全 文 ：第 １２卷第 ３期
２０１４年 ５月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ３
Ｍａｙ ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０３􀆰 ００１
收稿日期：２０１３－１２－０３
基金项目：国家自然科学基金（２１３０６００９）
作者简介：成喜雨（１９８０—），男，湖南长沙人，博士，讲师，研究方向：生物化工，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｙｃｈｅｎｇ＠ ｂｊｔｕ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
原位吸附浸没式膜生物反应器催化制备茚二醇
成喜雨１，王　 静２，柯　 屾１
（１􀆰 北京交通大学 理学院 生命科学与生物工程研究院，北京 １０００４４；
２􀆰 北京节能环保促进会，北京 １００１９５）
摘　 要：在浸没式膜反应器（ＩＭＢ）中利用恶臭假单胞菌 ＡＴＣＣ ５５６８７催化茚制备顺式茚二醇。 采用 ２５根膜丝制作
的膜组件，在茚为 ３ ｇ ／ Ｌ时，经过 ２４ ｈ培养，ＩＭＢ中顺式茚二醇产量达到悬浮细胞反应器（ＳＣＢ）的 ４倍多；进一步，
在培养开始阶段加入 １０ ｇ ／ Ｌ ｓｐ ２０７树脂进行原位吸附，ＩＭＢ中顺式茚二醇产量最高达 ７０９ ｍｇ ／ Ｌ，为 ＳＣＢ产量的
６６０％，容积产率也从 ＳＣＢ中的 ６ ｍｇ ／ （Ｌ·ｈ）提高到 ３０ ｍｇ ／ （Ｌ·ｈ）。 在原位吸附 ＩＭＢ中，中空纤维膜既可作为固定化
细胞载体，同时又可作为第二相吸附不溶性底物，降低底物和产物抑制，兼有固定化反应器和两相反应器的优点。
关键词：原位吸附；生物反应器；浸没式；顺式茚二醇；膜
中图分类号：Ｑ８１５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０３－０００１－０６
Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｅｎｅ ｔｏ ｃｉｓ⁃ｉｎｄａｎｄｉｏｌ ｉｎ ａｎ
ｉｍｍｅｒｓｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｉｎ ｓｉｔｕ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ
ＣＨＥＮＧ Ｘｉｙｕ１，ＷＡＮＧ Ｊｉｎｇ２，ＫＥ Ｓｈｅｎ１
（１􀆰 Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４４，Ｃｈｉｎａ；
２􀆰 Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｙ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎ ｉｍｍｅｒｓｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（ＩＭＢ） ｗｉｔｈ ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｗａｓ ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｆｏｒ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ
ｉｎｄｅｎｅ ｔｏ ｃｉｓ⁃ｉｎｄａｎｄｉｏｌ ｂｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＡＴＣＣ ５５６８７􀆰 Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ
（ＳＣＢ），ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｆｏｕｒ⁃ｆｏｌｄ ｏｆ ｃｉｓ⁃ｉｎｄａｎｄｉｏｌ ａｔ ３ ｇ ／ Ｌ ｉｎｄｅｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｆｏｒ
２４ ｈ ｉｎ ｔｈｅ ＩＭＢ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｄｕｌｅ ｏｆ ２５ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ􀆰 Ｔｈｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＩＭＢ ｗａｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｙ ｉｎ
