全 文 ：间歇及连续式固定化酶反应生产生物柴油
聂开立，王 芳，邓 利，谭天伟!
（北京化工大学 生命科学与技术学院，北京!"""#$）
摘 要：探讨了利用本实验室自制的%&’()(&*+$$,!#-脂肪酶转酯化合成生物柴油的过程。在利用间歇式反应得
到最佳反应条件的情况下利用固定床反应器生产生物柴油，经过初步优化的试验结果表明，在采用分级流加甲醇
下，生物柴油的转化率可以达到$./左右，并且固定化酶的使用寿命超过01"2。
关键词：生物柴油；固定化脂肪酶；固定床反应器；转酯化反应；脂肪酸甲酯
中图分类号：34##-5#0 文献标识码：6 文章编号：!78#9.781（#""-）"!9""-19"-
!"#$%&’(’)*+(),(&’&-.’(#/(00)+(-(1&,-(23’&(#+3$4%3#,4)#$(#).’5&34$)5’
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HFG5
近年来随着石油储量的日益减少以及人类对石
油燃烧所带来的地球环境影响的关注，开发新的对
环境无害的可再生燃油成为工作重点。!$1.年美
国科学家@G&2&I4S)MW首先将亚麻子油的甲酯用
于发动机，燃烧了!"""2，并将可再生的脂肪酸单
酯定义为生物柴油（T)J()F*F>）［!］，生物柴油的制备原
料有着传统石化柴油不可比拟的优点［#!.］，原料可
再生、产品本身环境友好、热值高、燃烧完全，不用更
换和经常清洗发动机。目前生物柴油主要是用化学
法生产，即动植物油脂与甲醇在高强度酸或碱催化
下制备。但化学法存在工艺复杂，醇消耗量大，产物
不易回收，环境污染大等缺点［0］。利用酶法合成生
! 收稿日期：#""-,"!,!"
基金项目：国家17.项目（#""#66-!0"."）；$8.项目（#"".%L8!7""#）；国家十五攻关项目（#""0L60!!L"-）（#""0L68!L"1,"#）；高等学
校科技创新工程重大项目培育资金（8"0"!"）
作者简介：聂开立（!$8$,），男，内蒙古包头人，博士研究生，研究方向：酶工程。
联系人：谭天伟，教授，研究方向：生物化工，HEH&’"I&)>5TSMH5F(S5M’
AFTZ#""-
·-1·
生 物 加 工 过 程
%2)’F*F[JSG’&>JKL)J+GJMF**<’B)’FFG)’B
第.卷第!期
#""-年#月
万方数据
物柴油具有条件温和、醇用量小、产品易于收集、无
污染物排放等优点，但低碳醇转化率低，酶成本高，
酶的寿命短等仍是此类方法需要解决的问题。
目前，有关利用酶法生产生物柴油的文献大都
停留在实验室小型反应阶段，并且大多为间歇操
作［!!"］，日本的#$%&’(&)*+*［,］等人报道了利用固
定床反应器填充-./.01)234!固定化脂肪酶连续
生产生物柴油的技术，但是在其操作中采用沉降的
方法分离副产物甘油，从某种意义上讲反应过程并
不是真正的连续。笔者采用实验室自己发酵生产的
脂肪酶5*6+&+*789::;<=!经过简单的固定化用于
间歇及连续生产生物柴油，在利用笔者实验室自行
设计制作的固定床反应器生产生物柴油的过程中，
经过反应条件的优化，同时结合分级流加甲醇技术，
实现了生物柴油的连续化生产，反应的最终转化率
可以达到:=>以上，固定化酶的使用寿命超过3!?
