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生物加工过程
ChineseJoumalofBi叩rocessEngineering
第5卷第3期
2007年8月
大剂量紫外诱变选育8一聚赖氨酸高产菌
张 超，王正刚，段作营，毛忠贵
(江落大学 生物王程学院，无锈214036)
撼要：以鸯氛链霉菌z—18为塞发嚣椿，经炙裁萤紫跨诱变怒壤，建s乏一氨基乙基一妻一事鼹氨酸(A嚣c)氨基酸绦秘
类似物平板定向育种方法，获得l株8一聚赖氨酸高产茵c—18，其发酵液中8一聚赖氨酸产量较出发菌株提高
42．9％。在含有50g／L葡萄糖的培养基中，8一聚赖氨酸积累可迭1．23∥L。
关键阋：￡-聚赖氨酸；弯爵；奄色链霉菌
中嘲分类号：R933 文献标识碣：A 文章编号：1672—3678《2()0r7)03—0064一05
Breedillgof挝曲一yield艿一PLmutantstrainswithUV
ZHANGChao，WANGZheng—gang，DUANZuo—ying，MA0Zhong—g糠
(SchoolfBiotechnology，Sout}lemYaIlg zeUniversity，Wu对214036，China)
A融豫c￡：笤一琵overpl蜩挂ei醒m娃￡撇swe重e菠巍警e鑫。|嘲&啪撒弦豁妊蔽戮z～8，坷徽e珏ns蠢黻uta一
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Keywordb：8一poly一五一1ysine；mutation；&r印幻myc邸nZ6“Zw
随着人们对食品安全性的认识和要求的逐步
提高，化学防腐剂受到严峻挑战，食品防霉防腐剂
的天然亿已成为今后的发震趋势。8一聚赖氨酸(8一
PL)是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能和臣大
商业潜力的微生物类食品防腐剂。它是日本酒井
乎一秘岛霞二在大量筛选肖侩簋静效线菌露发现
的一种新型聚合物Ho，由25—30个赖氨酸残基聚合
而成，经过进一步研究发现其具有强烈的抑菌能
力，可以作为防腐剂用于食晶的保鲜瞄l。￡一聚赣氨
酸抑菌谱广，在酸性和微酸性环境中对革兰氏阳性
菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有一定的抑菌效
果强·虽安全无毒Hj。由于醋本研究最早，已实瑷工
业化，￡一聚赖氨酸产生菌的摇瓶产量可以达到5．2
∥L，发酵罐产量达到48．3∥L¨o；国内起步较晚，
正蹩于实验壁阶段，其中，南京工监大学筛选鑫l株
北里孢菌属8一聚赖氨酸产生菌，发酵罐产量可以达
到6。65∥L‘引。
据文献[7]报道，8一聚赖氨羧生物合藏途径中
是以赖氨酸为前体物，通过聚合酶的催化反应生成
￡一聚赖氨酸，所以利用解除反馈抑制的方法可以达
到产物积累的目的。S一(2一氨基乙基)一￡．半胱氨酸
(AEC)是赖氨酸的结构类似物，选育AEc抗性株可
遗传性地解除Lvs对天冬氨酸激酶反馈调节。使用
抗结构类戗物突变株时，代谢调节被遗传性的解
载狡日期：2麟一ll磷
作港简介：张超(1978一)，男，山东济南人，硕士研究生，研究方向：微斑物育种。
联系人：毛忠费，教授，博士擞导师，E-mail：maozq@vip．163．com
万方数据
2007年8月 张超等：大剂量紫外诱变选育8-聚赖氨酸高产菌 ·65·
除，不再受培养物成分、浓度的影响，生产较为稳
定。本实验以z一18为出发菌株，经大剂量紫外线诱
变处理，AEC作为抗性筛选标记来挑选8一聚赖氨酸
高产菌株‘7。83。
1材料与方法
1．1材料
1．1．1出发菌株
白色链霉菌(Streptomycesalbulus)z一18由本实