ｓｉｔｕ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｐｒｏｄｕｃｔ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ７０９ ｍｇ ／ Ｌ ｗａｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ＩＭＢ ｗｉｔｈ ａｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ １０
ｇ ／ Ｌ ｓｐ⁃２０７ ｒｅｓｉｎ ａｔ ０ ｈ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ６６０％ ｏｆ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ＳＣＢ􀆰 Ｔｈｅ ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ
ｏｆ ３０ ｍｇ ／ （Ｌ·ｈ） ｗａｓ ａｌｓｏ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ６ ｍｇ ／ （Ｌ·ｈ） ｉｎ ｔｈｅ ＳＣＢ􀆰 Ｔｈｅ ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｉｎ
ｔｈｅ ＩＭＢ ｓｅｒｖｅｄ ａｓ ａ ｃａｒｒｉｅｒ ｔｏ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａ ｓｅｃｏｎｄ ｐｈａｓｅ ｔｏ ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅａｃｔａｎｔ，ｔｈｕｓ
ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ ａ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ
ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ⁃ｃｅｌｌ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｗｏ⁃ｐｈａｓｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｉｎ ｓｉｔｕ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ；ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ；ｉｍｍｅｒｓｅｄ；ｃｉｓ⁃ｉｎｄａｎｄｉｏｌ；ｍｅｍｂｒａｎｅ
　 　 全细胞生物催化是可持续药物生产过程中的
重要一环，该过程存在的一个主要问题是微生物所
面临的底物和产物抑制［１－３］。 恶臭假单胞菌催化茚
合成顺式茚二醇就是一个典型例子，在此过程中，
可以使用硅油建立液 液两相系统，降低茚对微生物
的抑制［４－５］。 但该过程存在的乳化问题，使下游产
物分离变得困难；也可以使用高分子聚合物建立
固 液两相系统，降低抑制的同时可以消除液 液两
相系统存在的乳化问题［６－７］，然而，聚合物颗粒的大
量使用使过程复杂化，可能提高过程能耗和操作费
用。 膜反应器被报道可克服底物抑制，如利用中空
纤维膜固定化微生物，可以明显提高微生物对废水
中不同底物的耐受性［８－１０］。
膜反应器用于废水处理已得到了广泛认可，由此
笔者提出采用浸没式膜反应器（ＩＭＢ） 降低生物催化过
程中的抑制问题。 但在生物催化过程中底物的溶解
度、毒性均不同于废水组分，因此所提出的 ＩＭＢ无论过
程操作还是机制都与传统的膜生物反应器不同。 在
ＩＭＢ中，膜既作为载体固定化细胞，又可作为第二相来
吸附不溶性底物，从两方面降低过程抑制。 笔者对比
研究了 ＩＭＢ和悬浮细胞反应器的性能，考察过程加强
机制，并进一步将原位吸附与 ＩＭＢ耦合，以期提高过程
效率，为其在生物催化方面的应用打下基础。
１　 材料和方法
１􀆰 １　 试剂和菌株
茚购于 Ｓｉｇｍａ 公司，其中分析用的茚纯度为
９８％，生物催化实验用的茚纯度为 ９０％；顺式茚二醇
购于美国 Ｗａｋｏ 公司； ＴＳＡ （ ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ａｇａｒ）、 ＴＳＢ
