＣＢＩ 的 ＢＬＡＳＴ 软件（ ｈｔｔｐ： ／ ／ ｂｌａｓｔ． ｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ ／ Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）。
１ ２ ３ 重组表达质粒的构建
将 ＰＣＲ产物经 Ｎｃｏ Ⅰ和 Ｘｈｏ Ⅰ双酶切后与进
行相同酶切的质粒 ｐＳＥ３８０ 相连，构建重组质粒
ｐＳＥ⁃ｐｆｋ。 通过 ＣａＣｌ２法将重组质粒转化入 Ｅ ｃｏｌｉ
ＢＬ２１中［９］。 阳性重组子采用菌落 ＰＣＲ和提取质粒
双酶切鉴定，并进行测序（英潍捷基（上海）贸易有
限公司）。
１ ２ ４ ＰＦＫ在大肠杆菌中的表达
将重组菌接种到 ＬＢ 液体培养基中过夜培养，
以 １％（体积分数）的接种量接种至新鲜培养基中，
８３ 生 物 加 工 过 程 第 １２卷
培养至 ＯＤ６００到 ０ ６ ～ ０ ８ 时，加入诱导剂异丙基硫
代 β Ｄ 半乳糖苷（ＩＰＴＧ）在不同温度下诱导不同
的时间。 菌液离心（４ ℃、１２ ０００ ｇ、１０ ｍｉｎ），菌泥用
缓冲液（５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ、５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＭｇＣｌ２，ｐＨ
７ ５）洗涤 ２遍后重悬，在冰浴中超声破碎（３００ Ｗ、
超声 ３ ｓ、间歇 ５ ｓ，总共 ５ ｍｉｎ），４ ℃、１２ ０００ ｇ 离心
１５ ｍｉｎ去除细胞碎片，得到粗酶液。
１ ２ ５ ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳和蛋白含量分析
取粗酶液进行 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 分析，并以未诱导
的 Ｅ ｐＳＥ ｐｆｋ 及 Ｅ ｃｏｌｉ ｐＳＥ 作为对照。 蛋白质
含量测定采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ法［１０］，以牛血清白 ＢＳＡ为标
准品， 测 定 利 用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ 蛋 白 定 量 试 剂 盒
（ＴＩＡＮＧＥＮ公司）。
１ ２ ６ ＰＦＫ酶活性测定
ＰＦＫ酶活采用酶耦联法测定［８］。 粗酶液 （ ５
μＬ）加入 ２５０ μＬ反应体系（５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ缓
冲液、ｐＨ ８ ５，５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＭｇＣｌ２、０ ２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮＡＤＨ，
１ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＡＴＰ、５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｆ ６ Ｐ、４ Ｕ ／ ｍＬ 醛缩酶、
丙糖磷酸异构酶和 α 甘油磷酸脱氢酶）中启动反
应。 ３０ ℃平衡 ３ ｍｉｎ 后，测定 ３４０ ｎｍ 处 ＮＡＤＨ 吸
光值的变化。 ＰＦＫ酶活定义为在 ３０ ℃下每分钟生
成 １ ０ μｍｏｌ １，６ 二磷酸果糖所需要的酶量。 ＰＦＫ
比酶活为每毫克粗酶液蛋白质的酶活。
２ 结果与讨论
２ １ Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ Ｙ２ ８ ｐｆｋ 基因的克隆及表达载体
的构建
以 Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ Ｙ２ ８基因组为模板，扩增 ｐｆｋ 基
因，ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳检测在 ９６０ ｂｐ 左右
有一明显条带（图 １（ ａ）），与预计结果一致。 构建
重组质粒，经过抗性筛选和双酶切验证，结果显示
（图 １ （ ｂ）） 重组质粒在 ９６０ ｂｐ 左右比空载体
ｐＳＥ３８０多出一条带，与插入的外源基因 ｐｆｋ 大小一
致，表明成功获得重组质粒 ｐＳＥ ｐｆｋ，重组菌命名为
Ｅ ｐＳＥ ｐｆｋ。
