全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
6;CE@G@SDK2E3JDF/CDA2DL@GG^ E4CE@@2CE4
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收稿日期"$%&% ?%. ?&#
基金项目"国家重点基础研究发展计划#*( 计划$资助项目#$%%*6/*&.(%#$
作者简介"李干禄#&5%$& 男& 江西南康人&工程师& 研究方向"生物分离)应汉杰#联系人$&教授& 1^M3CJ" HCE4;3E C`@&(.f&5(>LDM
离子交换法纯化
!
淀粉酶抑制剂
李干禄&&李"磊&&张景明$&陈晓春&&应汉杰&
#&>南京工业大学"生物与制药工程学院&南京 $&%%%) $>江苏省环境监测中心&南京 $&%%(5$
摘"要"采用离子交换法&利用弱碱性阴离子交换树脂 R
(&#
吸附小麦粉初提液中的
!
淀粉酶抑制剂&对其静态吸
附以及洗杂洗脱条件进行研究 通过对静态吸附条件的摸索&得出静态下的最佳工艺条件"上样料液的蛋白质量
浓度
"
%
l$h# j(h# M47MZ(A+l!h# jh#(温度 6l(% i(转速 &#% 27MCE 最佳洗脱条件"%h& MDJ7Z,36J洗杂&
%h# MDJ7Z,36J洗脱 在该条件下&
!
淀粉酶抑制剂纯化倍数为 .h$# 倍&收率为 5.h#!g
关键词"
!
淀粉酶抑制剂) 洗杂洗脱)离子交换法) 静态吸附
中图分类号"Y0$%&h$""""文献标志码"P""""文章编号"&5*$ ?(5*!#$%&%$%# ?%%.. ?%.
E34.7.:5F.2/27
!
W5JG6510./-.H.F24HG .2/0O:-5/;0J0F-2I
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ICBCDEGDFCBGGB3BCL3IGD2ABCDE& @JKBCDE 3EI N3G;CE4N@2@CE[@GBC43B@I>/HGB3BCL3IGD2ABCDE& B;@DABCMKM
LDEICBCDEGN@2@D9B3CE@I" A2DB@CE LDEL@EB23BCDE $h# M47MZBD(h# M47MZ& A+!h# BDh#& B@MA@23BK2@
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!
13MHJ3G@CE;C9CBD2)@JKBCDE 3EI N3G;CE4)CDE1@VL;3E4@M@B;DI)GB3BCL3IGD2ABCDE
""饮食中的碳水化合物大多数是淀粉&淀粉酶能
在短时间内将其水解成麦芽糖&再以葡萄糖的形式
在肠道内吸收 经过初步纯化(剂量足够的
!
淀
粉酶抑制剂能抑制肠胃道内胰腺酶的活性&阻碍或
延缓其对食物中淀粉的消化作用&降低食物中淀粉
类物质的分解吸收&从而起除低血糖(血脂的作用&
抑制血糖浓度的升高&有利于配合糖尿病人的饮食
治疗 对于肥胖患者&可减少糖向脂肪转化&延缓
肠道的排空&增加脂肪消耗以减少体质量*& ?$+ 因
此&
!
淀粉酶抑制剂可用来防止和治疗肥胖症(脂
肪过多症(动脉硬化症(高血脂及糖尿病等 鉴于
!
淀粉酶抑制剂的重要生物学功能&许多学者对不
同来源的
!
淀粉酶抑制剂结构(理化特性以及药理
作用进行了研究*( ?.+
目前国外主要是采用离子交换纤维素层析或
凝胶层析等分离纯化方法&从小麦粉中提取
!
淀粉
酶抑制剂&比活力可以提高到 .h%! 倍&但活性回收
率仅为 h!g*#+ 从豆类中提取时纯化倍数可以提
高到 (&h* 倍&但是活性回收率也只有 (*g*5+ 张
佰鹏等**+用双水相萃取法分离纯化了白芸豆中
!
淀粉酶抑制剂&纯化倍数达到 .h.& 回收率为 *&g
刘文芝等*!+以黏玉米种子为原料&经脱脂脱色(提
取(离子交换(分子筛层析&获得一种比酶活 &5#h!
X7M4&纯化 (5h 倍的蛋白类新型
!
淀粉酶抑制
剂 上述提取方法成本很高&操作周期长&不利于
进行工业化放大
从小麦粉中提取一种
!
淀粉酶抑制剂&利用
弱碱性阴离子交换树脂R
(&#
吸附小麦粉初提液中的
!