（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）培养基购于美国 ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ
公司；常规用化学试剂都购于 Ｓｉｇｍａ 公司或北京化
学试剂公司。
恶臭假单胞菌 ＡＴＣＣ５５６８７ 购于美国 ＡＴＣＣ 菌
种中心。 菌株用 ＴＳＡ 斜面培养基传代保存。 种子
准备过程如下：从斜面挑取 １ 环菌，接种于装有 １５０
ｍＬ ＴＳＢ培养基的三角瓶中，三角瓶在 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ、
３０ ℃摇床上恒温培养过夜获得种子。
１􀆰 ２　 膜组件制备
实验用中空纤维膜为聚偏氟乙烯（ＰＶＤＦ）膜，
购于厦门鲲扬膜科技有限公司。 膜丝外径 ２􀆰 ２
ｍｍ，内有一聚酯支撑层，膜丝截面图见图 １。 其聚
酯支撑层由纤维细丝编网而成，纤维细丝间距 ５
μｍ左右（图 １（ ｂ）和图 １（ ｃ））。 膜组件制备过程
如下：取一定数量 １６ ｃｍ 长膜丝，将此组膜丝两端
长大约 ２ ｃｍ 以内的膜丝之间均匀涂抹环氧树脂
胶，使 ２ 个端口的膜丝之间没有间隙，之后将这组
膜丝的两端置入长约 １􀆰 ５ ｃｍ长的玻璃或者聚丙烯
小管内，将环氧树脂胶注入膜丝与小管之间间隙，
在恒温烘箱干燥 ６ ｈ 左右，直至胶完全干燥，用锋
利刀片切割两端获得平整断面，即获得膜组件。
取合适直径硅胶管连接小管和循环用管路，经过
灭菌后即可用于生物转化实验。
图 １　 ＰＶＤＦ中空纤维膜扫描电镜照片
Ｆｉｇ􀆰 １　 ＳＥＭ ｉｍａｇｅｓ ｏｆ ＰＶＤＦ ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ
２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
１􀆰 ３　 悬浮培养生物催化过程
实验采用悬浮细胞反应器（ＳＣＢ） 作为 ＩＭＢ 生物
催化过程的对照。 实验在装有 １５０ ｍＬ 培养基的 ５００
ｍＬ三角瓶中进行，压缩空气通过灭菌后的过滤器（美
国Ｍｉｌｉｐｏｒｅ公司） 进行无菌过滤，然后以 ７５ ｍＬ ／ ｍｉｎ的
速率通入三角瓶反应器中。 反应器的接种量为 ２􀆰 ５％
（体积分数），种子液吸光值约５。 生物催化反应所用培
养基为 ＭＭＧ培养基［４］，Ｃ 源为 ２０ ｇ ／ Ｌ 葡萄糖。 茚作
为反应底物，在接种同时按照预定的浓度直接加入培
养基中，然后将三角瓶置于 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ、３０ ℃水浴摇床
进行反应，在设定的时间点取样 １ ｍＬ进行分析。
１􀆰 ４　 ＩＭＢ生物催化过程
ＩＭＢ实验装置如图 ２所示。 ＩＭＢ与 ＳＣＢ相似，不
同的是三角瓶反应器加入了一个膜组件。 膜组件与
聚四氟乙烯（ＰＴＦＥ）循环管路连接，将膜组件浸入三
角瓶培养基中，然后用蠕动泵以 ５ ｍＬ ／ ｍｉｎ 速率将培
养基从三角瓶循环进入膜组件一端，从另一端返回三
角瓶中，其余所有操作条件同 ＳＣＢ 反应器。 培养基
和器皿采用高温灭菌，而膜组件和循环管路采用 ７０％
乙醇溶液循环浸泡 ５ ｈ以上进行灭菌，之后用无菌蒸
馏水循环冲洗 ６次以上，以去除酒精残留。
１—流量计；２—空气过滤器；３—水封瓶；
４—摇瓶反应器；５—膜组件；６—蠕动泵；７—ＰＴＦＥ管
图 ２　 ＩＭＢ流程
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｆｌｏｗ ｃｈａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｅｒｓｅｄ
ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（ＩＭＢ）
膜反应器中细胞固定化方法如下：将膜组件浸
入种子培养瓶中，连接循环管路，用蠕动泵将三角
瓶中种子液从膜组件一端泵入，种子液从膜组件另
一端返回三角瓶中，如此循环 １２ ｈ，使细胞吸附固定
到膜丝表面和内部聚酯纤维支撑层的细丝之间。
之后，将膜组件取出，用无菌蒸馏水轻轻淋洗表面，
再置入含 １５０ ｍＬ ＭＭＧ 培养基的三角瓶反应器中，
同时将茚按照预定的浓度直接加入培养基中，然后
将三角瓶置于 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ、３０ ℃水浴摇床进行反应，
