全 文 ：第 １２卷第 ６期
２０１４年 １１月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ６
Ｎｏｖ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０６􀆰 ０１０
收稿日期：２０１３－０８－１８
基金项目：国家科技支撑计划（２０１３ＢＡＤ１８Ｂ０１）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１１ＡＡ１００９０１）
作者简介：吕昌勇（１９８７—），男，河南固始人，硕士，助理工程师，研究方向：微生物工程与酶工程，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ａｂｃｄ１０００ｅｆｇｈ２０００＠ １６３􀆰 ｃｏｍ
一种改进的普洱茶固态发酵过程微生物 ＤＮＡ提取方法
吕昌勇１，２，陈朝银２，徐致远１
（１􀆰 光明乳业股份有限公司 乳业生物技术国家重点实验室，上海 ２００４３６；
２􀆰 昆明理工大学 生命科学与技术学院，昆明 ６５０５００）
摘　 要：为开发一种改进的普洱茶固态发酵过程微生物 ＤＮＡ 提取方法，首先配制含有吐温 ２０、聚乙烯吡咯烷酮
（ＰＶＰ）、乙二胺四乙酸二钠（Ｎａ２ＥＤＴＡ）等组分的洗涤缓冲液，引入超声波振荡、涡旋、６５ ℃水浴、反复洗涤等手段，
把普洱茶发酵微生物较高质量的收集起来，再使用十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）法提取微生物总 ＤＮＡ。 按照本
文所述方法所得到的菌体沉淀接近白色，后续提取出的 ＤＮＡ 总量高、色度低、杂质少，适用于 ＰＣＲ 及基因组学等
研究。
关键词：普洱茶；固态发酵；提取 ＤＮＡ；发酵食品
中图分类号：Ｑ９３　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０６－００５２－０５
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｏｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ ｉｎ Ｐｕｅｒ ｔｅａ ｓｏｌｉｄ⁃ｓｔａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔｉｏｎ
ＬＹＵ Ｃｈａｎｇｙｏｎｇ１，２，ＣＨＥＮ Ｃｈａｏｙｉｎ２，ＸＵ Ｚｈｉｙｕａｎ１
（１􀆰 Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒｉｇｈｔ Ｄａｉｒｙ ＆ Ｆｏｏｄ Ｃｏ􀆰 Ｌｔｄ􀆰 ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００４３６，Ｃｈｉｎａ；
２􀆰 Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０５００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ， ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＤＮＡ ｉｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ
ｗｈｉｌｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｐｅｒｌｙ ｐｌａｙｓ ｋｅｙ ｒｏｌｅｓ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ􀆰 Ｗｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ
ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｏｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ ｉｎ Ｐｕｅｒ ｔｅａ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ􀆰 Ｆｉｒｓｔ，ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｔｅａ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｂｙ
ｗａｓｈｉｎｇ ｓａｍｐｌｅｓ ｓｅｖｅｒａｌ ｔｉｍｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｂｕｆｆｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ⁃２０，ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ（ＰＶＰ），ａｎｄ
ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｓｏｄｉｕｍ （Ｎａ２ ＥＤＴＡ）， ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ
ｖｏｒｔｅｘ ａｔ ６５ ℃ ｕｎｔｉｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｎｅａｒｌｙ ｗｈｉｔｅ ｃｏｌｏｒ．Ｔｈｅｎ，ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ
ｕｓｉｎｇ ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｕｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＣＴＡＢ） ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｌ，ｌｉｇｈｔ ｃｏｌｏｒ ａｎｄ ｐｕｒｅ
ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ􀆰
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｕｅｒ ｔｅａ；ｓｏｌｉｄ⁃ｓｔａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｆｏｏｄ
　 　 渥堆发酵是现代普洱茶发酵的主要手段［１］，即
利用湿热原理、微生物及其代谢作用加速普洱茶发
酵过程［２－３］。 通常环境中可培养的微生物不足
１％［４－６］，利用常规方法对环境中微生物真实群落结
构了解的非常有限［７－８］，因此，采用现代分子生物学
技术对传统发酵工艺中的微生物进行研究是提高
普洱茶质量的有效途径。 但是，普洱茶茶叶自身生
长过程中就代谢有非常复杂的次生代谢产物，加之
在渥堆发酵过程中茶叶成分的分解转化更为复
杂［９－１０］，这些都影响着普洱茶渥堆发酵过程微生物
总 ＤＮＡ的高质量提取，进而影响着分子生物学在普
洱茶研究中的应用。
普洱茶发酵微生物的收集好坏，直接影响着后
面微生物 ＤＮＡ提取质量的好坏，如果收集到的菌体
本身表面附着太多色素及多酚类等次级代谢产物，
或者菌体里面混杂着植物叶片茶渣，在提取 ＤＮＡ裂
解细胞的时候，这些次级代谢产物很容易与释放出
来的 ＤＮＡ结合交缠在一块，一旦这些物质交缠在一
块，就很难再分开，进而严重影响 ＤＮＡ的提取质量。
为此笔者在总结了最近有关普洱茶微生物
ＤＮＡ提取的论文所用的微生物收集方法的基础上，
结合在实验过程中发明总结的方法并对这些方法
收集后的菌体进行提取 ＤＮＡ效果比较，以期得到一
种能较为科学高效的普洱茶发酵微生物收集方法
及建立其 ＤＮＡ提取体系。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
实验所用的普洱茶样品采自云南省勐海县鹏
程茶厂正在渥堆发酵的普洱茶，样品在干冰环境下
运输，回到实验室后置于－７０ ℃冰箱内保存。
主要试剂： ＮａＣｌ，北京市化学试剂三厂；十六烷
