全 文 ：第5卷第2期
2()07年5月
生物加工过程
ChilleseJournal0fBioprocessE“gince““g
Mav211()7
·57·
热激对恶臭假单胞菌S1胞内海藻糖合成酶的影响
段作营，贺 魏，李珍妮，毛忠贵
(江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡214036)
摘要：研究了热激对恶臭假单胞茵sI胞内海藻糖合成酶的影响，通过正吏试验确定了热斑的最佳争停：热激在
产酶初期(培养20h)进行，热激时培齐温度由20t升高至30‘℃．处理时间30mm，在此条件下，海藻糖合成酶的
酶活提高了76％。同时在热激后茵体的耐盐性也有较大增强
关键词：恶臭假单胞茵s1；海藻糖合成酶；热激
中图分类号：Q93 文献标识码：^ 文章编号：1672—3678(2007)02㈣57一(】4
Efkctofheatshocktreatmentontrehalosesynthase0f
体P距咖monnsp“f五口hS1
DUANZuo—yj“g，HEWei，LIZhen·ni，MA0Zhong—gui
(TkKe?Lab01atoryoflndllsln羽B】I)t㈤hnolo吕y，MjJlJst‘y。fEducation，sch帅】0fBmlw’}mulog，
soutl㈣Y“gtzeuni㈣rsjoy．wujcl214036．c¨na)
Abstract：肺eef传ctofheatshockont}letrehaloscsymhyaseas““ty0fReu幽"砌nⅡ5PⅢi如Slwasinest卜
galcd．7nleoptinⅥJn1conditionsforheatshoukwercdeteminedhytheorthogonale。pcrimcntn】ethodsas如l—
luws：+nleheatshockwastanedwhence儿sgrcwfor20h，and1as廿”g30血n，whjlcthetenlpemmre1n。
creasjn譬fbm20℃to30℃．Anersuchalr蹦mlcntiheacl；v1’yoftrehalose8yFllllasew蕊jncl℃asedby
76％．andt11eosmotlcoleranceofthecellswascnhance(1
Keywords：P^eudomonn5pufidⅡS1；trehalose8ynthas8；heats}mckh℃atllwnL
海藻糖是细胞在不良环境条件F产牛的一种
重要的抗逆应激物之一，它对生物活性物质的保护
功能已受到广泛关注⋯。Bmwn。“和crowe等”报
道了海藻糖在保护胞内可溶性酶和细胞膜稳定。降
方面的功能。carvalllciro引，Lew褂划和I{0ttiger一。则
分别对热激和盐胁迫条件Fsncc^。m“，℃∞ceMiide
的应激反应进行r研究，发现酵母细胞内有海藻糖
的积累，并且海藻糖的量与细胞对不利环境的耐受
性有密切关系。
目前至少已发现3条海藻糖生物合成途径，包括
磷酸海藻糖合成酶途径、发芽寡糖摹海藻糖途径和海
藻糖合成酶途径。“。关于热激的研究主要集中在第
一种代谢途径。Vi晒I“c”l将敲除热激蛋白(h叩)
的酵母菌进行热激处理，结果诱导了6一磷睃海藻糖合
成酶，并使胞内海藻糖的量增加。M“a等”通过对
脉胞菌腩t一印omca—sn热激处理，使6一磷酸海藻糖
合成酶的酶活提高r80％。Neves等””1在酵母细胞
生长达稳定期后将培养温度由28屯升高至40℃，这
时胞内海藻糖的量和6一磷酸海藻精合成酶的酶活都
得到提高。G∞pati等”“通过热激使嗜菌异小秆线
收稿日期：如06-10—23
作者简介：段作营(1982一)，男，山东菏泽人，副研究员，研究方向：工业微生物