淀粉酶抑制剂&对它的静态吸附以及洗杂洗脱条
件进行研究&为工业化生产提供指导
C?实验部分
C=C?仪器与试剂
Xd d_0!#%% 型紫外分光光度计#上海天美科
学仪器有限公司$)+]Q
"
3型回转式恒温调速摇
床#上海欣蕊自动化设备有限公司$)-2CDE .&%PA+
计#Y;@2MD公司$)
!
淀粉酶标准品#0C4M3公司$)
树脂R(&##PM9@2JCB@公司$)面粉为市售试样#东海
金慧面粉厂$
C=A?实验方法
&>$>&"
!
淀粉酶抑制剂制备
将小麦粉加适量水浸泡搅拌 5 ;&静置 $ ; 后&
&% %%% 27MCE离心 &% MCE&收集上清液&迅速升温到
*# i&选择性热变 & ;&冷至室温后离心收集上清
液&(%g#质量分数&下同$饱和#,+
.
$
$
0-
.
盐析&沉
淀用水溶解即得
!
淀粉酶抑制剂初提液
&>$>$"R
(&#
树脂的预处理
对R
(&#
树脂按文献*+方法进行预处理后&用
$ MDJ7Z+6J溶液浸泡 $. ;&使 R
(&#
树脂转变成 6J?
型阴离子交换树脂&水洗至中性&常温干燥备用
&>$>("静态吸附实验
取若干 &%% MZ三角瓶&称取 & 4干树脂&加入
按实验要求调配好的料液 $% MZ&选取不同的摇床
工作参数&从而达到不同实验条件下的吸附情况
&>$>."静态洗杂和洗脱实验
将在最优条件下吸附平衡后的溶液用抽滤瓶
抽干&得到干树脂 用电子天平称取等质量的几份
放置于 &%% MZ三角瓶中 用 $% MZ不同浓度的
,36J进行洗脱&摇床工作参数与吸附时相同 洗脱
&% ;后取样测定蛋白浓度和抑制活力&计算出每个
三角瓶中的洗脱蛋白量和抑制总活力
&>$>#"抑制活力和蛋白质浓度测定方法
抑制活力测定方法*&%+ "取一定量的
!
淀粉酶
和
!
淀粉酶抑制剂于 %h# MZ+
(
<-
.
缓冲液中#A+
*h%$&在 (* i下预反应 (% MCE 后&加入 %h# MZ的
%h%.g#质量分数&下同$的淀粉溶液再反应&# MCE&
用 %h( MZ的 $ MDJ7Z+6J中止反应&(h# MZ蒸馏水
稀释反应液&加 %h$ MZ%h%& MDJ7Z的碘液显色&在
5%% EM处测定吸光值
!
淀粉酶活性定义"在上述实验条件下将所加
淀粉水解 #%g所需的酶量定义为一个单位
!
淀
粉酶抑制剂活性定义"在上述实验条件下&每 MZ溶
液将 $ 个单位
!
淀粉酶活性抑制了 #%g所需的量
为一个单位
蛋白浓度测定方法"考马斯亮蓝 Q$#% 结合法
测定蛋白浓度*&&+
抑制比活定义"每毫克蛋白的抑制活性 抑制
比活l
!
淀粉酶抑制剂活性7蛋白浓度 吸附抑制
总活力为原始料液抑制总活力减去吸附平衡后抑
制总活力的差值
A?结果与讨论
A=C?静态吸附实验
$>&>&"料液浓度对吸附抑制活力的影响
分别调节料液的蛋白质量浓度为 &h&$($h$((
$h*#((h(# 和 .h$& M47MZ 料液的初始 A+5h#&
摇床转速为 &#% 27MCE&温度为 $% i 吸附 &% ;后&
分别取样测定抑制活力&计算出吸附平衡后的抑制
总活力&结果见图 &
图 C?蛋白浓度对吸附的影响
T.;=C?)/7630/:027942F0./:2/:0/F45F.2/2/5I1249F.2/
""由图 & 可知"上样蛋白质量浓度低于( M47MZ
时&吸附的抑制总活力随着蛋白浓度的增加而增
加)超过 ( M47MZ后&增加缓慢&最后趋于平衡&说
明吸附达到饱和 因此&为了增加树脂的利用率&
#."第 # 期 李干禄等"离子交换法纯化
!