基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、
聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ），Ｓｏｌａｒｂｉｏ 公司；三羟甲基氨
基甲烷（Ｔｒｉｓ），Ｎｏｖｏｎ公司；冰乙酸，天津化学试剂三
厂；巯基乙醇，Ａｍｒｅｓｃｏ 公司； Ｔａｑ 酶、ＰＣＲ 试剂盒，
ＴａＫａＲａ 公司；Ｔｗｅｅｎ ２０，Ｓｉｇｍａ公司。
主要仪器：核酸电泳槽，Ｗｅａｌｔｅｃ 公司； Ｘ ２２
低温离心机，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ公司； ＨＨＳ Ｓ恒温水
浴锅，上海比朗仪器有限公司； ２１００ Ｐｒｏ 紫外分光
光度计，ＧＥ公司； ＳＷ ＣＪ ２Ｄ型无菌操作台，苏州
净化设备有限公司；ＶＧＴ １６１３Ｔ 超声波清洗机，深
圳威固特清洗设备有限公司。
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 普洱茶表面微生物的收集
１） 无菌水浸泡分离（方法 １）
参考 Ｃｈｅｎ 等［１１］提取分离普洱茶微生物的方
法，具体操作如下：① 取 ３ ｇ 茶叶样品加入装有 ３０
ｍＬ无菌水中；② ３ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ １ ｍｉｎ 去除茶叶残渣，
收集悬浮液；③ １５ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ １０ ｍｉｎ收集菌体沉淀。
２） 磷酸盐缓冲液浸泡分离（方法 ２）
参考张阳等［１２］分离普洱茶微生物的方法，具体
操作如下：① 取 ３ ｇ茶叶样品加入装有 ３０ ｍＬ无菌的
磷酸盐缓冲液（ｐＨ ７􀆰 ４）中；② 用超声波振荡（４０
ｋＨｚ，５００ Ｗ） ７ ｍｉｎ；③ 在摇床摇动 ３０ ｍｉｎ （ ２００
ｒ ／ ｍｉｎ）；④ 后低速（５００ ｒ ／ ｍｉｎ）离心 ７ ｍｉｎ 去除掉叶
片残留样品，９ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ８ ｍｉｎ，收集菌体沉淀。
３）Ｔｗｅｅｎ ＮａＣｌ 缓冲液分离（方法 ３）
参考孙婷婷等［１３］分离普洱茶微生物的方法，具
体操作如下：① 取 ３ ｇ茶叶样品加入装有 ３０ ｍＬ 无
菌的 Ｔｗｅｅｎ ＮａＣｌ 缓冲液（１０ ｇ ／ Ｌ Ｔｗｅｅｎ ２０，１􀆰 ５
ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ，ｐＨ ７􀆰 ５～８􀆰 ０）；② 静置 ３０ ｍｉｎ；③ 超声
波振荡 （４０ ｋＨｚ，５００ Ｗ） １０ ｍｉｎ；④ 离心 （ １２ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ，１０ ｍｉｎ）的菌体收集。
４） 笔者改进的方法（方法 ４）
① 称取 ２～ ３ ｇ 普洱茶样品，剪碎，放到 ５０ ｍＬ
离心管中；② 按照 １０ ｍＬ ／ ｇ茶叶的比例加入配置的
洗涤缓冲液 （含有 １􀆰 ５ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ、 １００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｎａ２ ＥＤＴＡ、０􀆰 ６ ｇ ／ Ｌ Ｔｗｅｅｎ
２０、质量分数 ２％ ＰＶＰ、ｐＨ 为 ８􀆰 ０ 的溶液），茶叶浸
泡其中，静置 １５ ｍｉｎ；③ 在超声波清洗仪（４０ ｋＨｚ，
５００ Ｗ）环境中振荡 １０ ｍｉｎ，涡旋 ４５ ｓ，上清液转入
新的离心管中；④ ６５ ℃水浴 ６ ｍｉｎ，低速离心去除残
渣，高速离心收集沉淀；⑤ 加入适当的洗涤缓冲液
（组分同上），涡旋振荡混匀，６５ ℃水浴 ６ ｍｉｎ，高速
离心收集（１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ，１０ ｍｉｎ）菌体，完成一次洗
涤过程；步骤⑤洗涤重复多次，直到离心收集菌体