在设定的时间点取样 １ ｍＬ进行分析，每个实验设置
３个平行样。
原位吸收反应器设置与图 ２ 基本相同，不同的
是在反应开始时在反应器中添加 １个包含有灭菌树
脂的小包。 树脂 ｓｐ ２０７ 购买自 Ｓｉｇｍａ 公司，树脂用
５８ μｍ的尼龙布做成的小包包裹，采用 ７０％的酒精
溶液进行灭菌，之后用无菌蒸馏水清洗后用于生物
转化实验中。
１􀆰 ５　 分析
细胞浓度采用分光光度计测定，测定波长为
６００ ｎｍ。 产物和副产物茚酮测定采用 ＨＰＬＣ 进行，
色谱条件如下：安捷伦 Ｚｏｒｂａｘ ＲＸ Ｃ８色谱柱，紫外
检测器，检测波长为 ２２０ ｎｍ，其余设置参照文献
［４］。 副产物茚酚市场上没有标准品，因此未进行
定量检测。 实验过程中收集一定量的样品，１０ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ，取上清，用 ２ 丙醇稀释，再使用
０􀆰 ４５ μｍ ＰＶＤＦ膜过滤后用于 ＨＰＬＣ分析。
茚不溶于水，同时反应过程可能吸附到膜组件
和反应器内壁，很难准确定量测定过程中茚浓度，
因此过程主要监测顺式茚二醇的浓度，最终通过产
物顺式茚二醇浓度和初始茚添加量计算产率。
２　 结果和讨论
２􀆰 １　 ＳＣＢ中顺式茚二醇合成
首先对 ＳＣＢ 中细胞生长和顺式茚二醇合成的
抑制情况进行了研究，作为 ＩＭＢ 反应器运行结果的
对照，结果见图 ３。 由图 ３可知：在不添加底物茚的
ＭＭＧ培养基中，恶臭假单胞菌 ＡＴＣＣ５５６８７ 生长几
乎没有延滞期，２ ｈ 后开始对数生长，比生长速率达
０􀆰 ６ ｈ－１，８ ｈ后生物生物量达到较高水平，之后进入
缓慢生长期，２４ ｈ 后 ＯＤ６００达 ５􀆰 ３。 当反应器中加入
３ ｇ ／ Ｌ茚作为底物，细胞生长受到明显抑制，比生长
速率降低到 ０􀆰 ４ ｈ－１；当底物茚质量浓度增加到
６ ｇ ／ Ｌ，细胞生长受到严重抑制，比生长速率降低到
０􀆰 ３ ｈ－１，２４ ｈ 后 ＯＤ６００仅 １􀆰 ６。
由图 ３还可知：在茚质量浓度为 ３ ｇ ／ Ｌ时，４ ｈ后
观察到顺式茚二醇的快速合成，１２ ｈ 后进入平台期，
１８ ｈ 后顺式茚二醇质量浓度达到 １０７ ｍｇ ／ Ｌ，平均容
积产率为 ６ ｍｇ ／ （Ｌ·ｈ），过程摩尔产率很低，只有 ０􀆰 ０３
ｍｏｌ ／ ｍｏｌ（以 １ ｍｏｌ茚计）。 在 ６ ｇ ／ Ｌ茚条件下，顺式茚
二醇合成受到更严重抑制，顺式茚二醇质量浓度和摩
尔产率分别低至 ８４ ｍｇ ／ Ｌ和 ０􀆰 ０１ ｍｏｌ ／ ｍｏｌ。
３　 第 ３期 成喜雨等：原位吸附浸没式膜生物反应器催化制备茚二醇
图 ３　 在 ＳＣＢ中茚浓度对细菌生长和
顺式茚二醇合成的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｄｅｎｅ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｃｉｓ⁃
ｉｎｄａｎｄｉｏｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ＳＣＢ
在恶臭假单胞菌催化茚合成顺式茚二醇的模
式系统中，副产物比较多，这是其摩尔产率较低的
原因之一，同时，茚不溶于水，通气过程中气提作用
会造成底物损失，从而降低其产率［６］。 底物和产物
抑制是造成终产物浓度和摩尔产率降低的主要原
因之一［４］，上述研究结果也表明，ＳＣＢ 中细胞生长
和产物合成受到了明显抑制。
２􀆰 ２　 ＩＭＢ中顺式茚二醇合成
进一步研究 ＩＭＢ反应器降低上述全细胞催化过
程普遍存在的底物和产物抑制的效果。 ＩＭＢ 中既有
固定化细胞（图 １（ｄ）），又有悬浮细胞，因为膜组件上
吸附固定的微生物难以定量，因此对 ＩＭＢ 中悬浮培
养物浓度进行了监测，评估 ＩＭＢ 对微生物生长的影
响，结果见图 ４。 由图 ４可知：与 ＳＣＢ相比，在使用 １２
根膜丝的 ＩＭＢ Ｓ中，即使在 ６ ｇ ／ Ｌ的高底物浓度下，
经过 ４ ｈ 的延滞期，细胞开始快速增长，比生长速率
在 ０􀆰 ４ ｈ－１；２４ ｈ后细胞浓度为 ４􀆰 ５，明显高于 ＳＣＢ 中
相应底物浓度下的水平（１􀆰 ６）。 膜组件中膜丝数量的
调整也有利于降低底物对细胞生长的抑制，在使用
２５根膜丝的 ＩＭＢ Ｌ中，悬浮细胞生长更快，在 ３ ｇ ／ Ｌ
的高底物浓度下，８ ｈ 左右 ＯＤ６００水平达到 ４􀆰 ７，而在
ＩＭＢ Ｓ中，达到相似水平需要到 １８ ｈ。
在 ＳＣＢ中，在底物质量浓度分别为 ３和 ６ ｇ ／ Ｌ时，
顺式茚二醇质量浓度分别为 １０７和 ８４ ｍｇ ／ Ｌ。 与之相
比，ＩＭＢ Ｓ中产物合成量得到了明显的提高，分别达
