全 文 ：第７卷第５期
２００９年９月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０５．００５
收稿日期：２００８－１１－２８
基金项目：国家高新技术研究发展计划（８６３计划）资助项目（２００６ＡＡ０２Ｚ１５３）
作者简介：孔静静（１９８４—），女，山东曲阜人，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学；王 武（联系人），教授，博士生导师，Ｅｍａｉｌ：ｗａｎ
ｇｗｕ＠ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ
产 ＨＳＡ ＣＰ融合蛋白毕赤酵母的发酵条件优化
孔静静，王长城，杨海麟，张 玲，周利苹，金 坚，王 武
（江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 ２１４１２２）
摘 要：为提高重组毕赤酵母生产人血清白蛋白 Ｃ肽融合蛋白（ＨＳＡ ＣＰ）的产量和生产强度，在摇瓶条件下考察了
甲醇诱导时间和浓度对目的蛋白产量的影响。结果表明，质量浓度１０ｇ／Ｌ的甲醇诱导７２ｈ最适于产物表达。通过
对７Ｌ发酵罐中各因素的优化，得到最佳条件为：初始甘油质量浓度１０ｇ／Ｌ，３０℃培养，菌体生长期和诱导期的ｐＨ及
溶氧分别控制在ｐＨ５０、３０％溶解Ｏ２或ｐＨ６０、１５％的溶解Ｏ２。１０ｇ／Ｌ的甲醇诱导７２ｈ，最终使干细胞质量浓度达到
５６４３ｇ／Ｌ，目的蛋白产量达３６８４５ｍｇ／Ｌ。生产强度为３９２０ｍｇ／（Ｌ·ｈ），目标蛋白的比生产速率为５１２ｍｇ／（Ｌ·ｈ）。
关键词：ＨＳＡ ＣＰ融合蛋白；巴斯德毕赤酵母；发酵优化
中图分类号：Ｑ８１４．４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０５－００２５－０４
ＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＨＳＡＣＰｆｕｓｉｏｎ
ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ
ＫＯＮＧＪｉｎｇｊｉｎｇ，ＷＡＮＧＣｈａｎｇｃｈｅｎｇ，ＹＡＮＧＨａｉｌｉｎ，ＺＨＡＮＧＬｉｎｇ，
ＺＨＯＵＬｉｐｉｎｇ，ＪＩＮＪｉａｎ，ＷＡＮＧＷｕ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＪｉａｎｇｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｋｅｙｆａｃｔｏｒｓｏｎｈｉｇｈｌｅｖｅｌｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＨＳＡＣＰｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ
ｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｉｎｓｈａｋｅｆｌａｓｋ．Ｉｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｗｉｔｈ１０ｇ／Ｌｏｆｍｅｔｈａｎｏｌｉｎｄｕｃｅｄｆｏｒ７２ｈ，ｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｔｈｅ
ｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｈｉｇｈ．Ｂｙｓｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｕｎｄｅｒｄｉｆｅｒｅｎｔｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎ
７Ｌｆｅｒｍｅｎｔｏｒ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄａｓｆｏｌｏｗｓ：ｆｉｒｓｔｌｙｋｅｐｔａｔｐＨ５０ａｎｄ３０％ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄｏｘｙｇｅｎｄｕｒ
ｉｎｇｔｈｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｐｅｒｉｏｄ，ｔｈｅｎａｔｐＨ６０ａｎｄ１５％ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄｏｘｙｇｅｎｄｕｒｉｎｇｉｎｄｕｃｔｉｏｎｐｅｒｉｏｄ，ｗｉｔｈｉｎｉｔｉａｌ
ｇｌｙｃｅｒｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ１０ｇ／Ｌａｔ３０℃ ｆｏｒ７２ｈ，ｄｒｙｃｅｌｍａｓｓ．Ｆｉｎａｌｙ，ｔｈｅｍａｘｉｍｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ
ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｒｅａｃｈｅｄ５６４３ｇ／ＬａｎｄＨＳＡＣＰｗａｓ３６８４５ｍｇ／Ｌ．Ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｒｅａｃｈｅｄ３９２０
ｍｇ／（Ｌ·ｈ），ｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓ５１２ｍｇ／（Ｌ·ｈ）．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＨＳＡＣＰｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ；Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
Ｃ肽（Ｃｐｅｐｔｉｄｅ，ＣＰ）是胰岛素原分子中连接胰
岛素Ａ链与Ｂ链的连接肽，它是胰岛素原转变为胰
岛素过程中的裂解产物，伴随胰岛素等分子一同从
胰岛β细胞分泌。随着对糖尿病基础和临床研究的
深入，发现ＣＰ对于延缓糖尿病慢性并发症的发生
有重要的作用［１－２］。但 ＣＰ相对分子质量小、稳定
性差、体内半衰期短等缺点限制了其药物化的发展。
人血清白蛋白（ＨＳＡ）是许多内源因子和外源
药物的载体。它的特点是：无免疫原性，人体相容
性好，相对分子质量大（约为６６×１０４），半衰期可
达２０ｄ［３］；能维持血液渗透压，运输营养和具有其
他重要生物物质的作用。
为了保持Ｃ肽的生物活性，延长其在人体内的
半衰期，同时便于目的蛋白的纯化，周利苹等［４］将
人工合成的 ＣＰ基因与 ＨＳＡ基因连接，插入载体
ｐＰＩＣ９Ｋ后，经线性化转入毕赤酵母 ＧＳ１１５中，筛选
Ｍｕｔ＋型转化子，获得能够分泌表达 ＨＳＡ ＣＰ融合
蛋白的基因重组菌。目前，国内外少见人血清白蛋
白与Ｃ肽融合蛋白（ＨＳＡ ＣＰ）的发酵生产。周利
苹等［４］报道的蛋白的摇瓶条件有机培养基中的发
酵水平为１４０ｍｇ／Ｌ。本文在摇瓶条件下无机盐培
养基中，优化甲醇添加浓度及诱导时间，以提高融
合蛋白产量。
１ 材料与方法
１１ 材料
１１１ 菌种
将 ＨＳＡ基因与人工合成的 ＣＰ基因融合，以
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１５为宿主，表达ＨＳＡ ＣＰ融合蛋白，
具有Ｍｕｔ＋表型，由江南大学金坚教授惠赠。
１１２ 培养基
ＹＰＤ活化培养基（ｇ／Ｌ）：蛋白胨２，酵母提取物
１，葡萄糖２，琼脂粉２（平板）［５］。
摇瓶生长培养基（１Ｌ）：甘油４０ｇ，Ｋ２ＳＯ４１８２
ｇ，ＭｇＳＯ４７２８ｇ，ＫＯＨ４１３ｇ，ＣａＳＯ４·２Ｈ２Ｏ０９３ｇ，
８５％磷酸 ２６７ｍＬ，ＰＴＭ１４３５ｍＬ［６］。
摇瓶诱导培养基（１Ｌ）：甲醇５ｇ，Ｋ２ＳＯ４１８２ｇ，
ＭｇＳＯ４７２８ｇ，ＫＯＨ４１３ｇ，ＣａＳＯ４·２Ｈ２Ｏ０９３ｇ，
８５％磷酸 ２６７ｍＬ，ＰＴＭ１４３５ｍＬ［６］。
基础盐培养基（１Ｌ）：甘油４０ｇ，Ｋ２ＳＯ４１８２ｇ，
ＭｇＳＯ４７２８ｇ，ＫＯＨ４１３ｇ，ＣａＳＯ４·２Ｈ２Ｏ０９３ｇ，
８５％磷酸 ２６７ｍＬ，ＰＴＭ１４３５ｍＬ［６］。
发酵诱导培养基：５０％甲醇（含１２ｍＬ／ＬＰＴＭ１）
诱导液。
１１３ 试剂
蛋白胨、酵母提取物购自 ＢＩＯＢＡＳＩＣＩＮＣ；尿
微量白蛋白测定试剂盒购自上海名典生物工程有
限公司；ＨＳＡ多克隆抗体购自成都生物制品所；ＣＰ
抗体购自晶美生物公司；其他试剂均为国产分
析纯。
１１４ 主要仪器
ＢＩＯＦＬＯ１１０发酵罐（美国ＮＢＳ公司）；Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ
ＭＫ３酶标仪（上海雷勃分析仪器有限公司）。
１２ 方法
１２１ 摇瓶培养方法
从新鲜平板上挑单一菌落到 ＹＰＤ活化培养基
中，３０℃、２００ｒ／ｍｉｎ培养 ２０～２５ｈ后，按１００ｍＬ
１０％接种量接入到 ５００ｍＬ摇瓶生长培养基中，
