全 文 ：纤维素酶基因在毕赤酵母中的拷贝数对其表达的影响 %*5 )* !"#$"% &%’()*"’：3&# +4 % $%2)5 9#,?+5 ,+ 5#,#1, ?)=?;.#6#. #>;
李 兵，庄国强，林建强，曲音波!
（山东大学 微生物技术国家重点实验室，济南 !"#$##）
摘 要：将 %&’扩增得到的瑞氏木霉纤维素内切酶!（()*+,",$，-,./012)234 !，(5!）基因片段插入巴斯德毕赤酵
母（!"#$"% &%’()*"’）质粒 6%7&89 中，构建了 (5!的分泌表达质粒 6%7&89,4.:，然后经线性化后电转化导入 ! ; &%’()*"’
5<$$" 受体菌中。获得的阳性克隆经 <=<,%>5(和酶活检测，证明工程菌株发酵上清液中含有表达的 (5!蛋白并
具有纤维素内切酶酶活。通过荧光定量 %&’确定了各菌株的拷贝数并对不同拷贝数范围的菌体生长和 (5!的表
达做了比较。实验结果表明，低拷贝重组菌有着相对较好的 (5!表达量。
关键词：内切纤维素酶 (5!；巴斯德毕赤酵母；表达；拷贝数
中图分类号：?@ <8A: ;:!@ 文献标识码：> 文章编号：$A@! B :A@C（!##A）#- B ##$! B #"
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&’ 5&+ #6/4#++5’1 51 ,#$%#* -*+.&"#+
D7 EF).，GHI>J5 50+,KF2).，D7J LF2),KF2).，?I MF),N+
（
03F). %&’ OU4U)FK04 Y TU4 (5! W23 F)34QO4* F)O+ 6%7&89，2 !"#$"% &%’()*"’ V41O+Q，O+ PF4/* OU4 Q41+XNF)2)O
341Q4O4 6/23XF* 6%7&89,4.: Y TU4 6%7&89,4.: W23 OQ2)3R+QX4* F)O+ ! / &%’()*"’ 5<$$" Y TU4 (5! W23 4Z,
6Q4334* 2)* 341Q4O4* F)O+ OU4 NQ+OU Y TU4 F)34QO .4)4/3 1+6P )0XN4Q F) U+3O .4)+XF1 =J> W4Q4 *4O41O4* NP [?,
%&’ Y TU4 14//,.Q+WOU 2)* (5! 21OFVFOP +R Q41+XNF)2)O WFOU *FRR4Q4)O 1+6F43 +R F)34QO4* (5! W4Q4 2)2/P\4* Y
TU4 Q432/O3 30..43O OU2O OU4 3OQ2F) WFOU 3F)./4 1+6P 3U+W4* N4OO4Q (5! 4Z6Q433F3 OU2) OU4 3OQ2F)3 WFOU UF.U4Q
.4)4 1+6P )0XN4Q3 Y
8#0 9’4:+：4)*+./012)234 (5!；!"#$"% &%’()*"’；4Z6Q433F+)；1+6P )0XN4Q
纤维素酶产生菌分泌的纤维素酶都是复合酶系，
纤维素酶系由内切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶和
",葡萄糖苷酶构成。由内切葡聚糖酶和外切纤维二
糖水解酶把纤维素降解成纤维二糖，进而由",葡萄糖
苷酶分解成葡萄糖。纤维素酶高产菌瑞氏木霉分泌
的纤维素酶目前已知的就有 @种。而在酶学研究中，
需要大量的单一酶作为研究材料。利用分子生物学
手段构建出表达单一纤维素酶的工程菌株是获得单
一纤维素酶的有效方法，由其构建成的表达系统也可
以成为纤维素酶酶工程改造后的蛋白表达平台。
! ; &%’()*"’ 表达系统作为一种真核基因表达系
统，因其外泌的杂蛋白少、发酵密度高、发酵材料价
格低廉等优点，已经被广泛地用于外源蛋白的表达。
虽然纤维素外切酶在 ! ; &%’()*"’ 表达系中存在过度
! 收稿日期：!##A,#A,$"
基金项目：国家 8@: 项目（J+;!##:&E@$A###）；国家自然科学基金项目（J+;:#:@##:A）；山东大学微生物技术国家重点实验室开放基金项目
作者简介：李 兵（$8@@,），男，山东省泰安市人，在读博士生，主要研究方向：蛋白质组学。
联系人：庄国强，副教授，(,X2F/：.0+KF2).\U02).] 3*0; 4*0; 1)
J+V Y !##A
·$!·
生 物 加 工 过 程
&UF)434 L+0Q)2/ +R EF+6Q+1433 ().F)44QF).
