全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
-:@CE0E]BHFC,.BDY@B1FBIE00TCJ@CEEF@CJ
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收稿日期"$%&% =%( =$#
基金项目"国家林业局-/#!.项目#$%%* =# =$
作者简介"黄文娟#&/!$&$女安徽安庆人硕士研究生研究方向"纤维素酶分子生物学%丁少军#联系人$教授博士生导师TRA,@."G0:,BR
_HCc:B?A,@.2IBA
重组毕赤酵母高密度发酵生产
内切型纤维素酶的条件优化
黄文娟刘"睿张"达丁少军
#南京林业大学 化学工程学院南京 $&%%($
摘"要"为优化内切型纤维素酶高密度发酵工艺条件在 d) V发酵罐高密度发酵条件下研究内切型纤维素酶表
达量以及毕赤酵母胞外蛋白酶合成水平的影响因素( 研究表明"经 (#% AV甘油补料发酵后在甲醇诱导阶段14
为 )d%温度为 $) e利用甲醇检测流加控制器控制甲醇体积分数为 %d((i k%d()i时TOM表达量可达 #$&d&
MW6AV比采用固定甲醇流加速率的发酵方法提高了 &d#/ 倍(
关键词"内切纤维素酶%发酵%高密度%优化%巴斯德毕赤酵母
中图分类号"f7/$)%7!*""""文献标志码"5""""文章编号"&*$ =(*!#$%&%$%# =%%)& =%*
+9F.G.H5F.2/27:36F340:2/I.F.2/1724.G942Z./; F-0942I3:F.2/27
0/I2;63:5/510./-.;-:06I0/1.FA 704G0/F5F.2/273#$( 4("5)&"
4W5+O[ECR_H,CVMWaH@P45+O3,3M+OQ:,BR_HC
#-B.EJEBD-:EA@I,.TCJ@CEEF@CJ +,C_@CJUBFE0?FKWC@\EF0@?K +,C_@CJ$&%%( -:@C,$
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ECBH01FB?E,0E8K:@J: IE.RGEC0@?KDEFAEC?,?@BC @C d) VDEFAEC?EFZEFEB1?@A@9EG2f:EFE0H.?00:BZ?:,?
,D?EF(#% AVJ.KIEFB.DEGR8,?I: DEFAEC?,?@BC GHF@CJ?:E1FBIE00BDAE?:,CB.@CGHI?@BC 14 )d%
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%d()i Z@?: ,AE?:,CB.0EC0BF K@E.G BDTOMZ,0#$&d& MW6AV Z:@I: Z,0&d#/RDB.G0:@J:EF@C 1FBGHIR
?@BC IBA1,FEG ?B?:,?Z@?: IBC0?,C?AE?:,CB.DEEG@CJF,?E2
K0A L24I1"ECGBJ.HI,C,0E% DEFAEC?,@BC% :@J: IE.RGEC0@?K% B1?@A@9,?@BC% #).$ 3$,40/,
""内切型纤维素酶#ECGBJ.HI,C,0E$是纤维素酶系
中的重要组分在纤维素酶水解中起着重要作用
它和纤维二糖水解酶#IE.B8@B:KGFB.,0E$
#
葡萄糖
苷酶#
#
:&#RO.HIB0@G,0E$协同作用可将纤维素转
化成葡萄糖( 因此内切型纤维素酶在木质纤维生
物炼制)食品工业)纺织工业及造纸工业中均有着
广泛的应用*&+ ( 从草菇#G0*C$/%*$ C0*C$)%$$ 中克
隆出一种新的中性内切型纤维素酶#ECGBJ.HI,C,0E
MTOM$的基因#%6M$ #OECY,Ch +Bd5U($/($$和
一般的真菌纤维素酶不同该酶在中性 14环境中
具有较高活性和较强的热稳定性*$+ 将有望成为理
想的纺织及造纸工业用纤维素酶*(+ (
""甲醇诱导型强启动子 5>S& 巴斯德毕赤酵母
##).$ 3$,40/,$表达系统具有表达水平高)易于高
密度发酵的优点现已被广泛应用于外源蛋白的
表达*# =)+ ( 但是在高密度发酵条件下外源基因
的表达量不仅取决于基因本身还受到巴斯德毕
赤酵母胞外蛋白酶的影响及各种环境因素的制
约易导致重组蛋白稳定性的下降因此常常需要
经过优化发酵工艺才能获得适合不同用途的
蛋白(
由于内切型纤维素酶在多个领域中的广泛应
用如何通过异源表达技术进一步提高酶的活性因
而受到了高度的关注** =+ ( 以本实验室构建的工程
菌OQ&&) T`O& H`?l为生产菌种在 d) V发酵罐上
对高密度发酵过程中的多个因素进行优化探讨了
内切型纤维素酶生产的最佳发酵条件以期降低工
程菌的发酵成本)提高酶活力)确定最佳的培养条
件为中试生产提供科学的依据(
D?材料与方法
D=D?材料
&2&2&"菌株和质粒
" " 含 有 %6M基 因 的 #).$ 3$,40/,菌 株
OQ&&) T`O& H`?