３０℃、２００ｒ／ｍｉｎ培养２４ｈ。离心，弃去上清，按摇
瓶生长培养基体积与摇瓶诱导培养基体积之比为
２∶１，接入摇瓶诱导培养基中，２００ｒ／ｍｉｎ培养。每
２４ｈ补加１００％甲醇至一定质量浓度，并取样进行
分析，生物量以干细胞质量浓度（ｇ／Ｌ）计。
１２２ ７Ｌ发酵罐发酵培养
从新鲜平板上挑单一菌落到 ＹＰＤ活化培养基
中，３０℃、２００ｒ／ｍｉｎ培养２０～２５ｈ后，按５％的接种
量接种到装有４Ｌ发酵培养基的７Ｌ发酵罐中进行
分批培养。
相关参数控制如下：１）溶氧及转速 空气流速
３Ｌ／ｍｉｎ，最低搅拌转速 ３００ｒ／ｍｉｎ，上限搅拌转速
８００ｒ／ｍｉｎ。分批阶段控制溶解氧在３０％，诱导阶段
控制在１５％，发酵罐转速自动控制。２）ｐＨ 自动流
加３０％的氨水和５０％磷酸调节ｐＨ，培养过程中ｐＨ
５０，诱导过程中 ｐＨ６０。３）温度 ３０℃，自动控
制。４）补料的流加 根据溶解氧情况手动控制流
加泵的流速，使发酵液中的甲醇质量浓度≤１０ｇ／Ｌ。
１２３ 甘油质量浓度测定
采用高碘酸钠氧化滴定法测定甘油质量浓度［７］。
１２４ 发酵液中甲醇质量浓度测定
气相色谱（ＧＣ）法［８］分析甲醇质量浓度。
１２５ 尿微量白蛋白测定
以尿微量白蛋白测定试剂盒检测。
１２６ 发酵产物的ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分析
１２７ 电泳分析方法
参照文献［４］目的蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。
２ 结果与讨论
２１ 摇瓶培养条件的优化
笔者在前期的摇瓶发酵实验中，对部分发酵条
件已经进行了摸索，包括对初始甘油质量浓度、甲
醇质量浓度、溶氧、ｐＨ等进行了优化。其中甲醇质
量浓度，诱导时间对发酵影响最大。所以，在发酵
过程中进行甲醇诱导质量浓度和诱导时间的优化
具有重要意义。
２１１ 培养Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ甲醇诱导时间优化
考察诱导持续时间对外源蛋白在菌体内表达和
６２ 生 物 加 工 过 程 第７卷
积累的影响，并可据此判断发酵罐培养的放罐时间。
按摇瓶培养方法对基因工程菌 Ｐｐａｓｔｏｒｉｓ用５
ｇ／Ｌ甲醇诱导培养９６ｈ，每２４ｈ取样分析外源蛋白
表达情况，结果见表１。
表１ 不同时间加入甲醇对菌体生长及目的
蛋白表达量的影响
Ｔａｂｌｅ１ Ｅｆｅｃｔｏｆｍｅｔｈａｎｏｌｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔｐｅｒｉｏｄｏｎ
ｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
诱导时间／
ｈ
ρ（生物量）／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（ＨＳＡ ＣＰ）／
（ｍｇ·Ｌ－１）
０ ３３７ ０
２４ ６２５ １３６２
４８ ８１８ ２２８１
７２ ９９５ ４２７４
９６ １０９０ ３８５２
由表１可以看出：甲醇诱导２４ｈ时已有目的蛋
白表达；诱导７２ｈ时，ＨＳＡ ＣＰ融合蛋白表达量升
高至４２７４ｍｇ／Ｌ；再延长时间至９６ｈ，发酵液中目
的蛋白量下降到约３８５２ｍｇ／Ｌ。其原因可能是蛋
白酶降解了部分ＨＳＡ ＣＰ融合蛋白，所以选择在加
入甲醇后７２ｈ为收获发酵液的最佳时机。
２１２ 甲醇质量浓度对外源蛋白表达水平的影响
按摇瓶培养方法对基因工程菌 Ｐｐａｓｔｏｒｉｓ进行
诱导培养，每隔２４ｈ补加甲醇使其质量浓度分别为
５、１０、１５、２０ｇ／Ｌ，培养时间为７２ｈ，测得蛋白含量结
果见表２。
表２ 甲醇质量浓度对目的蛋白表达量的影响
Ｔａｂｌｅ２ Ｅｆｅｃｔｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎ
ｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ρ（甲醇）／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（生物量）／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（ＨＳＡ ＣＰ）／
（ｍｇ·Ｌ－１）
５ ８３５ ２３４３
１０ ９８４ ５２９７
１５ ７０１ １６８２
２０ ６３３ １１３９
诱导培养过程中，甲醇既做基因工程菌的 Ｃ源