第 - 卷第 - 期
!##A 年 $$ 月
万方数据
糖基化而酶活较低等问题，但目前已有胡椒!!"，#!
内切葡聚糖酶族 $%&’ "、$%&’ (、$%&’ ")、草菇 *+" 在
! , "#$%&’($ 中表达［"，(，-］。目前未见利用 ! , "#$%&’($
表达瑞氏木霉内切纤维素酶 *+"的报道。
本研究将从瑞氏木霉 $./0 文库中获得的 &1-
基因插入到 ! , "#$%&’($ 表达载体 234%56 中，通过
+#"7耐受度实验确定出单拷贝转化子和多拷贝转
化子，并通过荧光定量 3%8 确定了多拷贝转化子的
拷贝数。实验结果表明低拷贝转化子更有利于 *+
"在 ! , "#$%&’($ 中的表达。
! 材料和方法
" ," 材 料
" ," ," 菌株和质粒
! , "#$%&’($ 菌株 +9"": 及 !()*(# 和 + , )&,( 穿梭
质粒 234%56 用于 *+"的表达（ 4;<=>?@1&;）。 + , )&,(
AB"C5（本实验室保存）用于载体的克隆。含有 *+
"的 $./0序列的质粒 20A#C"!&1- 由本实验室构建
保存。
" ," ,( 主要试剂
./0限制性内切酶 +)&8#，-&%#，!./#以及
0#1 酶（DE6E8E大连公司、/&F *;1’E;G H=@’EIJ）；./0
纯化回收试剂盒和 ./0 连接试剂盒（DE6E8E 大连
公司）；琼脂粉和酵母浸粉（北京奥博星生物技术公
司）；蛋白胨（中国医药上海化学试剂公司）；K/H（上
海生工有限公司）；卡那霉素 +#"7（德国莫克公司中
国公司分装）。
" ,( 实验方法
" ,( ," 3%8扩增 *+"$./0
以 *+"结构基因上下游末端碱基序列设计引
物，引物分别含有限制性内切酶 +)&8#、-&%#的酶切位
点。以含有 *+"全长 $./0的质粒 20A#C"!*+"为模
板，3%8扩增 *+"结构基因。使用琼脂糖凝胶电泳
分析 3%8产物。设计的正向引物为 :L!%%0+00DD%
%DD+%0+%+D%%0D0%，引入 +)&8#酶切位点；在反向
引物 :L%0D+%++%%+%+0+D+%D0%DDD%DD+% 中引入
-&%#酶切位点。3%8反应条件为：5# M预变性 # N=;，
5# M变性 " N=;，)C M复性 " N=;，O( M延伸 ( N=;，循
环 -C次；最后 O( M保温 "C N=;。
" ,( ,( 酵母表达载体的构建
用 +)&8#和 -&%#双酶切 234%56 质粒和 &1-
的 3%8 扩增产物，然后用 DE6E8E 连接试剂盒把切
开的质粒和 &1- 片段连接起来，构建成毕赤酵母表
达载体 234%56!&1-。把重组质粒转化入大肠杆菌
AB"C5，扩增保存。
" ,( ,- 质粒转化酵母菌
使用 !./#把 234%56!&1- 线性化，在 " :CC P，
(:$Q，#CC%条件下，电转化感受态细胞 ! , "#$%&’($
+9"":。转化后，菌液涂布于 B. 筛选平板上，-C M
培养直到转化子出现。
" ,( ,# BR> S型转化子的选出
使用 B.和 BB 两套培养基平板，在相对应位
置分割成小格，筛选出在 B. 和 BB 平板上都能快
速生长的菌株，即为 BR> S型重组子。
" ,( ,: 酵母重组子的 3%8鉴定
用 K3. 培养基培养重组子菌株，提取染色体
./0；用扩增 *+" $./0 的引物验证重组子的整
合。3%8条件：5# M初变性 # N=;，5# M变性 " N=;，
)C M退火 " N=;，O( M延长 ( N=;，共进行 -C 个循环，
最后 O( M延长 "C N=;。
" ,( ,) 重组酵母的表达和产物检测
根据 4;<=>?@1&;标准分泌型产物表达方案，采用 (
步法发酵。第一步使用 HB+K 培养基培养菌体，直到
培养液 23)CC达到 (,C以上，离心收集菌体。第二步将
菌体转移入 ":C NT HBBK培养基中，(7 M，(:C ?·N=; U "
摇瓶培养。HBBK培养基甲醇体积分数为 ",:V［#，:］。