验室分离得到。
1．1．2主要试剂
AEC为美国Sigma公司产品；甘氨酸为上海生
化技术公司产品；葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢钠和磷
酸氢二钠为中国医药(集团)上海试剂公司产品；硫
酸铵和甲基橙为中国金山化工厂(上海)产品。
1．1．3培养基
(1)贝特纳斜面培养基葡萄糖10g／L，蛋白
胨2g／L，酵母膏1g／L，琼脂15g／L，121℃下灭菌
20min，pH7．5。
(2)基本培养基(SG)甘油10g／L，琼脂18
∥L，酵母膏0．1∥LNa2HP040．68s／L，KH2P04
0．25g／L，MgS04·7H200．25g／L(NH。)2S040．66
∥L，ZIlS04·7H20O．05g／L,FeS04-7H200．01∥L，
pH7．O。1×10SPa，灭菌孵蛳n。
(3)抗性培养基基本培养基+AEC+甘氨酸。
(4)初(复)筛培养基甘油20g／L，酵母膏5
g／L，N％HP040．8g／L，KH2P041g／L，MgS04‘7H20
0．25g／L，(NH4)2S045g／L，ZnS04·7H200．05g／L，
FeS04·7H200．01g／L，定容至1L，pH7．0，1×103
Pa，灭菌30min。
1．2方法
1．2．1单孢子菌悬液制备
取一环菌体接种于斜面培养基上，30℃静置培
养，待孢子成熟后，用接种环刮下孢子，放入含有玻
璃珠的三角瓶中，振荡，滤纸过滤，除去菌丝。同时
血球计数板计数，适当稀释使孢子浓度达到108
个／mL。
1．2．2AEC和甘氨酸浓度的确定
将处于对数生长期的细胞培养液0．1mL分别
涂布于含有不同浓度的AEC和甘氨酸的sG平板
上，于30℃下培养72h，观察平板上菌落生长情况。
1．2．3紫外诱变筛选抗AEC突变菌株
(1)致死率测定取108个／mL的白色链霉菌
单孢子悬浮液10mL置于90mm无菌平板中，打开
皿盖，在磁力搅拌状态下用紫外灯照射，时间分别
为15，30，45，60，75，90，105，120，135，150s，取不同
照射剂量的孢子悬浮液0．1mL适当稀释涂皿，30℃
避光培养5d，待菌落长出，进行活菌计数。以未经
过诱变孢子悬浮液的活菌数为基准，计算细胞致死
率，绘制致死率曲线图。
(2)诱变按照与致死率测定相同的方法，将
孢子悬浮液照射一定时问处理。
(3)中间培养取5mL处理液于装有20mL
培养基的250mL三角瓶中，30℃避光振荡培养
过夜。
(4)结构类似物突变株的获得将培养后的处理
液取1mL，按10倍稀释法稀释至10～，将不同稀释
度的处理液按0．1mL涂布含有一定量结构类似物
的基本培养基平板上，30℃倒置培2～4d，挑出生
长出的单菌落，即为结构类似物抗性突变菌，转接
到斜面保藏。发酵前接斜面活化菌种，进行初筛与
复筛。
1．2．4发酵方法
(1)初筛从斜面培养基上取一环孢子接入到
40mL的发酵培养基中(250mL三角瓶)，30℃摇床
培养72h，测定发酵液中8一PL产量。
(2)复筛初筛得到的高产菌株经斜面活化，
每株菌取一满环接人到40mL种子培养液中(250
mL三角瓶)，摇床培养24h，然后各取3mL种子液
加入3个发酵瓶中，30℃摇床培养72h。测定三角
瓶中发酵液8一PL产量，取其平均值，确定不同菌株
的产量稳定性，从中选出高产稳产的优良菌株。
1．2．5分析方法
(1)生物量测定干重法测定。
(2)pH测定PHSJ-4A型数字pH计。
(3)发酵液中￡．PL含量的测定发酵上清液2
mL与2mL1 mmo]甲基橙水溶液混合加入试管，
30℃下振荡30rain后4000r／min离心15min，取
离心上清液稀释一定倍数后于465nm处测
OD值‘9I。
1．2．6遗传稳定性研究