联系人：毛忠贵，靛授，E-m8II：du蚰翠@‘妒ue‘{u．r。n
万方数据
·58 生物加工过程
虫H6nmri印^om的胞内6一磷酸海藻糖台成酶的酶
活提高。马向东等”“通过热激也使酵母内编码6一磷
酸海藻糖合成酶的蛐1基因高效表达。Keitll等”1
通过热激使极端嗜热古细菌毋，womm知rmsw胞内
海藻糖合成酶的基凼高效表达，研究热激对恶臭假
单胞菌ne“do—n“sPⅢi如s1中海藻糖合成酶的影
响以及热激的条件，旨住通过热激来提高海藻糖合成
酶的活性。这为海藻糖合成酶途径生成海藻糖的研
究提供了基础工作。
1材料与方法
1．1菌种
恶臭假单胞菌ne“domonnsp“删n 1fn本实验
窜筛选所得。
1，2培养基和溶液
1 2，1斜向培养垦
牛|土J膏3．0∥L，蛋[J胨10g／L，氯化钠5O
g／T．，琼脂20g／L，海藻糖5．0g／L，pII7．0～7．2。
1．2．2种子堵养基
葡萄精28．9g／L，酵母粉1．86∥L，麦芽精
12。4g／L，N屯c6I{50i·2H：O0．5∥L，蛋白胨5。0
苦／L，Na2HP03·12H20O．5g／I．，pH7 5．=
1．2．3发酵培养基
同种r培养基。
1．2．440g／L麦芽糖溶液的配制
麦芽糖4g，pH为8．1磷酸缓冲液loomL。
l 3实验方法
l 3，I培养条件
将菌株sl在斜面上活化，30℃条件下培养20
h，然后将其接种到种子培养基中，20。C培养24h
后以体积分数5％接种量接种到发酵培养基中培
养，20℃培养48h。
1 32粗酶被的制备
取一定量发酵液经8Ooor／min离心10m毗用
50mm01／T．的磷酸缓冲液(pH8 1)洗涤2次，去除
上清液再高速离心lOmin。得到的菌体沉淀悬浮于
磷酸盐缓冲液rp使其终质量浓度为100∥L，超声波
破碎(300w，工作2s，问歇4s)共12商n。细胞破
碎液在llooOr／min下离心20min，得到粗酶液。
1．3．3葡萄糖测定
采用sBA生物传感仪。
l_34蔚体生长测定
第5卷第2期
取适量发酵液}：4000∥min下离心lom·n．稀
释·定浓度后，用尤尼柯uV_2100紫外分光光度
计，在620nm波}乏下测定吸光值，以去离子水为对
照。所得的凄数乘以稀释倍数为菌体oD值。
1．3，5海藻糖合成酶酶疆力的测定
以40∥L麦芽糖为底物，加粗酶液于50
muloL／L，pH8．1磷酸盐缓冲液，20℃反应90n1抽
后，100屯沸水浴10min灭酶活，冷至窜温所JJ玎入
糖化酶(105u／mL)20¨L后．于60℃糖化6h，适当
稀释后测定其葡萄糖含量。以灭活的酶液为对照，
同样进行17述反应，以还原糖的下降表示其酶活力
海藻糖合成酶的酶活力定义为：在上述条什下
每分钟转化1斗mol友芽糖生成1“mn1海藻糖的酶
量定义为1个酶活单位(u／g)。
l 3．6热冲击的具体步骤
先将待热激的菌体培养物众摇瓶培养箱中取
出，冲击的摇瓶从摇床中取出，放入60t的恒温水
浴中快速升湍，约l～2min，发酵液温度达到热激的
温度后放人同样温度的恒温培养箱中，维持规定的
热激时间，最后将摇瓶转入普通摇床中继续进行常
规发酵，直至结束。
1．3，7正交实验
根据酶活变化的时问，热激温度和热激持续时
间作为正交因素，采用T．。(43)正交表得出最佳热激
条件．
2结果与讨论
2．1 未处理菌体胞内海藻糖合成酶活力变化曲线
未处理菌体在培养过程中的生长曲线和酶活
变化见图l。
￡m
+甫体生长， 一酶活力
图1菌体生长和酶活变化曲线
F培1T}l。gM汕aⅡdthe№halosesynthase
∽tlvitv()fnPu如mo眦s口以i如S1
f
b。
二
晕
蜒
崔
万方数据
万方数据
万方数据