的上清液接近透明为止。 笔者改进的方向主要为
洗涤缓冲液的配方调整及组合优化洗涤方法。
１􀆰 ２􀆰 ２　 ＤＮＡ的粗提
１）向步骤 １􀆰 ２􀆰 １中所得到的沉淀用液氮充分研
磨，以 １􀆰 ０ ｍＬ ／ ｇ茶叶的用量加入 ＤＮＡ提取液（成分
为 １０～２０ ｇ ／ Ｌ ＣＴＡＢ、２０～５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｎａ２ＥＤＴＡ、８０～
１００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１ ～ １􀆰 ５ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ、１０ ～ ２０
ｍＬ ／ Ｌ 巯基乙醇）；
２）加入 ０􀆰 １ ｍｇ ／ ｍＬ 蛋白酶 Ｋ，５５ ℃环境水浴
３０ ｍｉｎ，接着 ６５ ℃水浴 １ ｈ；
３）加入等体积氯仿 异戊醇混合液（两者体积
比为 ２４ ∶ １），混匀后 １０ ０００ ｇ离心 １０ ｍｉｎ，上层的水
相回收于新的离心管中，重复此步骤 １次；
４）加入等体积预冷的异丙醇， １ ／ １０ 体积 ３
ｍｏｌ ／ Ｌ醋酸钠，混匀，置于－２０ ℃静置 ４５ ｍｉｎ；
５）１５ ０００ ｇ离心 ２０ ｍｉｎ，所得沉淀用 ７５％（体积
分数）乙醇洗涤，自然风干，加入 １００ μＬ 双蒸水，此
为粗提的总 ＤＮＡ。
１􀆰 ２􀆰 ３　 粗提 ＤＮＡ的纯化
１）粗提的 ＤＮＡ 中加入 ０􀆰 ５ ｍｇ ／ ｍＬ ＲＮＡｓｅ，３７
℃水浴 １ ｍｉｎ以上；
３５　 第 ６期 吕昌勇等：一种改进的普洱茶固态发酵过程微生物 ＤＮＡ提取方法
２）加双蒸水补足至 ５００ μＬ，加等体积的 Ｔｒｉｓ饱
和酚，混匀，１０ ０００ ｇ 离心 １０ ｍｉｎ，上层水相回收于
新离心管中；
３）加等体积的氯仿 异戊醇混合液，混匀，
１０ ０００ ｇ离心 １０ ｍｉｎ，上层水相回收于新离心管中；
４）加 ２ 倍体积的无水乙醇，１ ／ １０ 体积 ３ ｍｏｌ ／ Ｌ
醋酸钠，混匀， ２０ ℃静止 ３０ ｍｉｎ；
５）１５ ０００ ｇ离心 ２０ ｍｉｎ，所得沉淀自然风干后，
加 １００ μＬ双蒸水，此为纯化后的总 ＤＮＡ。
１􀆰 ２􀆰 ４　 ＤＮＡ提取效率及提取质量的检测
１）提取的 ＤＮＡ通过琼脂糖电泳后在凝胶成像
系统下观察，以此判断 ＤＮＡ提取效果及完整性；
２）选择 １６Ｓ ｒＤＮＡ通用引物 ２７Ｆ：（５′ ＡＧＡＧＴ⁃
ＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ ３′）和 １４９２Ｒ：（５′ ＧＧＴＴＡ⁃
ＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ ３′）进行细菌 ＰＣＲ扩增，间隔
约 １􀆰 ５ ｋｂ； ＰＣＲ反应体系 ２０ μＬ，成分为 ０􀆰 ５ μＬ 未
经纯化的 ＤＮＡ 模版，２５０ μｍｏｌ ／ Ｌ ｄＮＴＰ（每种），０􀆰 １
μｍｏｌ ／ Ｌ引物，１０×Ｂｕｆｆｅｒ（含 ＭｇＣｌ２）２ μＬ，ＴａｑＤＮＡ聚
合酶 １ Ｕ，其余为去离子水，扩增过程先 ９４ ℃ ５
ｍｉｎ，９４ ℃ ３０ ｓ，５３ ℃ ３５ ｓ，７２ ℃ １􀆰 ５ ｍｉｎ，设定 ３２
个循环，最后 ７２ ℃ ７ ｍｉｎ。
选择 １８Ｓ ｒＤＮＡ 通用引物 ＩＴＳ３：（５′ ＧＣＡＴＣＧ⁃
ＡＴＧＡＣＧＣＡＧＣ ３′）和 ＩＴＳ４：（５′ ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡ⁃
ＴＴＧＡＴＡＴＧＣ ３′）进行真菌 ＰＣＲ 扩增，间隔约 ３００
ｂｐ；ＰＣＲ反应体系同上，扩增过程先 ９４ ℃ ５ ｍｉｎ，９４
℃ ３０ ｓ，５５ ℃ ３５ ｓ，７２ ℃ ３０ ｓ，设定 ３２个循环，最后
７２ ℃ ７ ｍｉｎ。
３）利用紫外分光光度计对纯化后的 ＤＮＡ 吸光
度进行测量，计算 ＯＤ２６０ ／ ＯＤ２８０，并根据吸光度值估
算提取 ＤＮＡ的浓度及产率。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 洗涤后所得菌体的颜色及粗提 ＤＮＡ 所得沉