离心取得上清液，通过 9.9!30+* 电泳检测产
物蛋白，以 ! , "#$%&’($ +9"": 的培养液作为对照。把
上清液作为粗酶液加入 %B% 纤维素的磷酸缓冲溶
液中。在 :C M下反应。然后用 9@N@1W= 法检测反应
液中的还原糖［)］。酶活单位定义为每分钟转化底物
纤维素产生 "$N@’ 还原糖为 " 个酶活单位。
",(,O 工程菌株的拷贝数范围确定和表达能力比较
转化子拷贝数先通过 +#"7 耐受度来初筛，然后
通过荧光定量 3%8 确定各菌株的拷贝数。3%8 引
物：上游引物使用 234%56 操作手册公布的&!XE$>@?
外 泌 信 号 肽 标 准 引 物 :L!D0%D0DD+%%0+%0!
DD+%D+%，下游引物使用 234%56 操作手册公布的
0YZ" 表 达 盒 -L 标 准 引 物 序 列 :L!+%000D+!
+%0DD%D+0%0D%%。荧光定量 3%8反应条件：:C$T
反应体系，9KH*8 +8**/ 荧光染料 " ,($T，5# M "
N=;，:) M " N=;，O( M -C J，-: 次循环。3%8仪荧光
检测增益 ::，荧光检测温度 7# M。
拷贝比例数 [ 计算模板比例数实际加入的染色体组套数
由荧光定量 3%8测定出计算模板比例数，其测
(CC) 年 "" 月 李 兵等：纤维素酶基因在毕赤酵母中的拷贝数对其表达的影响 ·"-·
万方数据
定方法是根据 !"#$% &%$$’ ( 只和双链 )’* 结合
时才产生荧光。所以每个 +,% 循环都检测一次荧
光强度，形成荧光强度-循环数曲线，由于是多个菌
株的模板同时进行 +,%，就形成了一组光强-循环数
曲线。再由计算机自动确定该曲线组中重合性较好
的位置为荧光光强阈值线，则该阈值线对应的该菌
株的横坐标，即为该菌株在到达该阈值线所经过的
循环数个数。即 ,.值。由于 +,% 反应总趋势上是
遵循 /—0—1—23 即 / 的 ! 次几何级数增长原理，
所以根据 ,. 值就可以由 +,% 监控软件自动计算出
各样品管内目的基因片段含量的相互比例即计算模
板比例数。再由 "#/34测定的初始模板浓度和加入
+,% 反应的模板体积可得实际加入染色体套数，这
样就求得拷贝数比例数。再根据前述 &021 耐受实
验检测出的单拷贝菌株作为基准，就可以得到各待
测菌株拷贝数。
对不同拷贝数菌株表达能力的比较采用 / 步发
酵法，一定时间间隔取样，一部分样品测定 "#344菌
浓，另一部分样品离心去细胞后立即冷冻，待整体发
酵完成后使用 !565789 法［3］测定出各时间点的内切
纤维素酶酶活。
! 结 果
/ :2 $&!基因表达载体的构建
通过 +,%方法把 $&!结构基因从模板 ;*<042-
=7>上扩增出来，$%&%"、’&("双酶切。关联到穿
梭质粒 ;+(,?@上，构建分泌表达型质粒 ;+(,?@-=7>
（图 2）。质粒 ;+(,?@-=7> 采用双酶切鉴定。证明
$&!基因被正确地插入到 ;+(,?@质粒中。
图 2 质粒 ;+(,?@-=7> 组成
A97 :2 ,5BCDEFGD95B 5H ;IJC69K ;+(,?@-=7>
/ :/ 酵母重组子的筛选和鉴定
将由 )*+"线性化的重组质粒 ;+(,?@-=7> 电
转化感受态宿主菌 ) : ,-.(&/0. &!22L（M9C N），获得相
应的 M9C O转化子。电转化后的转化子分别接种到
P)和 PP 平板上，筛选出 PFD O 转化子。筛选出的
M9C O PFD O转化子经染色体 +,% 检测，=7> 片段已经
被整合到宿主菌的染色体上（图 /）。
2：#Q2R0 MJ=! 6JES=E；/：=7> J6;I9H9=K HE56 DEJBCH5E6JBD 7=B56=
图 / 转化子的基因组 +,%检测
A97 :/ &=B56= +,% JBJI8C9C 5H DEJBCH5E6JBD
/ :> 酵母重组子的诱导表达及表达产物的检测
从阳性克隆中 挑 选 出 菌 株 并 以 ) : ,-.(&/0.
