全 文 ：Sep．2008
·44·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第5期
2008年9月
PseudomonasputidaS1海藻糖合成酶
表达质粒的构建及诱导条件优化
姚 林，段作营，史仲平，毛忠贵
(江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡214122)
摘要：采用PCR方法从PseudomonasputidaSI中克隆出编码海藻糖合成酶的基因treS，并与质粒pQE30T相连，构
建了表达质粒pQE-TS2。将此重组质粒转化宿主茵EcoliM15进行诱导表达。十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶
SDS—PAGE电泳结果表明，treS基因在大肠杆菌中获得了高效表达。通过对诱导温度、诱导荆浓度、加诱导荆时间
和诱导时间的优化研究，在茵液生长至OD咖值为0．6时，加入诱导剂IPTG至终浓度O．01mmoL／L，20℃诱导20h，
蛋白的表达量达到每克干细胞89mg的蛋白，粗酶液酶活达到19U／mL。
关键词：Pseudomona5put／da；海藻糖合成酶；克隆；表达；诱导条件
中图分类号：Q93 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)05—0044—06
ConstructionofPseudomonasputidaSl trehalosesynthaseexpression
vectorandoptimizationofinductionconditions
YAOLin，DUANZuo—ying，SHIZhong—ping，MAOZhong-gui
(KeyLaboratoryofIndustrialB otechnologyoftheMinistryofEducation，SchoolofBiotechnology．
JiangnanUniversity，Wuxi214122，China)
Abstract：TreSgenencodingtrehalosesynthasefromPseudomonasputidaS1wasamplifiedbyPCRand
WasligatedtopQE30Tplasmidasthe xpressionplasmidpQE—TS2．E．coliM15 competentc llswere
transformedbytherecombinantpl smidpQE-TS2andinducedbyIPTG．ThetrehalosesynthasegeneWas
confirmedinE．colibySDS—PAGE．Theinfluencesofinductionemperature，IPTGconcentration，indue—
tiontime，andi uctiondurationwereinvestigated．WhenthecellsgrewintoOD600was0．6，IPTGWas
addedtothefinalconcentrationof0．01 mmol／L．After20hinductionat20℃．theexpressionofthe
trehalosesynthasereached89mg／g(DCW)．Theactivityof hetrehalosesynthaseinthecrudeenzyme
wasdetectedas19U／mL．
Keywords：Pseudomonasputida；trehalosesynthase；clone；expression；inductionconditions
海藻糖是由两个葡萄糖分子以及，a-1，1糖苷键
连接而成的非还原性双糖，是生物体在不良环境中
所产生的抗逆应激物之一，对生命体和生物活性物
质具有保护功能。其特殊的理化性质和生物学功
能使其在食品工业、化妆品工业、医药工业、农业和