淀颜色
　 　 对已经报道的 ４种收集菌体的方法进行比较，分
析比较洗涤所得到的微生物沉淀的颜色及醇沉 ＤＮＡ
后沉淀颜色结果见表 １。 由表 １ 可知：无菌水、磷酸
盐、Ｔｗｅｅｎ ＮａＣｌ缓冲液所分离出来的菌体均有较深
的颜色，这些颜色很有可能是由于得到的沉淀菌体表
面附着大量次级代谢产物，从而导致粗提得到的
ＤＮＡ醇沉后有较深的颜色，ＤＮＡ 沉淀的颜色较深从
侧面说明含有的杂质较多。 从一个侧面说明笔者所
用的洗涤缓冲液及收集微生物方法在一定程度上优
于其他普洱茶发酵微生物的收集方法。
表 １　 ４种方法收集菌体颜色及粗提 ＤＮＡ颜色对比
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅ ｃｏｌｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｐｅｌｌｅｔ ａｎｄ ｒｕｄｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｏｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｆｏｕｒ ｍｅｔｈｏｄｓ
收集菌体方法 收集菌体颜色 粗提 ＤＮＡ颜色
无菌水 接近黑色 褐色
磷酸盐 深褐色 褐色
Ｔｗｅｅｎ ＮａＣｌ缓冲液 褐色 浅褐色
洗涤缓冲液 浅褐色 白色
２􀆰 ２　 粗提 ＤＮＡ电泳图
图 １ 为 ４ 种方法分离后菌体粗提微生物总
ＤＮＡ的电泳图。 由图 １可知：利用方法 １ 和 ２ 分离
微生物后提取的 ＤＮＡ条带非常不明显，表明提出的
ＤＮＡ含量极少，质量很差，可能原因是洗涤过程中，
菌体收集质量太差，含有大量杂质，影响了微生物
ＤＮＡ的提取；方法 ３所得到的 ＤＮＡ 隐约有条带，提
取量高于方法 １ 和 ２，表明所用的收集菌体的缓冲
液在一定程度上可以达到保护 ＤＮＡ的效果，但是提
取率相对较少；方法 ４ 所得的 ＤＮＡ 主条带清晰，片
段较大且亮度较高，初步确定为最好的 ＤＮＡ分离菌
体方法。
Ｍ—标准 ＤＮＡ；
１～４— ４种方法收集后提取微生物 ＤＮＡ
图 １　 ４种方法粗提 ＤＮＡ效果比较
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ
２􀆰 ３　 粗提 ＤＮＡ ＰＣＲ
图 ２和图 ３分别为普洱茶渥堆发酵过程中总微
生物 ＤＮＡ １６Ｓ ｒＲＮＡ基因、１８Ｓ ｒＲＮＡ基因 ＰＣＲ凝胶
电泳图。 由图 ２和图 ３可以看出：只有方法 ４在 １􀆰 ５
ｋｂ和 ３００ ｂｐ左右处有明显主条带，片段大小符合细
菌和真菌的特征条带大小，表明该方法提取出的微
生物总 ＤＮＡ 既包括细菌的又包括真菌的 ＤＮＡ，且
４５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
可以直接用于 ＰＣＲ扩增。
Ｍ—标准 ＤＮＡ；１～４—４种方法收集后微生物
图 ２　 普洱茶渥堆发酵过程中总微生物
ＤＮＡ １６Ｓ ｒＲＮＡ基因 ＰＣＲ
Ｆｉｇ􀆰 ２　 １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ＰＣＲ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｏｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ ｏｆ Ｐｕｅｒ ｔｅａ ｄｕｒｉｎｇ
ｐｉｌｅ⁃ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
Ｍ—标准 ＤＮＡ；１～４—４种方法收集后微生物
图 ３　 普洱茶渥堆发酵过程中总微生物
ＤＮＡ ＩＴＳ３ ＩＴＳ４基因 ＰＣＲ
Ｆｉｇ􀆰 ３　 ＩＴＳ３⁃ＩＴＳ４ ｇｅｎｅ ＰＣＲ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｏｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ ｏｆ Ｐｕｅｒ ｔｅａ ｄｕｒｉｎｇ