淀粉酶抑制剂
料液质量浓度控制在 $h# j(h# M47MZ之间
$>&>$"温度对吸附抑制活力的影响
调节上样蛋白质量浓度为 $h!# M47MZ& A+
5h#&摇床转速为 &#% 27MCE&考察不同温度条件 &#(
$%($#((% 和 (# i对吸附抑制活力的影响 吸附
&% ;后取样测定吸附的抑活力&计算出吸附的抑制
总活力&结果见图 $
图 A?温度对吸附的影响
T.;=A?#70:F127F0J9045F3402/5I1249F.2/
""由图 $ 可知"树脂的吸附过程是一个吸热过程&
随着温度的升高吸附量也不断增加&当温度在 (% i
附近时&吸附的抑制总活力达到最大值)继续升高
温度&吸附量变化不大 由于过高的温度会引起酶
的失活&从而导致吸附后的酶活下降&因此选定 (%
i作为最佳吸附温度
$>&>("上样料液的 A+对吸附抑制活力的影响
分别调节料液的 A+为 #h$((5h#(!h.$(h$#
和 &%h&(&蛋白质量浓度为 $h*$ M47MZ&摇床转速
为&#% 27MCE&温度为 (% i&吸附 &% ; 后&取样测定
抑制活力&结果见图 (
图 Q?9"对吸附的影响
T.;=Q?#70:F1279"2/5I1249F.2/
""由图 ( 可知"在 A+小于 !h# 时&随着 A+的升
高&吸附的抑制总活力快速提高)之后随 A+的升高
变化较小&大约在 h$# 处出现最大吸附量 但是过
高的 A+会对酶产生抑制作用&因此选定 h$# 作为
最佳吸附 A+
$>&>."转速对吸附抑制总活力的影响
调节上样液蛋白质量浓度为 $h*$ M47MZ&A+
5h#&温度为 $# i&控制转速分别为 #%(&%%(&#%(
$%% 和 $#% 27MCE&吸附 &% ; 后取样测定抑制活力&
计算出吸附抑制总活力&结果见图 .
图 R?转速对吸附的影响
T.;=R?#70:F12742F5F./; 1900I2/5I1249F.2/
""由图 . 可知"转速在 #% j&#% 27MCE 之间&转速
较小时吸附的抑制总活力相对较小&这是因为较快
的转速能较充分地使目的蛋白和树脂相接触&有利
于交换反应的发生)而当转速超过&#% 27MCE时吸附
量明显降低&这是因为传统树脂孔径较小&在吸附
蛋白这样的大分子物质时&剧烈震荡产生的剪切力
会破坏蛋白结构&从而使酶失活 因此实验中选取
&#% 27MCE作为最佳转速
A=A?静态洗杂和洗脱实验
将在最优条件下吸附平衡后的溶液用抽滤瓶
抽干&得到干树脂 称取等质量的几份放置于 &%%
MZ三角瓶中&并根据抽干前树脂的吸附量计算出
每份树脂的吸附量大约为$h$! M4蛋白&抑制总活
力为 5 %(&h&! X&其中预处理后的蛋白溶液抑制比
活为&%(h.# X7M4 用 $% MZ不同浓度的 ,36J进
行洗脱&摇床工作参数与吸附时相同 洗脱 &% ; 后
取样测定蛋白质量浓度和抑制活力&计算出每个三
角瓶中的洗脱蛋白量和抑制总活力&结果分别见图
# 和图 5
综合图 # 和图 5 可推测"在 ,36J浓度从 %h%#
MDJ7Z增大到 %h& MDJ7Z时&洗脱下来的蛋白量很
大&但是抑制活力相对来说很小&说明这个阶段主
要以洗杂蛋白为主&其中 %h& MDJ7Z时洗脱下来的
蛋白为 &h5( M4&抑制活力为 $(h( X),36J浓度达
到 %h# MDJ7Z以上时&洗脱的蛋白量和抑制活力都
5. 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
图 @?$5,6浓度对洗脱抑制总活力影响
T.;=@?#70:F127$5,6:2/:0/F45F.2/
2/063F0IF2F56./-.H.F5F.2/5:F.N.FG
图 V?$5,6浓度对洗脱蛋白的影响
T.;=V?#70:F127$5,6:2/:0/F45F.2/2/063F0I942F0./
达到最大并呈平衡趋势&说明 ,36J浓度达到 %h#
MDJ7Z时&目的蛋白基本上被充分洗脱下来&其中
%h# MDJ7Z时洗脱下来的蛋白为 $!h. M4&抑制活
力为 . !&!h$( X 因此&如果利用 %h& MDJ7Z,36J
洗杂后再用 %h# MDJ7Z,36J洗脱&洗脱液抑制比活
达到了 .(h5 X7M4&和初始抑制比活 # &%(h.#
X7M4$相比&纯化了 .h$# 倍&收率为 5.h#!g
尝试改变,36J溶液的酸碱性&结果发现 A+在
碱性范围内升高时&洗脱下的蛋白和抑制活力和中
性,36J溶液洗脱时差不多 调节 A+到 5 以下并
继续降低时发现&洗脱下的蛋白和抑制活力都较中
性,36J溶液洗脱时稍高&但是抑制剂的比活为
.$*h.# X7M4&并没有得到提高 因此为节约成本&
确定用中性,36J溶液进行洗杂和洗脱实验
Q?结?论
静态吸附时&选取上样料液的蛋白质量浓度为
"
%
l$h# j(h# M47MZ( A+l!h# jh#(温度 6l
(% i(转速 &#% 27MCE作为最优吸附参数
""静态洗脱和洗杂时&在综合考虑洗杂效率和抑
制活力收率的基础上&用 %h& MDJ7Z的 ,36J溶液进
行洗杂&用 %h# MDJ7Z的 ,36J溶液进行洗脱&可得
出纯化倍数为 .h$# 倍&收率为 5.h#!g
参考文献"
*&+"尹先林&战立克&赵根楠>发酵工业全书*b+&北京"中国医药
科技工业出版社&&$"$(1$>
*$+"张琪&杜宇&陈国广&等>小麦中提取的
!