分子生物学等领域有广泛的应用前景‘川。
收稿日期：2008旬2．28
基金项目：国家863计划资助项目(2006AA020101)
作者简介：姚林(1981一)，男，江苏句客人，硕士研究生，研究方向：生物化工。
联系人：段作营。副研究员，E—mail：duanzy025@163．corn
万方数据
2008年9月姚林等：PseudomonasputidaS1海藻糖合成酶表达质粒的构建及诱导条件优化 ·45·
海藻糖合成酶是近年来新发现的一种酶，它通
过分子内转糖基化作用，将a，a—l，4糖苷键连接的
麦芽糖一步法转化为a，Q一1，1糖苷键连接的海藻
糖旧]，是海藻糖合成最重要的途径之一。目前，已
从Pimelobactersp．R48、ThermusaquaticusATCC33—
923、PseudomonasstutzeriCJ38、Deinococcusradio—
durans等多种微生物中克隆和鉴定出海藻糖合成酶
编码基因treS【3-6；。虽然Pseudomonasputida是最
先发现产海藻糖合成酶的细菌之一，但是有关P．
putida海藻糖合成酶基因的克隆与表达还未见研究
报道。
本文通过基因工程的方法，在大肠杆菌中表达
P．putidaS1的海藻糖合成酶基因，并通过诱导条件
研究，提高其表达活性，为采用该重组酶酶法转化
麦芽糖生产海藻糖奠定技术基础。
1材料与方法
1．1菌株与质粒
海藻糖合成酶产生菌恶臭假单胞杆菌(Pseudo—
monAl噶putidaS1)由本实验室筛选并保存071；大肠杆
菌JMl09，大肠杆菌M15和质粒pQT30T由本实验
室保存。
1．2酶与试剂
BamHI、HindIII内切酶、T4DNA连接酶、Taq
DNA聚合酶、PCR试剂均为大连宝生生物有限公司
产品；酵母提取物和蛋白胨为Oxiod公司产品；质粒
抽提试剂盒、DNA纯化试剂盒、胶回收试剂盒均购
自上海生工有限公司。其他试剂均为国产分析纯
试剂。
1．3培养基
大肠杆菌完全培养基LB(g／L)：蛋白胨10，酵
母提取物5，NaCI10，pH7．0。添加质量分数1．5％
琼脂为LB固体培养基。使用前根据需要加入氨苄
青霉素(终质量浓度100斗g／mL)和卡那霉素(终质
量浓度50I山g／mL)。
质粒转化所用培养基为SOC(s／L)：蛋白胨20，
酵母提取物5，NaCl0．5，KCl0．186，MgS041．2，葡
萄糖3．963。
1．4分子克隆技术
质粒DNA的提取、酶切、连接、感受态细胞的制
备、转化等均按文献[8]及相关的试剂盒操作说明
书进行。PCR产物纯化参照上海生工有限公司小
量PCR纯化试剂盒说明书。
1．5 PseudomonasputidaSI海藻糖合成酶基因treS
的PCR扩增
根据本研究室对P．putidaS1菌株treS序列分
析结果(该序列已提交Genbank数据库，Accession
Number：EU310374)，用primer5．0软件设计PCR扩
增引物。
上游弓I物：5’一AAGGATCCACCCAGCCCGAC—
CCGTCATA-37．
下游引物：57一CCCGGAAGCTTTTACACATGTC—
CACTGCTG．3’。
在上下游引物5’端分别设计了BamHI和Hind
Ⅲ酶切位点(下划线部分)，便于连接到表达载体
pQE30T上。所有引物均由上海生工生物有限公司
合成。用上海生工生物有限公司的试剂盒提取P．
putidaS1基因组DNA。以P．putidaS1总DNA为
模板，进行PCR扩增：95cc，5min，然后94℃，
30S，65℃30S，72℃3min完成34个循环，72℃
延伸10rain。
1．6重组质粒的构建
PCR产物用DNA胶回收试剂盒回收，纯化后用
BamHI和HindIII进行双酶切，然后与同样用
BamHI和HindIII双酶切过的pQE30T载体连接，
连接产物转化大肠杆菌JMl09感受态细胞，涂布在
含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃静置培养过夜，