ｐｉｌｅ⁃ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
２􀆰 ４　 提取效率
对纯化后所提取的 ＤＮＡ，使用紫外分光光度计
进行纯度检测并进行提取率的计算。 提取 ＤＮＡ 所
用样品为 ３ ｇ，溶解 ＤＮＡ 为 １００ μＬ，稀释 １２ 倍。 所
得数据如表 ２所示。
表 ２　 ＤＮＡ紫外分光光度计检测结果
Ｔａｂｌｅ ２　 ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ
方法
ＯＤ２６０ ／
ＯＤ２８０
ＯＤ２６０ ／
ＯＤ２３０
ρ ／
（μｇ·μＬ－１）
ＤＮＡ提取率 ／
（μｇ·ｇ－１）
１ － － ０ ０
２ － － ０ ０
３ １􀆰 ４５ ０􀆰 ４５ ０􀆰 ０３１ １􀆰 ０３
４ １􀆰 ８４ １􀆰 ６６ ０􀆰 ２２８ ７􀆰 ６０
　 注：“－”表示比值无比较意义。
由表 ２可知：方法 １和方法 ２提取率非常小，几
乎可以忽略其提取率，方法 ３ 和方法 ４ 的提取率分
别为 １􀆰 ０３、７􀆰 ６０ μｇ ／ ｇ普洱茶。
结合用 ＯＤ２６０和 ＯＤ２８０的比值估计核酸的纯度，
ＯＤ２６０和 ＯＤ２３０比值估计去盐的程度，可以明显发现，
方法 ３所得到的 ＤＮＡ 纯度较差，难以满足后续分子
生物学的要求。 而方法 ４ 收集菌体后提取的 ＤＮＡ
ＯＤ２６０ ／ ＯＤ２８０ ＝１􀆰 ８４，ＯＤ２６０ ／ ＯＤ２３０ ＝１􀆰 ６６，能比较好地满
足后续分子生物学研究的要求，同时具有较高的提取
率，可以认为方法 ４优于方法 １、２和 ３，较好地收集菌
体后对高质量地提取 ＤＮＡ具有关键的作用。
值得强调的是，本文所用的提取 ＤＮＡ 方法是较
为普遍的 ＣＴＡＢ 法。 虽然如参考文献所述方法没有
对收集的微生物进行一定的处理，但是依旧取得了一
定的实验结果，笔者认为这是由于他们在提取 ＤＮＡ
过程中采用了一定的补救措施。 而本文中所述的提
取 ＤＮＡ的方法所需试剂等均为常规试剂，在菌体分
离后，没有用到 ＤＮＡ提取试剂盒、溶菌酶破壁酶等试
剂等，操作简单，目的就是直观地说明微生物收集及
其预处理对发酵微生物 ＤＮＡ提取的重要性。
对比之前报道，Ｃｈｅｎ 等［１１］对发酵普洱茶微生
物总 ＤＮＡ 进行提取，然后用真菌 ＤＧＧＥ 分析，最终
在整个发酵过程只得到 ３种真菌的信息；张阳等［１２］
和孙婷婷等［１３］的方法提取出来的 ＤＮＡ必须经过一
定的稀释（１００ ～ １ ０００ 倍）才可以用于扩增出细菌
１６Ｓ ｒＤＮＡ和真菌 β 微管蛋白基因，表明所提取出
来的 ＤＮＡ含有较多杂质，多酚等代谢产物残存量都
没有被完全去除，所以必须将粗提总 ＤＮＡ样品进行
稀释后才能作为模板；表明这些文献所述的方法均
有一定的局限性，其中的原因很有可能就与没有进
行恰当科学的微生物收集和洗涤有关，
本文在实验的基础上配制专门用于洗涤用的
缓冲液，其包含的 Ｔｗｅｅｎ ２０是一种乳化剂，有去污
功能；ＰＶＰ 能有效去除多糖多酚类物质；Ｎａ２ＥＤＴＡ
可以螯合普洱茶叶表重金属离子，这些物质的配合
使用，可以有效去除微生物表面的次级代谢产物；
同时在收集微生物时摒弃了用恒温振荡器等较为
温和的方法，因为在微生物分离耗时越长，微生物
在分离出茶叶表面的同时次生代谢产物也会分离
出来，进而与微生物表面二次黏附，本文首先对茶
叶短时间浸泡，使其吸水膨胀，增加表水接触面积，
然后快速激烈地分离微生物，尽量减少次生代谢物
的浸出；收集菌体后又采取较高温水浴、振荡等方
５５　 第 ６期 吕昌勇等：一种改进的普洱茶固态发酵过程微生物 ＤＮＡ提取方法
法反复洗涤以使菌体表面残存的色素、多酚类等次
生代谢产物等去除。 本文所提取的 ＤＮＡ 已经应用
于普洱茶发酵微生物高通量测序的研究，说明了本
文所述的收集微生物及后续的提取 ＤＮＡ 可以用于
后续分子生物学研究。
３　 结　 论
按照本文的方法，所得到的菌体沉淀和 ＤＮＡ沉
淀颜色均有较大的改观，所得到的菌体沉淀接近白
色，后续沉淀出的 ＤＮＡ 为白色，此方法可以比较有