２ ２ Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ Ｙ２ ８ ｐｆｋ基因的生物信息学分析
测序分析表明，Ｙ２ ８ 的 ｐｆｋ 为 ９６０ ｂｐ，编码
３１９个氨基酸。 将该 ＤＮＡ 序列提交 ＧｅｎＢａｎｋ，所得
登录号为 ＫＣ４１５１３５。 序列比对分析表明，Ｙ２ ８ 的
ｐｆｋ的核苷酸序列与来源于 Ｓ ｉｎｕｌｕｎｕｓ ＣＡＳＤ基因组
推测的 ｐｆｋ基因（ＺＰ＿０９７１４１０６）的核苷酸序列相似
性为 １００％。 ＢＬＡＳＴ比对显示，Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ Ｙ２ ８ 的
ＰＦＫ氨基酸序列与来源于 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐ⁃
（ａ）：Ｍ—标准 ＤＮＡ； １—ｐｆｋＰＣＲ扩增产物
（ｂ）：Ｍ—标准 ＤＮＡ； １—ｐＳＥ ３８０ ／ ＮｃｏⅠ＋ＸｈｏⅠ；
２—ｐＳＥ ｐｆｋ ／ ＮｃｏⅠ＋ＸｈｏⅠ
图 １ Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ Ｙ２ ８ ｐｆｋ的 ＰＣＲ扩增产物及
重组质粒的双酶切验证电泳图谱
Ｆｉｇ １ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ
ｐｆｋ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ Ｙ２ ８ ａｎｄ
ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄｓ
ｈｉｌｕｓ的 ＰＦＫ （ ＢＡＡ０２４０５）具有最高的相似性，为
７１％［１１］，与其他来源的芽胞杆菌属的 ＰＦＫ均具有较
高的氨基酸相似度（７１％～６７％） ［８］。
将 Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ Ｙ２ ８ ＰＦＫ与 ９ 种不同来源典型
乳酸菌 ＰＦＫ的氨基酸序列进行比对，分析其活性位
点（图 ２）。 由图 ２可知：Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ Ｙ２ ８ ＰＦＫ与其
他乳酸菌的 ＰＦＫ 均具有较高的氨基酸相似性
（５５％～７１％）。 根据来源于 Ｇ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ 和
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＰＦＫ 的活性位点［８］，可以发
现，不同来源 ＰＦＫ 的底物 Ｆ ６ Ｐ 和 ＭｇＡＴＰ 的结
合位点是严格保守的。 但是，不同乳酸菌 ＰＦＫ 的变
构效应物结合位点存在着一定的差异，如来源于芽
胞杆菌属 ＰＦＫ的 Ｅ１８７和 Ｒ２１１ 在 Ｌ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＰＦＫ
突变成 Ｄ１８７和 Ｓ２１１，而这很可能造成变构效应的
差异。 酶动力学和晶体结构解析表明，Ｌ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ
ＰＦＫ对变构效应物 ＭｇＡＤＰ 和 ＰＥＰ 的亲和力明显低
于 Ｇ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＰＦＫ。 Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ Ｙ２ ８ ＰＦＫ
的变构效应物结合位点与来源于芽胞杆菌属 ＰＦＫ
具有很高的保守性，可以预测，两者的变构效应具
有很大的相似性。 但是 Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ 是一种古老的细
菌，有着较为保守的进化过程。 笔者前期在对葡萄
糖磷酸化关键酶葡萄糖激酶（ＧＬＫ）的研究中发现，
虽然该 ＧＬＫ与来源芽胞杆菌属 ＧＬＫ 具有严格保守
的活性位点，但是 Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ 的 ＧＬＫ 具有与众不同
的广泛底物特异性［１２］。 因此，对 Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ ＰＦＫ 变