提取阳性克隆酶切电泳验证，筛选得到重组质粒命
名为pQE．TS2，如图1所示。
图1表达质粒pQE—TS2
Fig．1Schematicoverviewofthexpression
plasmidpQE—TS2
1．7重组菌的诱导表达和表达产物分析
将重组质粒pQE—TS2转化到表达宿主大肠杆
菌M15感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素和卡那霉
素的LB平板上，37℃静置培养过夜，同时以
万方数据
·46· 生物加工过程 第6卷第5期
pQE30T空载体为对照。挑取阳性克隆酶到含氨苄
青霉素和卡那霉素的LB培养液中，37℃振荡培养
过夜，然后按体积分数2％接种量接种到新鲜LB培
养液中，37℃培养一定时间，加IPTG诱导表达。取
一定量发酵液经8000r／min离心10min，得到的菌
体沉淀悬浮于50mmoL／L、pH为8．1的磷酸盐缓冲
液中(浓缩10倍)，冰浴超声波破碎(300W，工作2
s，间歇4s)15min。细胞破碎液在11000r／min下
离心20min，离心后上清液即为粗酶液归J，用于目
的蛋白SDS．PAGE分析和酶活力测定。
1．8海藻糖合成酶酶活力的测定
以40g／L麦芽糖为底物，加粗酶液于50mmol，
pH为8．1的磷酸盐缓冲液中，20℃反应30min后，
100cc沸水浴10min灭酶活，冷却至室温后，HPLC
测定海藻糖含量¨01。在上述条件下每分钟转化1
p。mol麦芽糖生成海藻糖的量定义为1个酶活单位。
2结果与讨论
2．1 重组质粒pQE—TS2的构建、筛选和鉴定
用设计的引物在TaqDNA聚合酶的作用下，扩
增得到海藻糖合成酶treS基因片段，PCR产物经
1％琼脂糖凝胶电泳鉴定表明，在2100bp左右有一
明显的带(图2)，与预期一致。
1一PCRproduct：M—DNAmarker-EcoTl4I
图2 TreS基因的PCR产物电泳分析
Fig．2PCRproductoftreSgene
已正确连接到表达载体上。
M—DNAmarkerk-EcoTl4I；l—pQE-TS2／HindⅢ；
2一pQE-TS2／HindⅢ+BamHI；3--pQE30T／HindIII
图3重组质粒pQE—TS2的酶切鉴定
Fig．3Identificationofrecombinantpl smidpQE·TS2by
restrictionendonueleasereaction
2．2重组茵(M15／pQE—TS2)的构建和表达产物的
SDS．PAGE分析
将鉴定正确的重组质粒pQE—TS2转化到表达
宿主大肠杆菌M15，同时以pQE30T空载体为对照。
挑取单菌落到含氨苄青霉素和卡那霉素的LB培养
液中，37℃振荡培养至0D㈣值约为0．6时，加IPTG
到至浓度0．1mmol／L，37oC诱导表达8h。将诱导
培养的重组菌经超声破碎并离心后，分别收集上清
液和沉淀物，同时进行SDS—PAGE电泳检测。结果
(图4)表明重组菌和对照相比在相对分子质量为
7．5×104处出现特异蛋白带，与核酸序列理论推算
的蛋白质相对分子质量的相符，表明treS基因在重
组菌中得到表达。但是日的酶蛋白几乎全在沉淀
中，上清液中只有少量的可溶性目的蛋白，目的蛋
白绝大部分以包涵体的形式存在。
将扩增得到的DNA片断回收后用限制性内切
酶BamHI、HindIll双酶切后与同样用BamHI、
HindIll双酶切后的表达载体pQE30T连接，连接产
物转化JMl09感受态细胞。筛选阳性克隆，用限制 M—Pr0【einmarker；I--SupernatantofEcoliM15／pQE30T；
性内切酶胁ndIII单酶切和限制性内切酶BarnHI、箭舞￡篙20fE““M1579QE一’rs2；3一Del)(J8i“”4
E”“
胁砌Ⅱ1双酶切电泳鉴定，结果(图3)表明日的片断 Fig．4魁，。喜著薏麓三鉴：篙息卺篷丞．PAGE
万方数据
2008年9月姚林等：PseudomonasputidaS1海藻糖合成酶表达质粒的构建及诱导条件优化 ·47·