l
由 本 实 验 室 构 建 并 保 存 于
=!% e甘油管中(
&2&2$"主要试剂
""L+Y培养基#MC\@?FBJEC 公司美国$酵母提取
物#>^@BG 公司英国$酪蛋白胨 # >^@BG 公司英
国$-` -R+,#Q@JA,公司美国$其他试剂均为国
产分析纯(
&2&2("培养基
""L;3活化培养基#J6V$" 葡萄糖 $%蛋白胨
$%酵母膏 &%(
""Y` OL种子培养基" L+Y&(d# J6V甘油 &%
J6V生物素 %d# AJ6V( & AB.6V14*d% N
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#
缓冲
液 &%% AV6V(
""高密度发酵基础培养基" !)i 4
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AV6V( 用 (%i氨水调至所需 14(
""微量元素#;f` &$ #J6V$" -HQ>
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)d% AV6V(
""补料生长培养基#J6V$"甘油 )%%#含 &$ AV6V
;f` &$(
""发酵诱导培养基"纯甲醇#含 &$ AV6V;f` &$(
&2&2#"仪器
""+YQ Y@BU.B&&% 台式多功能组合式生物发酵
罐美国+YQ 公司%U- $%%$ 型甲醇检测流加控制
器上海苏泊信息技术有限公司%W &!%% 紫外分光
光度计 日本日立公司% )#&a离心机 德国
T11ECGBFD公司(
D=B?方法
&2$2&"工程菌的活化和种子培养
""将保存于=!% e的菌种在 L;3固体培养基平
板上划线于 (% e培养 #! :挑典型单菌落接种于
&% AVL;3液体培养基中$%% F6A@C 培养 &* :按
&i的接种量接种到装有 (%% AVY` OL种子培养基
的 & V三角瓶中在(% e)$)% F6A@C 条件下培养至
@A
*%%
为 * 左右作为高密度发酵的菌种(
&2$2$"高密度发酵条件的优化
""将上述 Y` OL培养液按 &%i接种量接入 d) V
+YQ Y@BU.B&&% 发酵罐中起始发酵培养基为 ( V基
础培养基以 (%i氨水或 &%i 4
(
;>
#
控制发酵液
的 14为 )d%调节纯氧通气量和搅拌转速使溶氧
#3>$水平不低于 ()i控制温度为 $! e( 培养基
-源&! :左右耗尽溶氧突然上升后饥饿 %d) : 以
彻底消耗残余的-源然后开始通过蠕动泵限制性
流加 )%% J6V的甘油甘油补料时间为 ! :甘油补
料体积除特别说明外一般为(#% AV( 在补料阶
段温度和 14分别控制在 $! e和 )d%溶氧水平不
低于 ()i( 甘油分批补料阶段结束饥饿 %d) : 以
彻底消耗残余的甘油开始流加纯甲醇开始流加
速度为每小时 ( AV6V稳定 ( :( 在随后的 ! : 内
将流速逐步增加到 &% AV6V并维持至发酵结束通
过调节转速和通气量使溶氧水平维持在 $)i之上(
在整个发酵周期定期进行-3>R01@hEfE0?.检验每
隔 * :取样进行菌体湿质量及上清液中蛋白表达
量)纤维素酶酶活力)胞外蛋白酶活性)Q3QR;5OT
电泳等指标的检测(
""发酵条件的优化包括温度)14)甘油流加量)甲
醇浓度等参数(
&2$2("菌液酵母湿质量测定方法
""取 &d% AV毕赤酵母工程菌发酵液于 &d) AV
事先称过质量的离心管中离心 &% A@C去除上清液
称质量扣除空离心管质量即为菌体湿质量(
&2$2#"内切纤维素酶活和蛋白酶活性的测定