又扮演着诱导剂的角色。适当质量浓度的甲醇可
以促进目的蛋白的表达，但过量的甲醇可使菌体中
毒，从而抑制目的蛋白的表达。由表２可知：甲醇质
量浓度为１０ｇ／Ｌ时，毕赤酵母表达的 ＨＳＡ ＣＰ融
合蛋白量最高，可达５２９７ｍｇ／Ｌ。甲醇质量浓度小
于１０ｇ／Ｌ时，蛋白量较少的原因可能是甲醇成为限
制性底物，抑制目的蛋白的表达。因此，选择１０ｇ／Ｌ
为最佳的甲醇诱导质量浓度。
２２ ７Ｌ发酵罐发酵培养
２２１ 发酵罐培养结果
利用摇瓶发酵确定的甲醇诱导时间和质量浓度，
在装有４Ｌ培养液的７Ｌ发酵罐中培养。发酵过程中
定时取样，测定其中菌体密度、甘油残留量、甲醇残留
量、ＨＳＡ ＣＰ融合蛋白表达量，结果如图１所示。
图１ 发酵罐中发酵过程曲线
Ｆｉｇ．１ Ｃｕｒｖｅｓｆｏｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎｆｅｒｍｅｎｔｏｒ
分批培养１９ｈ左右溶氧陡然上升，菌体生长趋
势开始减缓。离线检测甘油已耗尽，菌体已处于饥
饿状态。此时开始流加诱导培养基以启动表达目
的蛋白。在表达外源蛋白阶段，控制诱导表达培养
基的补料速率，以维持溶氧质量分数１５％左右。补
加甲醇诱导之前，ＨＡＳ ＣＰ融合蛋白质量分数几乎
为０。开始补加后，目的蛋白质量浓度迅速升高。
在诱导７２ｈＨＳＡ ＣＰ融合蛋白表达量最大达到
３６８４５ｍｇ／Ｌ，此后目的蛋白量呈现下降趋势。整个
发酵过程中，干细胞质量浓度最大达５６４３ｇ／Ｌ。生
７２ 第５期 孔静静等：产ＨＳＡ ＣＰ融合蛋白毕赤酵母的发酵条件优化
产强度为３９２０ｍｇ／（Ｌ·ｈ），目标蛋白的比生产速率
为５１２ｍｇ／（Ｌ·ｈ）。
２２２ 发酵产物ＳＤＳＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定
发酵３６ｈ开始出现蛋白的降解条带，相对分子
质量４５×１０４左右。随着发酵时间不断延长，降解
产物随之增加，８４ｈ时目标蛋白含量已减少，结果
见图２。
１—低相对分子质量蛋白质标准；２～８—诱导１２、２４、３６、
４８、６０、７２和８４ｈ的发酵液上清
图２ 发酵罐中发酵液ＳＤＳＰＡＧＥ分析
Ｆｉｇ．２ ＳＤＳＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ
ｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎｆｅｒｍｅｎｔｏｒ
对发酵结束后发酵液中的目的蛋白进行 Ｗｅｓｔ
ｅｒｎｂｌｏｔ分析鉴定，结果如图３所示。
１—低相对分子质量蛋白质标准；２—ＨＳＡ抗体分析ＨＳＡ试样；
３—ＨＳＡ抗体和ＣＰ抗体分析发酵液上清
图３ 融合蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定
Ｆｉｇ．３ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ
由图３可知：在相对分子质量７０×１０４处出现
ＨＳＡ和 ＣＰ抗体发生特异性反应的条带，并且相对
分子质量大于６３×１０４处的ＨＳＡ特异性反应条带，
说明发酵的终产物具 ＨＳＡ和 ＣＰ抗原性，证明为
ＨＳＡ和ＣＰ的杂合分子。
３ 结 论
使用无机盐培养基发酵培养基因工程菌 Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ，培养基成分为碳源甘油或甲醇、维生素、盐
类、微量元素和水，没有可能作为热源或毒素的成分。
若使用有机培养基，其成分主要为进口酵母膏及蛋白
胨，价格比较昂贵。而无机盐成分比较低廉，降低了
生产成本。７Ｌ发酵罐培养试验中，通过控制４Ｌ发
酵液中各条件：培养ｐＨ５０，诱导ｐＨ６０，溶解氧３０％
和１５％，质量浓度１０ｇ／Ｌ的甲醇诱导７２ｈ，干细胞质
量浓度达到５６４３ｇ／Ｌ，ＨＳＡ ＣＰ融合蛋白产量达到
３６８４５ｍｇ／Ｌ。
参考文献：
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ｏｔｒｏｐｈｉｃｙｅａｓｔＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓｗｉｔｈｍｉｎｉｍａｌｐｒｏｔｅａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄ
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８２ 生 物 加 工 过 程 第７卷