构效应机制的细致解析，将是笔者下一阶段的工作
目标之一。
９３ 第 ４期 郑 璐等：Ｄ 乳酸高产菌菊糖芽胞乳杆菌 Ｙ２ ８磷酸果糖激酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达
注：氨基酸残基上标注 Ａ、Ｂ分别是底物 Ｆ ６ Ｐ 和 ＭｇＡＴＰ 的结合位点，Ｃ是变构效应物 ＭｇＡＤＰ 和 ＰＥＰ 的结合位点
图 ２ Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ ＰＦＫ与 ９种不同来源乳酸菌的 ＰＦＫ的氨基酸序列比对结果
Ｆｉｇ ２ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＰＦＫ ｆｒｏｍ Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ
２ ３ ＰＦＫ在重组菌 Ｅ ｐＳＥ ｐｆｋ中的诱导表达
重组菌 Ｅ ｐＳＥ ｐｆｋ 在加入 ０ ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＩＰＴＧ
后在 ３０ ℃诱导表达 ６ ｈ，超声破碎上清液的 ＰＦＫ 比
酶活为 １ ０２ Ｕ ／ ｍｇ，而空宿主的比酶活为 ０ １６ Ｕ ／ ｍｇ，
ＳＤＳ ＰＡＧＥ 电泳分析结果见图 ３。 由图 ３ 可知：重
组菌在 ３ ４×１０４左右处有明显的条带，与理论计算
的相对分子质量 ３ ４３８×１０４一致，而含 ｐＳＥ３８０ 空质
粒对照菌株中未见明显条带。 这说明，Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ
ｐｆｋ在 Ｅ ｃｏｌｉ中得到了成功表达。 但是由于包涵体
的存在导致可溶性蛋白含量较低，ＰＦＫ 比酶活较
低，因此，需要对诱导条件进行优化。
２ ４ 重组菌诱导条件的优化
２ ４ １ 诱导温度的影响
按照 １ ２ ４接种重组菌 Ｅ ｐＳＥ ｐｆｋ，加入 ０ ５
ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＩＰＴＧ后诱导 ６ ｈ，考察温度对重组菌的影
响，结果见图 ４。 由图 ４可知：随着温度的降低，ＰＦＫ
比酶活反而在逐渐升高，在 ２０ ℃条件下诱导 ＰＦＫ
比酶活有大幅度提高，达到最高值 ３ ７２ Ｕ ／ ｍｇ。
ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析也表明，随着温度的降低，可溶性
的 ＰＦＫ蛋白含量在明显增高。 但是，当温度低于 ２０
℃时，蛋白含量和 ＰＦＫ比酶活反而降低。
２ ４ ２ ＩＰＴＧ诱导剂浓度的影响
按照 １ ２ ４ 接种重组菌 Ｅ ｐＳＥ ｐｆｋ，２０ ℃诱
导 ６ ｈ，考察不同 ＩＰＴＧ 浓度对重组菌的影响，结果
见图 ５。 由图 ５ 可知：随着 ＩＰＴＧ 浓度的升高，ＰＦＫ
比酶活显著提高，在 ０ １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＩＰＴＧ 时，重组菌
ＰＦＫ比酶活达到最高值，４ ３１ Ｕ ／ ｍｇ。 但是当 ＩＰＴＧ
浓度大于 ０ １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，ＰＦＫ比酶活反而有所下降。
２ ４ ３ ＩＰＴＧ诱导时间的影响
按照 １ ２ ４ 接种重组菌 Ｅ ｐＳＥ ｐｆｋ，加入
０ １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＩＰＴＧ，２０ ℃时诱导，考察不同诱导时
间对重组菌产酶的影响，结果见图 ６。 由图 ６ 可
知：随着时间的延长，ＰＦＫ 比酶活随之升高，在诱
导 １２ ｈ 后，ＰＦＫ 比酶活达到最高，为 ４ ８９ Ｕ ／ ｍｇ。
０４ 生 物 加 工 过 程 第 １２卷
１～５—重组菌 Ｅ ｐＳＥ ｐｆｋ分别在 １５、２０、２５、３０和
３７ ℃条件下诱导 ６ ｈ的可溶性蛋白
图 ３ ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析不同诱导温度下重组菌的 ＰＦＫ表达
Ｆｉｇ ３ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＰＦＫ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ
ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔａｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ
图 ４ 诱导温度对重组菌 ＰＦＫ比酶活的影响
Ｆｉｇ ４ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ＰＦＫ ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔａｉｎ
图 ５ ＩＰＴＧ对重组菌 ＰＦＫ比酶活的影响
Ｆｉｇ ５ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＩＰＴＧ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ＰＦＫ ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔａｉｎ
但是，当诱导时间超过 １２ ｈ，ＰＦＫ 酶活有所降低。
这有可能是由于细胞已经进入衰亡期，发酵液里
存在一些使表达的重组蛋白降解的因素，导致酶
活力下降。
图 ６ 诱导时间对重组菌 ＰＦＫ比酶活的影响
Ｆｉｇ ６ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ＰＦＫ ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔａｉｎ
大肠杆菌是表达外源蛋白的首选表达系统，
而实现外源基因的高效表达，宿主与载体以及诱
导方法的选择至关重要［１３］ 。 笔者在前期采用 ｐＥＴ
系统进行表达时，目的蛋白受 Ｔ７ 强启动子控制而
过量表达，不能自发折叠卷曲，形成了不具生物活
性的包涵体［１３］ 。 ｐＳＥ３８０ 是也是常用的表达载体，
其启动子 Ｐｔｒｃ 表达活性虽强，但是不容易形成包
涵体，对保持酶活力非常有利［１４］ 。 在今后的研究
中，可以采用带组氨酸标签的 ｐＳＥ３８０ 表达载体，
方便进行镍柱亲和层析纯化而获得电泳纯的目的
蛋白。
经诱导条件的优化，重组菌 Ｅ ｐＳＥ ｐｆｋ 在加
入 ０ １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＩＰＴＧ后，在 ２０ ℃诱导 １２ ｈ，粗酶液
的 ＰＦＫ 比酶活可达 ４ ８９ Ｕ ／ ｍｇ，比优化前提高了
４ ７９倍，为后续的蛋白纯化以及活性研究奠定了实
验基础。 优化结果表明，诱导温度、ＩＰＴＧ 浓度和诱
导时间都对比酶活有一定的影响，其中诱导温度对
可溶性酶表达量的影响最大。 低温条件极大地增
加了可溶性活性蛋白的含量，这可能是由于低温能
降低蛋白质合成的速率，改变蛋白质折叠的动力
学，从而导致正确折叠的蛋白增加［１３］。
３ 结 论
以 Ｄ 乳酸高产菌 Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ Ｙ２ ８ 基因组
ＤＮＡ为模板，获得磷酸果糖激酶基因，通过与不同
来源乳酸菌 ＰＦＫ氨基酸序列的比对，表明其具有保
守的底物结合位点和不同的效应物结合位点。 进
一步通过 ｐＳＥ３８０表达系统和低温诱导实现来源于
Ｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ 的 ＰＦＫ 在大肠杆菌中的可溶性异源表
达。 诱导条件优化后，重组菌 ＰＦＫ 的比酶活可达
４ ８９ Ｕ ／ ｍｇ，为进一步研究其变构调控性质和高产
１４ 第 ４期 郑 璐等：Ｄ 乳酸高产菌菊糖芽胞乳杆菌 Ｙ２ ８磷酸果糖激酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达
基因工程菌的构建提供了实验基础。
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（责任编辑 荀志金）
（上接第 １０页）
进行补料分批发酵 ４８ ｈ，ＤＨＡ产量达到 ８９ ５ ｇ ／ Ｌ。
随着能源危机的加剧，新能源的开发利用越来
越得到重视，而对新能源副产品的利用也亟须得到
解决，本文通过实验初步证明了利用生物柴油副产
物粗甘油生产 ＤＨＡ的可行性，为今后的工业化大生
产提供必要的基础数据。
参考文献：
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（责任编辑 管 珺）
２４ 生 物 加 工 过 程 第 １２卷