将筛选得到的菌株转接保藏斜面，30℃培养2
d后作为F，代，从F，代斜面转接至保藏斜面，30℃
培养2d后为F：代，同样方式接连传代到F，，即为
F1、F2、F3、F4、F5代。取上述F1、F2、F3、F4、F5代斜
万方数据
· 66· 生物加工过程 第5卷第3期
蘧，接秣到发黪壤养基中墙莽72h后测发酵滚中8一
PL含量，考察其传代稳定性。
2实验结果
2．1出发菌株的筛选
畿发菌株的选择是决定诱变效暴的重要环节，
长期育种的经验证明，诱变处理前选择怎样的出发
菌株，以及对出发菌株的生理学特性的全面了解是
很重要的。由于使用的原始菌株经多次传代盾可
能退化，需在诱变育种前进行分离纯化。经过单菌
落分离，得到产量为0。28g／L的菌株，编号为z—18，
作为出发菌株。
随之提高，僵照射增魏羽一定程度对，其杀菌率随
之增大，而突变率却降低。致死率大约在70％～
85％的照射时间段里菌体的突变率最高。诱变史短
的野生菌株选育特点楚：诱变处理剂量大，杀菌率
高(90％～99％)，在单位存活细胞中负变菌株多，
正变菌株少，但在不多的正变株中可能筛选到产量
提高幅度大的突变株口3；AEC抗性平板的介入，又
会大大减少选育时的工作量，所以选取60s为紫外
照射诱变时阀。
蠢
寨
120
100
80
60
40
20
表1保存菌种产8’PLl截g o
Table1 The8一PLproductivityofd fferentstrains
2．2 AEC和甘氨酸浓度的确定
据文献摄遵，8一聚赣氨酸的合成可麓途径攒氨
酸代谢支路，最后经聚合酶作用生成。在赖氨酸代
谢通路中，存在终产物赖氨酸的反馈抑制，因此选
用赖氨酸鹩结构类似糍S-2氨基乙蘩一毛一半麓氨酸
(AEC)作为抗性筛选标记可以消除赖氨酸的反馈
抑制。丽甘氨酸可以代替D一丙氨酸渗入细胞壁，破
坏默聚糖短获阕的交联，影蛹细胞璧的通透性。由
此选择AEC和甘氨酸作为抗性筛选标记。如表2
所示，当AEC和甘氨酸质量浓度分别达到9mg／mL
积5mg／mL时，没有菌落出现，所以将AEC和甘氨
酸的临界质量浓度分别设为8mg／mL和4mg／mL
作为诱变筛选的撬性浓度。
表2不同质量浓度的AEC／Gly对白色镳霉菌的抗性
Table2ThecriticalofAECandglycineresistance
ofStreptomycesalbulus
p(，AEC／Gmly)／1 2 34 5 6 7 8 91011
(mg·mL。1)
’ ’
AEC平叛菠落生长情掇++++++++一一一
Gly平投菌落生长情况++++一一一一一一一
2。3紫外线诱变筛选抗AEC突变菌株
2．3．1紫外诱变致死率曲线
随着紫外线照射时间的增长，杀菌率和突变率
50 100 150
诱燮对惩是
图1紫外诱变致死率曲线
Fig。1TheterminalrateofStreptomyc然albulusUVmutation
2．3．2uV突变株初筛和复筛
枣l用挠性筛选平板筛选菰性突变株是一种篱
便的获得高产突变株的有效方法。将uV诱变后的
菌悬液途布于AEC和Gly抗性平板上，挑选长势良
好鹃萤落进行初筛、复筛，得到一株高产突变株，产
量达到0．40g／L，将其命名为C一18。
表3 UV诱变缝巢
Table3 ThescreeningresultofUVmutation
2．4遗传稳定性研究
将突变株c．18在斜面培养基上连续进行0—
4℃保存、传代，再测定其产8一PL能力，结果见表4。
出表4可知，C—18传代5次，其产8，PL能力并没有
下降，保持稳定，说明C—18其变异性可遗传，产￡．
PL稳定。
2．5营养因素对发酵的影晌
由表5可知，R1>R2>R3，即葡萄糖浓度的差
万方数据
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