&!22L 菌株作为对照，采用 / 步发酵法进行甲醇诱
导表达。经 !)!-+*&$ 检测，发现在阳性克隆泳道
上，相对分子质量 0 :3 T 240附近有明显的蛋白质条
带，与计算得到的 $&!蛋白相对分子质量（0 :3/2R
T 240）相符，可能是由于毕赤氏酵母对产物蛋白的
后期修饰，尤其是糖基化作用引起的。在出发菌株
对照泳道的相同位置上没有相应的蛋白带（图 >）。
2：!F;=EBJDJBD 5H &!P!-=7>；P：+E5D=9B 6JES=E；
&2 U &/：&!22L JC DV= G56;JE9C5B
图 > 重组菌发酵液 !)!蛋白电泳
A97 :> !)!-+*&$ JBJI8C9C 5H DV= =W;E=CC=K ;E5KFGDC
另取各阳性克隆的发酵上清液，并以出发菌株
&!22L 按同样方法培养、取样作为酶活对照组，用
·20· 生物加工过程 第 0 卷第 0 期
万方数据
!"#"$%& 方法检测纤维素内切酶酶活。在各阳性转
化子的摇瓶发酵上清液中都检测到了纤维素内切酶
酶活，各转化子的酶活在 ’ () * +, - . / 01 (1 * +, - .
2 3 #4不等。
. (0 工程菌株拷贝数的确定和动力学参数的比较
转化子的拷贝数通常和表达量有着密切的联
系［)，5］，确定不同拷贝数转化子的生长和外源蛋白
表达量，是筛选高效表达转化子的重要指标。
! ( "#$%&’($ 表达系统可初步通过 60+5 耐受度来筛选
单拷贝和多拷贝的转化子，进一步采用荧光定量
789的方法确定拷贝数。通过荧光定量 789 法对
60+5耐受度在 , (.:，.，0 #$ 3 #4 的 1 株转化子拷贝
数进行了确定，它们的拷贝数分别是 +，1，’ 拷贝。
并分别对 1 株不同拷贝数的转化子进行了生长和酶
活表达参数的比较（图 0）。
—!—;6! <=>&?&>% "@ 1A="B% C>D<&E；
—"—;6! <=>&?&>% "@ C&E$FG ="B% C>D<&E；
—#—;6! <=>&?&>% "@ ’A="B% C>D<&E；
—$—H&"#
P&>K N&@@GDGE> ="B% EL#MGD
在甲醇诱导条件下，单拷贝菌株和 1 拷贝菌株
的生长速率相近，’ 拷贝菌株在前 ) K 比生长速度最
快，但 ) K 后立即进入平台期。在培养 : K 后，单拷
贝、1 拷贝菌株酶活急速上升，分别约达到 .1+ 2 3 #4
和 +5+ 2 3 #4，培养 0 K 后单拷贝菌株出现酶活，’ 拷
贝菌株酶活极低，1 拷贝和单拷贝菌株的累积表达
水平相近。
! 讨 论
本实验低拷贝数转化子的酶活表达高，’ 拷贝转
化子则几乎不表达酶活。一般随着拷贝数的增加表
达产量也会相应增加，如 Q=$DGP 等［R］在实验中发现，
重组 8S0,4的最高产量是在含有 5 个以上拷贝数的
菌株中获得的，8F
插入的拷贝数成正相关，不过个别情况下拷贝数增加
对产量也会产生负面效应。比如某些分泌效率低的
蛋白在过高表达的情况下会对分泌途径形成负反馈
抑制。本实验也表明，含单拷贝或中低拷贝的宿主菌
更适合某些外源蛋白的表达。因此，基因拷贝数对基
因产物表达量的影响是无法预测的。高表达菌株的
筛选应以表达的蛋白量或酶活为标准。
本发酵实验都是摇瓶发酵，尚未对该酵母表达
系统进行培养基和发酵过程优化，所以该酵母表达
系统中纤维素酶的表达量还是比较低的。通过对发
酵培养基和发酵过程的 BT 值、发酵温度、菌体培养