(。
! 实验部分
<9< 试剂与仪器
甲醇、石油醚（沸程@?!:?A）、正己烷，北京试剂
公司；大豆色拉油，利用甲酯化法测定其成份见表<，平
均分子量为,!:；假丝酵母脂肪酶由本实验室自制。
固定化脂肪酶采用本实验室研究的固定化方法
将!"#$%$%"78::;<=!进行固定化处理，具体方法
见专利（申请号?=<<"@<39?）。酶活力单位的定义：
采用橄榄油乳化液水解滴定法测定。<个酶活力单
位（BC）是指酶在最适作用条件下（在8D值为,，温
度为3?A时），在<)&6内能转化<").E底物的酶
量，或是转化底物中<").E的有关基团的酶量。酶
的比活力指每F酶蛋白所具有的酶活力。
表< 大豆色拉油的脂肪酸组成
G*HE2< I*JJ1*K&+K.6J26J&6J(27.1H2*6.&EJL&FE1K2L&+279
脂肪酸
化学式 名称
质量分数／>
5<3M? 豆蔻酸 ?9=?
5<@M? 棕榈酸 =<9@@
5<@M< 棕榈油酸 ?9==
5<,M? 硬脂酸 =94?
5<,M< 油 酸 <:95<,M= 亚油酸 !!9,@
5<,M4 亚麻酸 ?9=,
5=?M< 芥 酸 ?9<:
5=?M? 花生酸 ?9<3
摇床（哈尔滨东联电子公司），电子天平（赛多利
斯公司），固定床反应器（自制，内径<,K)，高<
)），柱塞计量泵（浙江杭州支江石化装备有限公
司），气相色谱（日本岛津N5;=?<9= 实验方法
间歇式反应采用=!?)O具塞锥形瓶，基本的反应
体系具有油和甲醇，石油醚，固定化!"#$%$%"78::;<=!
脂肪酶，3?A密闭振荡反应，摇床转速为<"?L／)&6。
连续反应采用实验室设计制作的不锈钢固定床
式反应器（<,K)BP，高<)），填充层片状固定化酶
（每支酶反应器需要固定化酶!??F，酶活力为
"???C／F），3?A恒温循环水浴。具体工艺流程见图
<，反应采用分级流加甲醇的方式，每三支固定床反应
柱作为一级反应，每级反应加入等摩尔的甲醇，并在
每级反应结束时采用分离器在线分离副产物甘油。
图< 固定床反应器生产生物柴油工艺流程图
I&F9< QL.K277.RH&.+&272E8L.+$K2+H1R&S2+H2+L2*KJ.L
=??!年=月 聂开立等：间歇及连续式固定化酶反应生产生物柴油 ·!:·
万方数据
!"# 产物的分析
产物采用气相色谱法分析，利用岛津$%&!’(
气相色谱仪，)*!&+,毛细管柱（!-"./001!/0；
23456789,7:76），高纯氮作载气，二阶程序升温，柱
温由!--;到#--;，升温速率!-;／079；#--;
到#/-;，升温速率/;／079。利用氢火焰离子检
测器，检测器温度#转化率采用峰面积归一化法计算。
甲酯转化率=脂肪酸甲酯的峰面积／（三甘油酯
峰面积>二甘油酯峰面积>单甘油酯峰面积>脂肪
酸峰面积>甲酯峰面积）
图. 不同醇油摩尔比对反应的影响
?7@". A:86,B:08,+C9BD6B9689,EC,7B979,+8FGHF,EC,8
! 结果与讨论
."! 底物抑制作用
甲醇等短链醇对酶等蛋白质有变性作用，通过
实验表明，在利用不同油醇摩尔比的物料进行反应
时过量的甲醇对脂肪酶催化反应有很强的抑制作
用，使酶变性。研究中发现当醇油摩尔比为!I!时，
反应的转化率为#!J（理论转化率为##"##J）。当
体系中甲醇含量低于这个比例时由于底物浓度不足
会造成反应转化率较低，而当甲醇含量高于醇油摩
尔比!I!时则会对固定化酶造成不可恢复的失活。
.". 温度的影响
相对高的温度可以加快反应的速度，但是随温
度的升高，甲醇等短链醇对脂肪酶的毒性也增大，固
定化酶的使用寿命降低。在相对高的温度下，反应