淀粉酶抑制剂调节
血脂及抗动脉粥样硬化的实验研究*S+>中国药科大学学报&
$%%#&(5##$"#*$1#*5>
O;3E48C&RK ]K&6;@E QKD4K3E4&@B3J>ZCACI12@4KJ3BCE43EI 3EBC1
3B;@2DGLJ@2DGCG@F@LBGDF
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*(+"0[@EGGDE /&)KaKI3c&,C@JG@E
!
13MHJ3G@CE1
;C9CBD2G*S+>/CDL;CM/CDA;HGPLB3&$%%.&&55"&.#1&.!>
*.+"张琪&陈宁&陈国广&等>小麦
!
淀粉酶抑制剂降血糖作用的
实验研究*S+>中国新药杂志&$%%5&&##5$".($1.(#>
O;3E48C&6;@E ,CE4&6;@E QKD4K3E4&@B3J>PEBC;HA@24JHL@MCL
@F@LBDF
!
13MHJ3G@CE;C9CBD2CE IC39@BCLMCL@*S+>6;CE S,@N
R2K4G&$%%5&&##5$".($1.(#>
*#+"-vRDEE@JbR&bLQ@@E@Hc)>
13MHJ3G@CE;C9CBD2F2DMN;@3B*S+>/CDL;CM/CDA;HGPLB3&&*5&
.$$"&5>
*5+"b32M@E SS&Z3KI3b>
!
13MHJ3G@CE;C9CBD2&F2DMB;@aCIE@H9@3E*S+>SDK2E3J/CDJD4C1
L3J6;@M&&*#&$#%"!%(%1!%(*>
**+"张佰鹏&高美风&徐雯&等>双水相萃取法分离纯化白芸豆中
!
淀粉酶抑制剂的研究 *S+>药物生物技术& $%%! # $ $"
&$1&($>
O;3E4/3CA@E4&Q3Db@CF@E4&\K T@E&@B3J>0BKIHDE AK2CFCL3BCDE
DF3JA;313MHJ3G@CE;C9CBD29H3UK@DKGBND1A;3G@@VB23LBCDE&F2DM
B;@aCIE@H9@3E 2%*+(&/0+90/.*"#+*S+><;32M3L@KBCL3J/CDB@L;1
EDJD4H&$%%!#$$"&$1&($>
*!+"刘文芝&郭德军&衣海龙&等>粘玉米中
!
淀粉酶抑制剂的分
离纯化及性质研究*S+>食品工业技术&$%%#5$"&&51&&>
ZCK T@E:;C&QKDR@`KE&]C+3CJDE4&@B3J>0BKIHDE B;@@VB23LBCDE
B@L;EDJD4H3EI L;323LB@2DF
!
13MHJ3G@CE;C9CBD2F2DMMHVD1M3C:@
*S+>0LC@EL@3EI Y@L;EDJD4HDF)DDI _EIKGB2H&$%%#5$"&&51&&>
*+"钱庭宝>离子交换剂应用技术*b+>天津"天津科学技术出版
社&&!."$**1$!%>
*&%+ dw2DECUK@Z&/@2@1PEBDE 6&/DMA32I Q)&@B3J>6;323LB@2C:3BCDE
3EI FKELBCDE3JA2DA@2BC@GDFB;@
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13MHJ3G@CE;C9CBD2#
!
1P_$ F2DM
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*&&+ PGCF6&cD`Cb&WHK C`b>6;323LB@2DF3N;@3B3MHJ3G@CE;C9CBD2
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BCDEG3EI ;D2MDE@G*S+>Q3GB2D@EB@2DJD4H&&5&&&&"&(&(1&($%>
*."第 # 期 李干禄等"离子交换法纯化
!
淀粉酶抑制剂