""内切纤维素酶活的测定是以 -` -R+,为底物
$) 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
用 QBABJK@R+E.0BC方法具体过程按文献*$+的说明
进行反应体系的 14和温度分别为 d) 和 )% e(
纤维素酶活单位#W$定义为在规定反应条件下
& AV酶液每分钟产生相当于 &
"
AB.葡萄糖所需的
酶量( 蛋白酶活性的测定是以酪蛋白#I,0E@C$为底
物按文献*!+的方法进行其活性单位定义为& AV
酶液每分钟产生相当于 &
"
J酪氨酸所需的酶量(
发酵液中蛋白质的含量按 Y-5蛋白质定量试剂盒
#Y-5;FB?E@C 500,KN@?f:EFABQI@EC?@D@I;@EFIE美
国$法进行以牛血清蛋白为标准品(
B?结果与讨论
B=D?9"对 #%)表达量的影响
""巴斯德毕赤酵母可在 14(d% kd% 范围内正常
生长但适宜外源蛋白表达的 14随着目的蛋白不
同而有很大的差异( 低 14可以有效地降低发酵液
中蛋白酶的活性而有利于某些蛋白的表达不过也
有报道高 14对有些蛋白的表达更为有效*/ =&%+ (
""经 (#% AV))%% J6V的甘油补料发酵后在甲醇
诱导阶段温度为 $! e)溶氧维持在 $)i以上)分
别调整 14为 (d%)#d% 及 )d%比较这 ( 种高密度发
酵条件下TOM活性)菌体密度#湿质量$)胞外蛋白
酶活性的差异( 经过 $ :的甲醇诱导毕赤酵母的
密度均达到 #$% J6V#图 &#,$$表明在这 ( 种 14
下菌体的生长良好%但是 TOM的表达量有显著的差
异在 14#d% 和 )d% 诱导时TOM的表达量较高分
别可达 &*d&)&*d MW6AV而在 14(d% 时TOM的
表达量仅为 $d#! MW6AV#图 $$%14(d% 时的胞
外蛋白酶活性要远低于 14#d% 和 )d% 时的胞外蛋
酶活性表明低 14能降低内源性蛋白酶的形成和
分泌#图 &#I$$(
""为了进一步了解低 14条件下甲醇诱导时 TOM
表达量很低的原因分析了重组 TOM在不同 14下
的稳定性( 发现在 14(d% 时重组TOM的稳定性要
明显低于 14#d% 及 )d% 时的稳定性#表 &$推测这
可能是影响TOM在 14(d% 时表达量低的主要原因(
由表 & 可知非蛋白酶因素引起的稳定性下降
是毕赤酵母高密度发酵需要考虑的重要问题( 同
时在 14#d% 的发酵实验中#图 $$进一步延长
发酵时间从 $ :到 /* :发酵液中TOM的活性呈下
降趋势这也可能和重组 TOM在低 14条件下稳定
性较差有关因此在下面的实验中甲醇诱导阶段
的 14确定为 )d%(
图 D?9"对菌体密度)#%)活性和
胞外蛋白酶活性的影响
N.;=D?#70:F1279"2/L0F:06L0.;-F#%D 5/I
0[F45:063654942F0510942I3:F.2/
表 D?重组#%)在不同9"下的稳定性
E5J60D?!F5J.6.FA 2740:2GJ./5/F#%D ./I.7040/F9"
时间
相对活性6i
14(d% 14#d% 14)d%
% &%%d% &%%d% &%%d%
&% ()d# !d# !/d$
&) (&d/ (d) !/d(
$) % )!d& !d)
() % )&d !!d)
#% % )$d& !d%
)) % #$d/ !#d#
B=B?温度对#%)表达量的影响
""温度是影响外源基因在毕赤酵母中表达水平
()"第 # 期 黄文娟等"重组毕赤酵母高密度发酵生产内切型纤维素酶的条件优化
的重要因素很多报道表明"将甲醇诱导温度从