３５８和 ４０４ ｍｇ ／ Ｌ，摩尔产率则分别提高到 ０􀆰 ０８和 ０􀆰 ０５
ｍｏｌ ／ ｍｏｌ。 反应周期也从 ＳＣＢ中的１８ ｈ延长到３０ ｈ，但
容积产率达 １２ ｍｇ ／ （Ｌ·ｈ），是 ＳＣＢ中水平的 ２倍。
膜组件分别包含 １２和 ２５根 １６ ｃｍ长膜丝
图 ４　 在 ＩＭＢ中茚浓度下对细菌生长和
顺式茚二醇合成的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｄｅｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ ｃｉｓ⁃ｉｎｄａｎｄｉｏｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ＩＭＢ
由图 ４还可知：通过增加膜组件中膜丝数量，顺
式茚二醇合成速率和终浓度都得到了进一步提高。
在底物为 ３ ｇ ／ Ｌ时，培养 １８ ｈ 后顺式茚二醇质量浓
度就达到 ４２５ ｍｇ ／ Ｌ， ２４ ｈ后达到 ４６１ ｍｇ ／ Ｌ，容积产
率达 １９ ｍｇ ／ （Ｌ·ｈ），较 ＩＭＢ Ｓ提高 ６０％，是 ＳＣＢ中
水平的 ３倍。
ＩＭＢ对顺式茚二醇过程的加强可能通过 ２ 种不
同的机制。 一方面，在 ＩＭＢ 中固定化细胞可以提高
反应器中细胞浓度，通过细胞固定化，微生物可以
耐受更高浓度的底物［９］。 增加膜丝数量将增加固
定化微生物浓度，从而加强生物转化效率，在
ＩＭＢ Ｌ中比在 ＩＭＢ Ｓ中更高的产物浓度和容积产
率证实了这一点。 另一方面，用于 ＩＭＢ 的 ＰＶＤＦ 膜
具有较强的疏水性，与疏水的不溶性底物茚具有较
好的亲和性，因而可以吸附茚，降低其对反应器中
悬浮细胞抑制的同时，使 ＩＭＢ 中悬浮细胞液可以获
得很好生长，还可以减少通气过程造成的底物茚
损失。
Ｄａｆｏｅ等［６］报道了 １ 个两相反应器，采用聚合
物颗粒取代硅油作为第二相，过程效率得到大幅加
４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
强，指出聚合物颗粒对底物、副产物和产物的吸附
是过程加强的重要原因。 笔者的研究结果表明，膜
组件对可溶性产物和副产物亲和性较低。 在底物
为 ３ ｇ ／ Ｌ时，在 ＩＭＢ Ｓ 中，发酵终点顺式茚二醇和
茚酮在膜相中分配比例分别为 ３％和 ２７％（数据未
显示），其余部分存留在水相中；在 ＩＭＢ Ｌ中，由于
膜丝数量增加，顺式茚二醇和茚酮在膜相中分配比
例增加到 ６％和 ４６％。 由此可见，在 ＩＭＢ中，膜组件
本身不能通过吸附移除产物来降低产物抑制，过程
加强应该是通过固定化来提高微生物耐受性与通
过膜组件对底物茚的吸附来降低底物茚的抑制的
共同作用完成的。 同时，膜组件对副产物茚酮具有
一定的吸附作用，这种吸附随着膜丝数量的增加而
得到增强，对过程加强将产生一定贡献。
２􀆰 ３　 原位吸附 ＩＭＢ中顺式茚二醇合成
从上面结果知道，膜组件本身并不能吸附顺式
茚二醇，因此，进一步考察通过树脂原位吸附提高
过程效率的可能性。 在 ３ ｇ ／ Ｌ 底物质量浓度下，在
ＩＭＢ Ｌ 中，于接种的同时分别加入 ０􀆰 ５％、１％、２％
和 ４％的灭菌处理过的 ｓｐ ２０７树脂，考察原位吸附
对细胞生长和产物合成的影响，结果见图 ５。 由图 ５
（ａ）可知：树脂的添加量在 ５～１０ ｇ ／ Ｌ时对生长过程
影响不大，而添加量增加到 ２０ ～ ４０ ｇ ／ Ｌ 时，生长明
显受到影响。
由图 ５（ｂ）可知：树脂的添加量在 ５～１０ ｇ ／ Ｌ时，
顺式茚二醇总浓度随着树脂的添加量增加而增加；
进一步增加树脂，产物产量有所降低。 在 １０ ｇ ／ Ｌ 树
脂添加量下，顺式茚二醇总质量浓度最高，达 ７０９
ｍｇ ／ Ｌ，比无树脂添加的 ＩＭＢ Ｌ中产量提高 ４５％，是
ＳＣＢ中产量的 ６􀆰 ６ 倍。 相应地，摩尔产率从 ＳＣＢ 的
０􀆰 ０３ 提高到 ０􀆰 １８ ｍｏｌ ／ ｍｏｌ；容积产率提高到 ３０
ｍｇ ／ （Ｌ·ｈ），是 ＳＣＢ中水平的 ５倍。
由图 ５（ｂ）可以发现：产物在水相、树脂相和膜
相的分布情况，根据该数据可以计算到产物顺式茚
二醇在各部分中的比例。 在 ＩＭＢ Ｌ 中，因为膜本
身对产物吸附性能非常弱，９４％的产物分布在水相
中，因此随着产物积累，其对微生物的抑制将不断
增强；在原位吸附 ＩＭＢ Ｌ 中，树脂添加量为 ５ ～ ４０
ｇ ／ Ｌ时，生成的产物中有 １３％～６７％的量转移到树脂
相中，通过树脂对产物的吸附，产物抑制一定程度
上得以降低，而且树脂用量越高，水相中产物浓度
占比越低，这可能是原位吸附 ＩＭＢ 中生物转化效率