包涵体的形成原因是基因工程菌的表达产率
过高，合成速度太快，以至于没有足够的时间进行
折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白问非特异
性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度，形成高密
度、非水溶性、无活性的固体颗粒’11|。研究表明在
低温条件下诱导，可减少包涵体的形成¨2|。这样就
避免了通过变性、复性来恢复蛋白质活性的棘手问
题，给下面的纯化工作带来方便。
2．3诱导条件的初步优化
2．3．1 诱导温度对重组海藻糖合成酶表达水平的
影响
重组菌在37℃摇瓶培养至DD枷值为0．6时，
加入IPTG(终浓度为0．1mmol／L)分别于15℃，
20℃，25℃，30℃下诱导24h，SDS．PAGE电泳结
果如图5所示。通过分析可知，温度对目的蛋白表
达的影响较大，在低温条件下诱导表达有助于包含
体的减少。在低温下，蛋白质的合成速度减慢，有
利于合成的重组蛋白正确折叠，从而减少包含体的
形成，增加表达产物中可溶性蛋白含量。在15～
20℃下诱导，上清液中均可获得较多的可溶性目的
蛋白。由于20℃时菌体的生长速度相对较快，可缩
短发酵周期。因此最终确定重组菌的最适诱导温
度为20℃。
M—Proteinmarker；1、3、5、7--SupematantofEco／i
M15／pQE-TS2inducedat15oC，20℃。25qC，30℃；
2、4、6、8--DepositionofE．coliM15／pQE-TS2
inducedaI15℃．20℃．25℃．30℃
图5诱导温度对海藻糖合成酶表达水平的影响
Fig．5Effectofinductionemperatureontrehalose
synthaseexpression
2．3．2IPTG浓度对重组海藻糖合成酶表达水平的
影响
重组菌在37℃摇瓶培养至∞枷值为0．6时，
分别加入不同剂量的IPTG，使其终浓度分别为
0．01，0．05，0．10，0．20，0．50，1．00mmol／L，20oC诱
导24h，超声波破碎菌体。高速离心后取上清液进
行SDS．PAGE电泳分析，结果如图6所示。从图6
中可以看出，采用低IPTG浓度诱导，上清液中可溶
性目的蛋白浓度较高，而提高IPTG诱导浓度，虽然
海藻糖合成酶总表达量有较明显升高(结果未图
示)，但上清液中可溶性目的蛋白浓度却有所降低。
同时由于IPTG具有毒副作用，高浓度的IPTG添加
量会毒害细胞，使细胞生物量有所降低，因此，确定
诱导剂IPTG的最适浓度为0．01mmol／L。
M—Proteinmarker；1～6--Supematantof￡cotiM15／pQE-TS2
inducedby0．01，0．05，0．10．0．20，0．50，1．00mmoL／LIPTG
图6 IPTG浓度对海藻糖合成酶表达水平的影响
Fig．6EffectofIIrFGconcentrationon rehalose
synthaseexpression
2．3．3诱导时机对重组海藻糖合成酶表达水平的
影响
重组菌37℃摇瓶培养至0D锄值为0．18，
0．25，0。31，0。38，0．48，0。58，0．71，0．86不同阶段，
分别加入IPTG(终浓度为0．01mmol／L)20℃诱导
24h，取样并进行SDS—PAGE电泳分析。从图7可
以看出，过早的加入IPTG进行诱导，微生物还处于
生长初期，目的酶蛋白的大量表达干扰了宿主细胞
的生长。进入对数生长期之后诱导，目的蛋白的表
达量基本维持不变，因此确定最适诱导时机为DD鲫
值为0．6。
2．3．4IPTG诱导时间对重组海藻糖合成酶表达水
平的影响
重组菌37℃摇瓶培养至优)枷值为0．6时，加入
IPTG(终浓度为0．01mmoVL)20℃诱导，每隔4h
取样，以测定重组海藻糖合成酶的表达情况(见图
8)。结果表明，诱导20h后重组海藻糖合成酶的表
达量基本维持不变，因此诱导可在20h左右结束。