(% e下降到 $) e会显著地提高外源基因的表达水
平*&&+ ( 不过尽管相关报道较多关于降低诱导温
度能提高目的蛋白的表达水平的机制目前仍未完
全阐明(
""经 (#% AV)质量分数为 )%i的甘油补料发酵
后在甲醇诱导阶段14为 )d%溶氧保持在 $)i以
上温度分别 $) e和 $! e比较了这 $ 种诱导温度
对TOM活性)菌体密度)胞外蛋白酶活性的影响发
现在温度 $) e和 $! e时菌体的生长无明显的差
异#图 $#,$$%$) e)经 $ : 诱导后TOM的活性可
达 $#/d* MW6AV是 $! e时的 &d#! 倍继续延长诱
导时间TOM的活性稳定上升经 /% : 诱导后可达
$!(d# MW6AV#图 $#8$$%分析这 $ 种温度下诱导胞
外蛋白酶的合成曲线发现在 $! e条件下诱导
(* :后胞外蛋白酶可被检测到而在 $) e条件下
(% :后才被检测到#图 $#I$$( 发现在 $) e发酵
时重组TOM蛋白分子的完整性好经 Q3QR;5OT电
泳检测目的蛋白未发现降解#数据未列$( 降低温
度可提高TOM的表达水平的原因可能是胞外蛋白
酶含量下降以及在低温度下更有利于目的蛋白的
折叠使目的蛋白稳定性提高( 因此在下面的实
验中甲醇诱导阶段的温度确定为 $) e(
B=M?甘油补料量对#%)表达量的影响
""外源蛋白的表达水平一般和发酵液中菌体的
密度成正比关系但是菌体密度过高往往导致溶氧
水平不足)发酵控制困难)目的蛋白易降解等不利
结果*& =$+ ( 控制补料量是保持细胞密度的主要方
法本实验比较了 $ 种不同甘油流加量的补料发酵
对TOM活性)菌体密度)胞外蛋白酶活性的影响(
采用固定流加速度的方法经过 ) : 和 &% : 补
料后补料量分别达到 $%% AV和 #)% AV诱导阶段
的温度)14及溶氧分别为 $) e) )d% 和大于 $)i(
结果表明#)% AV补料发酵时由于起始菌体密度
较高甲醇诱导 * : 后TOM就进入快速表达阶段
合成速度远高于 $%% AV补料发酵#图 (#,$$%在诱
导 #! :后TOM的活性达到最高但是继续延长诱导
时间虽然菌体仍然继续生长但 TOM的活性开始
下降因此最高表达量仅为 &#!d$ MW6AV( 对于
$%% AV补料发酵在整个诱导过程中TOM活性稳定
增加但增速较慢经 /% :诱导后其最终比酶活为
&#% MW6AV#图 (#8$$( 因此 $%% AV和 #)% AV补
料发酵时TOM的活性分别只相当于 (#% AV补料发
图 B?温度对菌体密度)#%)活性和
胞外蛋白酶活性的影响
N.;=B?#70:F127F0G9045F3402/L0F:06L0.;-F
#%D 5/I0[F45:063654942F0510942I3:F.2/
酵#图 $ # 8$$ 时的 #/d)i和 )$d#i( $%%) (#%)
#)% AV这 ( 种流加量的最大发酵得率经过 /%)/% 和
#! :诱导后分别为 %d($))%d*$ 和%d#&( MW6J( 类
似的现象在其他重组蛋白表达中也有报道如重组
蛋白FYB+fT#4I$的发酵得率在发酵液中细胞湿质
量浓度为 $%% J6V时最高提高菌体密度会导致发
酵得率下降*&$+ (
""在 #)%AV补料发酵时 TOM表达量较低的原因
可能是胞外蛋白酶的活性较高如图 ( #I$所示
/% :时胞外蛋白酶含量达到 *# MW6AV分别为 (#%)
$%% AV补料发酵的 &d! 和 &d!/ 倍(
B=@?甲醇体积分数对#%)表达的影响
""甲醇体积分数是影响巴斯德毕赤酵母表达水
平的最重要因素对于 H`?l菌株甲醇不仅是诱导