密度、菌体的比生长速率、甲醇的流加策略等优化进
步。有望进一步提高本表达系统的 ;6!表达能力。
和瑞氏木霉纤维素复合酶系的每升 ., $到 1, $
数量级的高表达量相比，目前毕赤酵母包括酿酒酵
母的表达系都无法获得丝状真菌单一纤维素酶的高
表达。这种差异可能体现在蛋白折叠因子的不同，
特别是和二硫键形成相关的蛋白质二硫键异构酶
（BD">G&E N&CL@&NG &C"#GD
有待于后续的码录。
本研究成功地构建了瑞氏木霉内切纤维素酶
;6!的 ! ( "#$%&’($ 表达系统，并确定了低拷贝数更
适合内切纤维素酶 ;6!在 ! ( "#$%&’($ 表达。研究表
明 ! ( "#$%&’($ 表达系统可以作为 ;6!蛋白工程改造
后的表达平台。
.,,’ 年 ++ 月 李 兵等：纤维素酶基因在毕赤酵母中的拷贝数对其表达的影响 ·+:·
万方数据
参考文献：
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2$#&&)+* ,$%*&4+$9%*,&［@］0 -#*#，!CCQ，!D（E）：!CF;EPP 0
［!P］N.%$# @，/1+$#$ N，B31K?+.O V，#, %. 0 A>2$#&&)+* +4 A-" %*5 WXY #*6#;
.+2# =.71+2$+,#)*［@］0 H#,?+5& H+. B)+.，!CCD，!PF：EPC;EET Z
国 外 动 态
BL将投 T 亿美元建能源生物研究院
BL日前宣布，将投资重大基础科学研究，并把研究成果应用于生产新的更清洁的能源。为此，BL 计划
在未来 !P %内投资 T 亿美元，依托美国或英国的一家重点学术中心，建立世界上首座专注于生物科学能源研
究的实验室。
BL集团首席执行官约翰·布朗指出，公司已经开始与一些世界领先的大学进行洽谈，以确定 BL 能源生
物科学研究院（A;BX）的最终合作方。该研究院的初期研究项目预计在 EPPQ 年底前启动，将集中在能源生物
科学的 F 个重要领域：研发生物燃料的新成分，改善现有的运输混合燃料中生物燃料的效率和混合比；开发
新技术，以提高并加快有机物质转换为生物燃料分子的过程，由此提高农作物中可作为生产生物燃料原料部
分的比例；运用现代植物科学，研发能够生长于非农用土地的、可以提高植物中能量物质产量的新植物种类。
据了解，能源生物科学研究院的成员为来自所在大学和其他学术机构的科学家，以及少数 BL 公司的专
家。该研究院将开展专有应用项目的研究，以便日后实现商业应用。同时，研究院承担的基础研究对科技界
开放。在专利技术方面，BL能源生物科学研究院将为 BL 集团炼油与营销业务板块所辖的新的生物燃料业
务单元提供支持。这个新成立的业务单元的任务是满足日益增长的在传统化石燃料中添加生物成分的需
求。该研究院还将为那些在生物科学开发应用领域处于领先地位的生物科技企业提供一个交流平台。
BL集团预计，未来 !P %生物燃料需求将显著增长。BL希望能源生物科学研究院可以将科学技术与 BL
在能源加工、调配、营销和产业政策方面的知识和专长相结合，从而为满足全球对低碳能源的需求创造实质
性的新产品提供可能。
除了专注于先进的生物燃料研究以外，该研究院还将探索如何将生物科学应用于能源领域的更多途径，
其中包括：提高石油和煤层气的采收率、改善碳埋存技术等。
（李 晖）
·!G· 生物加工过程 第 < 卷第 < 期
万方数据