得到进一步的原因之一。
图 ５　 树脂添加量进行原位吸附对 ＩＭＢ中细胞生长、
顺式茚二醇和茚酮合成的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎ ｓｉｔｕ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｒｅｓｉｎ ａｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ，
ｃｉｓ⁃ｉｎｄａｎｄｉｏｌ ａｎｄ ｉｎｄａｎｏｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｉｎ ｔｈｅ ＩＭＢ ａｔ ３ ｇ ／ Ｌ ａｎｄ ６ ｇ ／ Ｌ ｉｎｄｅｎｅ
由图 ５（ｃ）可知：膜丝对茚酮有一定亲和性，在
ＩＭＢ Ｌ中，４６％的茚酮分布在膜相中，水相中茚酮比
例是 ５４％；在原位吸附 ＩＭＢ Ｌ中，树脂添加量为 ５～
４０ ｇ ／ Ｌ时，膜相中茚酮降低到 ２１％ ～３３％，而树脂中
茚酮占比例为 ４４％～７７％，最终，水相中茚酮比例降低
到 ２％～２３％。 上述结果表明，树脂添加也能移除副
产物茚酮，移除能力随树脂添加量增加而增加。 通过
原位吸附，产物和副产物被部分或大部分移除，消除
抑制，从而使 ＩＭＢ Ｌ的效率得到了进一步提高。
值得注意的是，在 ４ 个树脂添加量的 ＩＭＢ 反应
过程中，当添加量为 ４０ ｇ ／ Ｌ 时，在液相中无论产物
浓度还是副产物茚酮浓度，都处于最低水平，但顺
式茚二醇总产量比 １０ ｇ ／ Ｌ树脂添加量有所降低，这
５　 第 ３期 成喜雨等：原位吸附浸没式膜生物反应器催化制备茚二醇
可能与树脂添加对微生物活性影响和营养成分的
吸附有关，相似的结果在其他体系中也有所报
道［１１－１２］。 树脂袋的加入有可能对摇瓶反应器中传
质和供氧产生负面影响，从而影响转化效率。 然
而，此结果也预示在放大的反应器系统中，可能可
以取得比现有摇瓶反应器系统更好的转化效率，因
为通过放大，可以设置分离的扩张床系统，对产物
和副产物进行原位移除，同时又可以尽可能降低对
微生物活性和传质供氧的影响。
在相同的摇瓶反应器中，使用硅油的液 液两相
摇瓶系统，顺式茚二醇质量浓度在 １０ 和 １２ ｈ 分别
达到 ２１０和 ２５０ ｍｇ ／ Ｌ，通过过程优化，产量可以进
一步提高到 ４００ ｍｇ ／ Ｌ［４］，低于本研究原位吸附
ＩＭＢ Ｌ中所得的 ７０９ ｍｇ ／ Ｌ的水平。 通过采用聚合
物颗粒替代硅油，研究者构建了基于机械搅拌式反
应器的固 液两相系统，终产物质量浓度从 ０􀆰 ２９ ｇ ／ Ｌ
提高到 １􀆰 ２９ ｇ ／ Ｌ［６］，高于 ＩＭＢ Ｌ 中相应水平。 直
接比较上述固 液两相系统和基于摇瓶的 ＩＭＢ 系统
的产量和产率水平很难对 ２ 个体系给出正确的评
价，因为搅拌式反应器允许前者采用优化的底物添
加策略、具有更好的传质和供氧，这些都必然对过
程产生很大影响。 值得注意的是，上述固 液两相系
统中，容积产率从对照的 ２９ ｍｇ ／ （Ｌ·ｈ） 提高到 ９０
ｍｇ ／ （Ｌ·ｈ），获得了 ３ 倍的提高；而采用 ＩＭＢ 系统，
容积产率从对照的 ６ ｍｇ ／ （ Ｌ·ｈ ） 提高到 ３０
ｍｇ ／ （Ｌ·ｈ），获得了 ５ 倍的提高。 另外，在此膜反应
器中，吸附于膜上的微生物和悬浮微生物都可以进
行生物转化，培养基在膜组件内部的连续循环也将
控制固定化微生物和悬浮微生物的数量，传统废水
处理膜生物反应器中经常碰到的膜污染问题在本
系统中并未观察到，从电镜照片可以看到 （图 １
（ｄ）），微生物并未形成致密层影响传质和反应。 当
前的 ＩＭＢ系统集成了固定化细胞反应器和两相反
应器的优点，其低的操作费用、巨大的优化空间为
全细胞生物催化过程提供了一个可供选择的重要
途径。
３　 结　 论
在原位吸附 ＩＭＢ系统中，可通过细胞固定化以
及底物、产物和副产物的吸附降低茚生物转化过程
抑制，顺式茚二醇质量浓度和容积产率分别达到
７０９ ｍｇ ／ Ｌ和 ３０ ｍｇ ／ （Ｌ·ｈ），与对照 ＳＣＢ 相比，分别
提高 ７和 ５ 倍。 ＩＭＢ 系统操作简单灵活，可以通过
改变膜丝数量、膜结构、膜材料和循环过程等多种
方式对过程进行优化，进一步提高过程效率。 同
时，ＩＭＢ容易放大，在全细胞生物催化制药领域具有
重要的应用前景。
参考文献：
［ １ ］ 　 Ｐｈａｍ Ｓ Ｑ，Ｇａｏ Ｐ Ｆ，Ｌｉ Ｚ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｅｌｌｓ
ｃｏ⁃ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｐ４５０ｐｙｒＴＭ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｇｌｕｃｏｓｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｒｅｇｉｏ⁃ ａｎｄ ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ
ｏｆ ａｌｉｃｙｃｌｅｓ ｗｉｔｈ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ［ Ｊ］ ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２０１３，
１１０（２）：３６３⁃３７３．
［ ２ ］ 　 Ｎｅｓｔｌ Ｂ Ｍ，Ｎｅｂｅｌ Ｂ Ａ，Ｈａｕｅｒ Ｂ． Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ［Ｊ］ ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，２０１１，１５（２）：１８７⁃１９３．
［ ３ ］ 　 Ｃｈａｎｇ Ｄ Ｌ，Ｆｅｉｔｅｎ Ｈ Ｊ，Ｗｉｔｈｏｌｔ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｉｏ⁃ ａｎｄ ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ
ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ⁃ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｐｉｐｐｒｉｄｉｎ⁃２⁃ｏｎｅｓ ｗｉｔｈ
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＨＸＮ⁃２００［ Ｊ］ ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，２００４，
１５（３）：５７１⁃５７２．
［ ４ ］ 　 Ｃｏｎｎｏｒｓ Ｎ Ｃ，Ｐｒｅｖｏｚｎａｋ Ｒ，Ｃｈａｒｔｒａｉｎ Ｍ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ
ｉｎｄｅｎｅ ｔｏ ｃｉｓ⁃（１Ｓ），（２Ｒ）⁃ｉｎｄａｎｄｉｏｌ ｂｙ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ Ｆ１［Ｊ］ ．Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９７，１８（６）：３５３⁃３５９．
［ ５ ］ 　 Ｂｕｃｋｌａｎｄ Ｂ Ｃ， Ｄｒｅｗ Ｓ Ｗ， Ｃｏｎｎｏｒｓ Ｎ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｅｎｅ ｔｏ ｉｎｄａｎｄｉｏｌ： ａ ｋｅｙ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＣＲＩＸＩＶＡＮ［Ｊ］ ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ，１９９９，１（１）：６３⁃７４．
［ ６ ］ 　 Ｄａｆｏｅ Ｊ Ｔ Ｓ， Ｄａｕｇｕｌｉｓ Ａ Ｊ． Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｓ⁃（ １Ｓ， ２Ｒ ） ⁃
ｉｎｄａｎｄｉｏｌ， ａ ｃｈｉｒａｌ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ， ｕｓｉｎｇ ａ ｓｏｌｉｄ⁃
ｌｉｑｕｉｄ ｔｗｏ⁃ｐｈａｓｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ［ Ｊ ］ ． Ｊ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２０１１， ８６ （ １１ ）：
１３７９⁃１３８５．
［ ７ ］ 　 Ｄａｕｇｕｌｉｓ Ａ Ｊ，Ｋｈａｎ Ｔ Ｒ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒ ｐｈａｓｅ ｒａｔｉｏ ａｎｄ
ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｎ ｓｏｌｉｄ⁃ｌｉｑｕｉｄ ＴＰＰＢｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ⁃
ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌｃａｒｂｉｎｏｌ ｆｒｏｍ ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ ｕｓｉｎｇ Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ［Ｊ］ ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ，２０１１，３３（１）：６３⁃７０．
［ ８ ］ 　 Ｃｈｕｎｇ Ｔ Ｓ， Ｌｏｈ Ｋ Ｃ， Ｔａｙ Ｈ Ｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｎｅ
ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｒｅｍｏｖｅ ｐｈｅｎｏｌ ［ Ｊ］ ． Ｊ
Ａｐｐｌ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ，１９９８，７０（１３）：２５８５⁃２５９４．
［ ９ ］ 　 Ｌｉ Ｙ，Ｌｏｈ Ｋ Ｃ．Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｉｍｐｒｅｇｎａｔｅｄ ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｎｅ ｈｏｌｌｏｗ
ｆｉｂｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｅｔａｂｏｌｉｃ
ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ４⁃ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｐｈｅｎｏｌ［Ｊ］ ．
Ｊ Ｍｅｍｂｒ Ｓｃｉ，２００６，２７６（１ ／ ２）：８１⁃９０．
［１０］ 　 Ｌｉ Ｙ， Ｌｏｈ Ｋ Ｃ． Ｈｙｂｒｉｄ⁃ｈｏｌｌｏｗ⁃ｆｉｂｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｆｏｒ
ｃｏｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ４⁃ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ
ｐｈｅｎｏｌ［Ｊ］ ．Ｊ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｅｎｇ，２００７，１３３（４）：４０４⁃４１０．
［１１］ 　 Ｄ′Ａｒｒｉｇｏ Ｐ，Ｆｕｇａｎｔｉ Ｃ，Ｆａｎｔｏｎｉ Ｇ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｔｒａｃｔｉｖｅ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ：ａ
ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ ｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ［Ｊ］ ．
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４：１５０１７⁃１５０２６．
［１２］ 　 Ａｃｈｍｏｎ Ｙ， Ｇｏｌｄｓｈｔｅｉｎ Ｊ， Ｍａｒｇｅｌ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ
ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｓｉｔｕ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ２⁃ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］ ．Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ，２０１１，２８（７）：６２８⁃６３８．
（责任编辑　 荀志金）
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