物还需作为能源甲醇体积分数过高会产生毒害
#) 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
图 M?甘油流加量对菌体密度)#%)活性和
胞外蛋白酶活性的影响
N.;=M?#70:F127700I./; Z263G027;6A:04262/L0F:06
L0.;-F#%D 5/I0[F45:063654942F0510942I3:F.2/
作用过低则难以维持菌体生长和目的蛋白的诱导
合成( 对甲醇体积分数的控制方法目前有不同的
策略在上述实验中是按照MC\@?FBJEC公司的发酵指
南采用固定甲醇流加速度的方法进行的即每小
时&% AV6V并定期以-3>R01@hEfE0?.方法检查甲醇
流加是否过量但是在发酵后期甲醇体积分数仍然
会过量影响目的蛋白的表达水平( 为了精确了解
甲醇体积分数对TOM表达的影响使用了甲醇检测
流加控制器通过自动调节流加速度维持甲醇体积
分数在较稳定的范围为此比较了 ( 种甲醇体积分
数#%d&)i k%d$i)%d((i k%d()i 和 %d#i k
%d)i$时TOM的表达水平( 诱导阶段的温度)14
和溶氧量分别为 $) e)d% 和大于 $)i(
""菌体的生长量和甲醇的体积分数成正比如图 #
#,$所示当甲醇体积分数为 %d#i k%d)i时菌体
图 @?甲醇体积分数对菌体密度)#%)活性
和胞外蛋白酶活性的影响
N.;=@?#70:F127G0F-5/26:2/:0/F45F.2/2/L0F
:06L0.;-F#%D 5/I0[F45:063654
942F0510942I3:F.2/
密度最高%但是对于TOM的表达当甲醇体积分数为
%d((ik%d()i时TOM的活性最高说明低或高的
甲醇体积分数都会显著地降低TOM的表达水平#图 #
#8$$%胞外蛋白酶的活性也和甲醇体积分数成正比
#图 ##I$$主要原因可能和高甲醇体积分数时菌体
密度较高有关( 本实验结果表明利用甲醇检测流加
控制器可以精确地维持甲醇体积分数在稳定的范围
大大提高 TOM的表达水平经 Q3QR;5OT电泳检测
#图 )$TOM无明显降解( 通过软件分析目的蛋白条
带的强度和发酵液中其他蛋白条带的强度之间的比
例其含量占发酵液中总蛋白含量的近!)i( 经!# :
的诱导发酵液中 TOM的最大活性可达 #$&d&
MW6AV是利用固定流速流加甲醇方法的 &d#/ 倍(
综合考虑选择利用甲醇检测流加控制器控制甲醇
))"第 # 期 黄文娟等"重组毕赤酵母高密度发酵生产内切型纤维素酶的条件优化
体积分数为 %d((ik%d()i(
注"& k( 为 !)!# 和 /% : 后的发酵上清液
图 P?发酵上清液中重组#%)的!\!VW*%#电泳分析
N.;=P?!\!VW*%#5/56A1.12740:2GJ./5/F#%)./
:36F34013904/5F5/F65/0
M?结?论
""在高密度发酵条件下由胞外蛋白酶及各种环
境因素导致重组蛋白的稳定性下降是影响外源基
因在巴斯德毕赤酵母的高效表达的重要原因( 系
统的研究了包括 14)温度)甘油流加量和甲醇体积
分数对菌体生长)内切型纤维素酶表达量以及毕赤
酵母内源性蛋白酶合成水平的影响( 研究表明"经
(#% AV甘油补料发酵后在甲醇诱导阶段14为
)d%温度为 $) e利用甲醇检测流加控制器控制甲
醇体积分数为 %d((i k%d()i时TOM表达量可达
#$&d& MW6AV比采用固定甲醇流加速率的发酵方
法提高了 &d#/ 倍(
参考文献"
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