效地去除次生代谢物质对提取 ＤＮＡ 的干扰。 因此
在后续的提取 ＤＮＡ过程中不需要昂贵的实验仪器、
试剂盒及复杂的提取手段，依然能得到较高质量的
ＤＮＡ。 所提取出的 ＤＮＡ 条带完整，ＲＮＡ 有效去除，
提取率为 ７􀆰 ６０ μｇ ／ ｇ 以上， ＯＤ２６０ ／ ＯＤ２８０ ＝ １􀆰 ８４，
ＯＤ２６０ ／ ＯＤ２３０ ＝ １􀆰 ６６，经过细菌及真菌 ＰＣＲ 均能扩增
出符合特征大小的条带。
目前，关于普洱茶的分子生物学研究开展较
少，而本研究方法的体系为普洱茶发酵分子生物学
的研究奠定了一定的基础，进而从分子水平揭露普
洱茶发酵微生物中关键菌群及其代谢过程，为普洱
茶产业的科技化提供了理论依据。
参考文献：
［ １ ］　 杨瑞娟，吕杰，严亮，等．普洱茶渥堆发酵中嗜热真菌的分离
和鉴定［Ｊ］ ．茶叶科学，２０１１，３１（４）：３７１⁃３７８．
［ ２ ］ 　 陈可可，朱宏涛，王东，等．普洱熟茶后发酵加工过程中曲霉
菌的分离和鉴定［Ｊ］ ．云南植物研究，２００６，２８（２）：１２３⁃１２６．
［ ３ ］ 　 Ｙａｎｇ Ｄ Ｊ，Ｈｗａｎｇ Ｌ Ｓ． Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｎａｔｕｒａｌ
ｓｔａｔｉｎｓ ｆｒｏｍ ｌａｃｔｏｎｅ ｆｏｒｍｓ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｈｙｄｒｏｘｙ ａｃｉｄ
ｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｕ⁃ｅｒｈ ｔｅａ［Ｊ］ ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ，
２００６，１１１９（１）：２７７⁃２８４．
［ ４ ］ 　 Ｖａｚ⁃Ｍｏｒｅｉｒａ Ｉ，Ｅｇａｓ Ｃ，Ｎｕｎｅｓ Ｏ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ｃｕｌｔｕｒｅ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ
ｃｕｌｔｕｒｅ⁃ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｓｕｒｖｅｙｓ ｔａｒｇｅｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ： ａ
ｃａｓｅ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ａ ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ ｓａｍｐｌｅ［Ｊ］ ．Ａｎｔｏｎｉｅ Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，
２０１１，１００（２）：２４５⁃２５７．
［ ５ ］ 　 Ｌｅｗｉｓ Ｋ，Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｓ，Ｄ′Ｏｎｏｆｒｉｏ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
ａｓ ａ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ （ Ｔｏｋｙｏ），
２０１０，６３（８）：４６８⁃４７６．
［ ６ ］ 　 吕昌勇，陈朝银，葛锋，等．微生物分子生态学研究方法的新
进展［Ｊ］ ．中国生物工程杂志，２０１２，３２（８）：１１１⁃１１８．
［ ７ ］ 　 Ｃｈｅｎ Ｃ，Ｙｅ Ｙ，Ｋｏｎｇ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ
ｆｕｎｇｉ ｆｒｏｍ ｐｉｌｅ⁃ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｕ⁃ｅｒ ｔｅａ［ Ｃ］ ／ ／ ＩＴ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ （ＩＴＭＥ）．２０１１ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ＩＥＥＥ，