的转化率呈下降趋势，即使增加反应时间也无法增
加转化率。而在相对低的温度下，可以通过增加反
应时间使反应的转化率达到较理想的程度（见图
#）。通过优化选择’-;作为反应温度。
."# 水含量的影响
在以往的观点中，酶促催化转酯化反应的体系
中不可有过高的水含量，否则固定化酶将失去活力。
然而在我们的实验中发现，在反应物料中加入部分
水会大大提高反应的转化率，如图’所示。当反应
体系中没有水时，反应转化率只有K."<’J，当加入
水量达到油质量的.-J时，反应转化率可以达到
LMJ，但是再增加水的比率，反应转化率又开始下
降。估计造成以上现象的原因是由于水加入后，油
脂会在脂肪酶的催化下发生水解反应，水解生成的
脂肪酸又会和甲醇发生酯化反应，致使甲酯由酯化
和转酯化两反应同时生成。
—!—#-+；—"—M-+
图# 温度对反应的影响
?7@"# A:86,B:N7:8E89,,80O8EC,GE8F
图’ 水含量对转化率的影响
?7@"’ A:86,B:PC,8E6B9,89,FB9,+8E8C6,7B9"
在反应体系中加水后通过监测体系中脂肪酸含
量的变化。我们发现在体系含水!-J（!（水）／!
（油））的情况下在反应开始的时候，水解反应的速度
很快，/!M+后体系中的脂肪酸含量就会达到最大
值。在无水条件下，这一过程通常要!.+左右。在
酸的含量达到最大值后，体系中的酸含量不断减少，
最终趋于平衡。以上的结果更加证实了我们关于水
的介入后，油脂会在脂肪酶的催化下发生水解反应，
水解生成的脂肪酸又会和甲醇发生酯化反应，致使
甲酯由酯化和转酯化两反应同时生成，从而增加了
反应的转化率的假设。
."’ 固定床反应
固定床式生物反应器的最大优点是能够进行连
续化生产，这点对于将实验室技术转化为工业生产
来说极为重要，本文同时对利用固定床反应器生产
生物柴油进行了初步的研究。
·M-· 生物加工过程 第#卷第!期
万方数据
—!—外加水量!"；—"—外加水量#!"
图$ 水含量对脂肪酸生成速度的影响
%&’($ )*+,-.*/0-+1,.2-+2-3.2-4+,.2-+2-3.*%%5&2-4+
1+0,-&.2363-+7(
为了得到高的转化率，在固定床式反应器生产
生物柴油的过程中，水的加入仍然是极为重要的，这
可能是由于自制的脂肪酶的特性原因。在实验过程
中发现底物在泵入反应器前必须混合均匀，否则将
会使固定床反应器内局部甲醇浓度过高，不利于反
应。同时，一次所能加入的甲醇质量浓度仍然需要
遵循在间歇操作实验中得出的结论，即醇油摩尔比
不可以超过#8#。为了降低物料的粘度得到更加利
于反应的底物浓度，有机溶剂仍然是必不可少的，综
合考虑各种因素［9］实验中采用廉价的石油醚作为有
机溶剂。
实验过程中发现底物的流动速度对整个反应过
程有着极为重要的影响，过高的流速会造成底物在
固定化酶上的停留时间不足，不能得到令人满意的
转化率。利用实验室自制的固定床反应器生产生物
柴油时，发现流速不可以超过#$:／4，否则转化率
会明显降低，表;是底物中醇油摩尔比为#8#时（理
论转化率为<<(<"）不同流速对转化率的影响结
果。
表; 不同流速的影响
=0>?+; )*+,-.*@&*+1+2-*?./10-+.**&A+@>+@1+0,-.1
流速／（:／4） 出口处甲酯含量／"
#; <;"
#B <;"
#$ <#"
#C ;$"
以#B:／4的流速泵送摩尔比为#8#的甲醇和
色拉油混合物料，发现<4后出口开始有产物出现，
大约$4后产物质量浓度达到<#"左右，此后在连
续
反应D;4后反应器出口处产物质量浓度基本保持
不变，如图C所示。
图C 醇油摩尔比为#8#时D;4反应历程