万方数据
·48· 生物加工过程 第6卷第5期
M—Pmteinnmrker；l一8一Totalpr einofE．coliM15／pQE—TS2
inducedat0D枷=O．18，0，25，0．31，0．38，0．48，0．59，0．71，0．86
图7 IPTG诱导时机对海藻糖合成酶表达水平的影响
Fig．7Effectofdifferentco centrationofE．c liM15
pQE—TS2withIPTGontrehalosesynthaseexpression
M—pmteinmarker；1—8一Totalpr einofE．coli
M15／pQE—TS2inducedafter0，4，8．12，16，20，24，36h
图8 IPTG诱导时间对海藻糖合成酶表达水平的影响
Fig．8EffectofIPTGinductiondurationontrehalose
synthaseexpression
2．3．5优化条件下重组菌的诱导表达
重组菌37℃摇瓶培养至DD咖值为0．6时，加
入IPTG(终浓度为0．01mmoL／L)20℃诱导20h，
超声波破碎菌体制取粗酶液，并进行SDS—PAGE电
泳和酶活力分析。如图9所示，优化条件下发酵结
束后重组菌的DCW为1．14g／L，表达量达到了每
克DCW产89mg目的蛋白，较优化前有了大幅度的
提高。经测定粗酶液的酶活达到19U／mL。
3结论
用PCR的方法克隆出海藻糖合成酶编码基因
treS，并成功连接到表达载体pQE30T上，构建了产海
藻糖合成酶重组菌株，实现丁该酶在大肠杆菌中的高
M—PmLeinmarker；1--SupematantofEcoliM15／pQE-TS2：
2--SupematantofE．coliM15／pQE30T
图9优化条件下表达产物的SDS．PAGE电泳分析
Fig．9SDS—PAGEanalysisofthexpressionpr duct
Offtheoptimalcondition
效表达。研究表明在菌液生长至DD㈣值为0．6时，
加入诱导剂IPTG至终浓度0．01mmol／L，20℃诱导
20h，每克干细胞产89mg目的蛋白量达到了
89mg／g，粗酶液酶活为19U／mL。在此基础E，本实
验室正在进行该酶的纯化以及酶学性质的研究。
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乙烯的生物炼制技术应用推广前景广阔
乙烯是重要的化工原料，目前基本来源于石油炼制。我国乙烯年消费量已超过2000万t，其中50％以
上依赖进口。伴随着石油资源的枯竭和油价的高涨，以生物可再生资源替代石油资源开发基于生物制造的
化学产品成为当今世界的研究热点。国家“十一五”863计划在生物和医药领域将“生物乙烯的生物炼制技
术”作为重点项目，由南京工业大学牵头，联合中国石化、安徽丰原集团等国内优势企业和科研单位进行联
合攻关，目前取得了可喜的进展，展示广阔的应用前景。
乙烯生物制造的关键技术在利用秸秆、甜高粱、木薯等非稚原料生产乙醇，乙醇催化转化成乙烯。在国
家863计划的支持下，研究开发了秸秆预处理技术，筛选获得高活力纤维素酶菌株和能同步高效利用五碳糖
和六碳糖发酵乙醇的优良菌株以及强耐受性菌株，实现了发酵工艺技术的优化。研究开发的高效脱水催化
剂，其乙醇单程转化率和乙烯选择性均大于98％，催化剂强度在80～120N／cm，寿命大于2000h。开发的
熔盐控温系统新型反应器，使乙烯收率由原来的89％提升至96％。针对乙烯分离系统的稳定性生产问题，
成功开发出热管和高效翅片组合式换热器，实现低位热能的高效利用，解决工艺堵塔的问题，实现工艺过程
的节能减排。3000t／a秸秆乙醇产业化成套技术中试研究已在中国石化展开。
中石化计划在2010年建立1万t／a生物乙烯生产装置，并配套10万tVAE；丰原宿州生物化学股份有限
公司计划投资建立生物乙烯生产线，并配套18万t生物基乙二醇，预计2010年3月可建成投产。
(朱宏阳)
万方数据