２０１１（２）：６９６⁃６９９．
［ ８ ］ 　 Ｃｈｅｎ Ｃ， Ｚｈａｎｇ Ｗ， Ｌｕ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ
ｄｕｒｉｎｇ ｐｉｌｅ⁃ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｕ⁃ｅｒ ｔｅａ［ Ｃ］ ／ ／ ＩＴ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ
Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ （ＩＴＭＥ）．２０１１ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ＩＥＥＥ，２０１１
（２）：６９１⁃６９５．
［ ９ ］ 　 Ａｌｃａｚａｒ Ａ， Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ Ｏ， Ｊｕｒａｄｏ Ｊ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ
ｇｒｅｅｎ，ｗｈｉｔｅ， ｂｌａｃｋ，Ｏｏｌｏｎｇ， ａｎｄ Ｐｕ⁃ｅｒｈ ｔｅａｓ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅｉｒ
ｆｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｃｏｎｔｅｎｔ［ Ｊ］ ． Ｊ Ａｇｒ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２００７，５５（１５）：
５９６０⁃５９６５．
［１０］ 　 Ｈｏｒａｎｎｉ Ｒ， Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ Ｕ Ｈ． Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ
ｗｈｉｔｅ，ｇｒｅｅｎ，ｂｌａｃｋ，Ｏｏｌｏｎｇ，Ｐｕ⁃ｅｒｈ ｔｅａｓ ａｎｄ ｔｅａ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ［ Ｊ］ ． Ｊ
Ｆｏｏｄ Ｃｏｍｐ Ａｎａｌ，２０１３，３１（１）：９１⁃１００．
［１１］ 　 Ｃｈｅｎ Ｙ Ｓ， Ｌｉｕ Ｂ Ｌ， Ｃｈａｎｇ Ｙ Ｎ． Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｓｅｎｓｏｒｙ
ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｕ⁃ｅｒｈ ｔｅａｓ ｍａｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｒｅｅ ｔｅａ ｌｅａｖｅｓ ｉｎ ａｎ
ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｉｌｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ［Ｊ］ ．Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ，２０１０，１０９
（６）：５５７⁃５６３．
［１２］ 　 张阳，赵树欣，李巍，等．普洱茶发酵过程中微生物总 ＤＮＡ 提
取方法的比较［Ｊ］ ．食品工业科技，２０１２，３３（１２）：２３０⁃２３２．
［１３］ 　 孙婷婷，赵明，李亚莉，等．普洱茶发酵样品细菌和真菌 ＤＮＡ
同时提取方法研究 ［ Ｊ］ ．中国农学通报， ２０１１， ２７ （ １５ ）：
２４９⁃２５３．
（责任编辑　 荀志金）
６５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