%&’(C D;4.E131+0,-&.2F1.,+33.**&A+@>+@1+0,-.1/&-43E>G
3-10-+,.2,+2-10-&.2/03#8#（7+-402.?／.&?，7.?／7.?）
为了验证我们自行设计的反应工艺的生产能力
以及固定化酶的使用寿命，将反应后的物料中加入
第;份等7.:的甲醇，混合均匀后重新泵入反应
器，并在第;份等7.:的甲醇反应完后加入第<份
等7.:的甲醇继续反应。反应中发现在加入第<
份等7.:的甲醇后，产物的质量浓度仍然只有D;"
左右，但是转化率维持恒定，估计是由于反应达到了
平衡所至。因此，为了打破反应的平衡，继续向反应
体系中加入了第B份等7.:的甲醇，并在最终得到
了转化率为9<"左右的产品。整个反应过程中反
应器出口的产物质量浓度变化见图D。
图D 固定床反应器出口产品质量浓度变化曲线
%&’(D =1023*.170-&.2.*F1.@E,-,.2,+2-10-&.2&2-4++A&-.*
*&A+@>+@1+0,-.1
利用北京市环保局提供的地沟油作为底物进行
反应，发现采用地沟油反应效果良好，原料只需要经
过简单的过滤即可直接用于反应，并且只需要加入
<份等7.:的甲醇转化率即可达到9<"左右见图
H。
分析地沟油转化效果良好的原因，发现地沟油
成份相当复杂，由于地沟油的酸败程度很大，因此含
有大量的游离脂肪酸，通过实验测得其酸价为每’
油C#(<$7’IJK，皂化价为每’油#9B(!;$7’
IJK。表<可以看出地沟油的成份百分比，估计由
于大量游离脂肪酸的存在使反应更容易进行，这同
反应中加入水使反应由酯化和转酯化两步同时进行
;!!$年;月 聂开立等：间歇及连续式固定化酶反应生产生物柴油 ·C#·
万方数据
从而提高反应转化率的假设是相同的。
图! 利用地沟油作为原料生产生物柴油
"#$%! &’()*+,#,-./#-0#+,+12#)*23,)+-#13,,4/,)53)+4,#($
.#6+0/+05+37)-5
表8 废油成份
93/1+8 :-;<-(+()-.23,)+-#1
成分 脂肪酸 三甘酯 二甘酯 杂质
质量分数／= >?%@A >?%BC A%@B B%>>
利用固定床反应器生产生物柴油的反应共持续
近DC0，转化油脂8CCE，废油>CE，平均转化率高
于FD=。
! 结 论
酶法合成生物柴油是一个十分有潜力的生物催
化过程。通过试验，证实了利用笔者实验室发酵提
取的脂肪酶（!"#$%$",<%FFGBDA）采用吸附法固定
化，可以用于酯交换反应来制备生物柴油。采用固
定床反应器填充层片状固定化酶，并结合分级流加
甲醇与旋液分离技术可以实现生物柴油的连续化生
产，经过一定的优化，利用大豆色拉油及废油脂生产
生物柴油的转化率均可以达到FD=以上，并且固定
化酶使用寿命可以达到DC0，为酶法生产生物柴油
的工业化装置的建立提供了基础数据。
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,<<%&GD［K］%O5-7+,,I#-7*+;#,)5’，DCCB，8@（8@）：>CAG>BC%
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’,#,.-5/#-0#+,+1.4+1<5-047)#-(3(03<<1#73)#-(-.)*+5+37)#-()-
-#1<5-7+,,#($［K］%K-45(31-.H-1+74135:3)31’,#,I：\(N’;3)#7，
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