全 文 ：第 １２卷第 ３期
２０１４年 ５月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ３
Ｍａｙ ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０３􀆰 ００３
收稿日期：２０１２－０４－１５
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１１ＡＡ０２Ａ２０５，２０１２ＡＡ０２１２０１）；２００８年度江苏省高校“青蓝工程”科技创新团队；江苏高校
优势学科建设工程
作者简介：吴亚斌（１９８８—），男，江西南昌人，硕士研究生，研究方向：生物化工；石贵阳（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｇｙｓｈｉ＠ ｊｉａｎｇｎａｎ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
产 Ｌ 苹果酸重组大肠杆菌的构建
吴亚斌，张　 梁，石贵阳
（江南大学 工业生物技术教育部重点实验室 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，无锡 ２１４１２２）
摘　 要：基于产琥珀酸重组大肠杆菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｂ００１３ １０５０ 的琥珀酸合成途径，利用 Ｒｅｄ 同源重组技术结合 Ｘｅｒ ／ ｄｉｆ
重组系统敲除富马酸酶基因 ｆｕｍＢ、ｆｕｍＣ，苹果酸酶基因 ｍａｅＢ，构建 Ｌ 苹果酸合成途径，最终得到重组大肠杆菌
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０３０，该菌株在 １５ Ｌ发酵罐中，产 Ｌ 苹果酸 １２􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ，葡萄糖 苹果酸转化率为 ５２􀆰 １％，同时对发酵产物中主
要杂酸丙酮酸和琥珀酸的生产原因进行了初步的探讨与分析。 为进一步提高 Ｌ 苹果酸的转化率，整合表达来源
于黄曲霉的苹果酸脱氢酶基因，构建重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０４０，在 １５ Ｌ发酵罐中产 Ｌ 苹果酸 １４ ｇ ／ Ｌ，葡萄糖 苹果酸转化
率提高到 ６０􀆰 ３％。
关键词：整合表达；苹果酸脱氢酶；Ｌ 苹果酸；Ｘｅｒ ／ ｄｉｆ重组系统
中图分类号：Ｑ７８；ＴＱ９２１　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０３－００１２－０７
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ
Ｌ⁃ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ＷＵ Ｙａｂｉｎ，ＺＨＡＮＧ Ｌｉａｎｇ，ＳＨＩ Ｇｕｉｙａｎｇ
（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃｅｒｅａｌ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｂ００１３⁃１０５０，ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ｐａｔｈｗａｙ
ｏｆ Ｌ⁃ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｒｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｘｅｒ ／ ｄｉｆ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｄｅｌｅｔｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｆｕｍＢ，ｆｕｍＣ ａｎｄ ｍａｅＢ ｆｒｏｍ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ａｎｄ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０３０ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ􀆰 Ｌ⁃ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ ｏｆ １２􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ ｗｉｔｈ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ５２􀆰 １％ ｗａｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｉｎ ａ １５⁃Ｌ
ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ． Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｂｙ⁃ｐｒｏｄｕｃｔｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｙｒｕｖｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ􀆰 Ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ
ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ Ｌ⁃ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ， ｔｈｅ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｇｅｎｅ ｍｄｈ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ｗａｓ
ｉｎｔｅｇｒａｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０４０ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｔｈｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ Ｌ⁃ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｏ １４ ｇ ／ Ｌ ａｎｄ ６０􀆰 ３％ ｉｎ ａ １５⁃Ｌ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｉｎｔｅｇｒａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；Ｌ⁃ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ；Ｘｅｒ ／ ｄｉｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ
　 　 Ｌ 苹果酸是生物体内三羧酸循环的重要一员，
在生物体中具有重要的生理功能［１］；同时也是天然
果酸的重要组成部分，其酸味持久柔和，是优良的
酸味剂。 因为上述特性，Ｌ 苹果酸在医药、食品等
多个行业中都有广泛用途［２］。 合成单一手性的 Ｌ
苹果酸主要方法有细胞 ／酶转化法和微生物发酵
法［３］，胡永红等［４］以富马酸钙为底物，采用游离延
胡索酸酶，直接转化生成苹果酸钙，在 ４０ ℃、ｐＨ
７􀆰 ０～７􀆰 ５的条件下，每升延胡索酸酶液能在 ２０ ～ ２８
ｈ可将 ３􀆰 ２ ｋｇ的富马酸钙转化生成苹果酸钙，转化
率高达 ９９􀆰 ９％；周小燕等［５］使用 Ｌ 苹果酸高产突
变株曲霉 Ｎ１ １４′在 ５ Ｌ罐上发酵 １２０ ｈ，Ｌ 苹果酸
产量达 １０５􀆰 ８８ ｇ ／ Ｌ，平均产生速率 ０􀆰 ８８３ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），
糖酸转化率 ７８􀆰 ４３％。
大肠杆菌遗传背景清楚、易于进行代谢调控，
操作简便，在厌氧条件下进行混合酸发酵（图 １），可
发酵糖生成甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸和乙醇等产
物。 通过代谢工程和基因敲除技术对大肠杆菌代
谢途径进行改造，可消除副产物的积累，提高目的
产物的产量。 如 Ｚｈｏｕ 等［６］和 Ｊａｎｔａｍａ 等［７］利用基
于 ＦＬＰ ／ ＦＲＴ重组酶系统的基因敲除技术对大肠杆
菌的代谢途径进行改造，获得生产不同物质的重组
大肠杆菌，其产物包括乙醇、丙酮酸、乳酸和琥珀酸
等。 基于此研究思路，在大肠杆菌中构建 Ｌ 苹果酸
的合成途径，同时消除杂酸的影响，有可能获得较
高的产量与转化率。
图 １　 野生大肠杆菌厌氧混合酸发酵途径
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｍａｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｍｉｘｅｄ ａｃｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｗｉｄｅ⁃ｔｙｐｅ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
　 　 笔者以所在实验室前期构建的产琥珀酸重组
大肠杆菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｂ００１３ １０５０［８］（敲除乙酸激酶、磷
酸乙酰转移酶基因 ａｃｋＡ⁃ｐｔａ、乳酸脱氢酶基因 ｌｄｈＡ、
丙酮酸甲酸裂解酶基因 ｐｆｌＢ、乙醇脱氢酶基因 ａｄｈＥ
和酶 ＩＩＣＢＧｌｃ编码基因 ｐｔｓＧ）为出发菌株，利用 Ｒｅｄ同
源重组结合 Ｘｅｒ ／ ｄｉｆ 重组技术［９－１０］继续敲除富马酸
酶基因和苹果酸酶基因，构建 １ 条葡萄糖 ＰＥＰ 草
酰乙酸 Ｌ 苹果酸的合成途径，以实现 Ｌ 苹果酸在
大肠杆菌中的积累。 在此基础上，通过克隆表达来
源于黄曲霉的苹果酸脱氢酶基因，强化合成途径，
进一步提高 Ｌ 苹果酸的转化率。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料与试剂
１􀆰 １􀆰 １　 菌株和质粒
重组菌株 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０１０、Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０２０、Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０３０、
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０４０和重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｂ００１３ １０５０ 由笔者所
在实验室研究人员构建。
质粒：质粒 ｐＳＫ ｄｉｆＧｍ和同源重组的协助质粒
ｐＫＤ４６、质粒 ｐＮｐｈｅＡ保藏于笔者所在实验室；重组质
粒 ｐＭＤ１８ Ｔ ｆｕｍＢ′：：ｄｉｆＧｍ、ｐＭＤ１８ Ｔ ｆｕｍＣ′：：
ｄｉｆＧｍ、ｐＭＤ１８ Ｔ ｍａｅＢ′：：ｄｉｆＧｍ、ｐＵＣ１９ ｐＮｍｄｈ、
３１　 第 ３期 吴亚斌等：产 Ｌ 苹果酸重组大肠杆菌的构建
ｐＢＲ３２２ ｐＮｍｄｈ 和 ｐＴＨ１８ ｐＮｍｄｈ、 ｐＭＤ１８ Ｔ
ｍａｅＢ′：：ｄｉｆＧｍ ｐＮｍｄｈ 均为笔者所在研究课题组研
究人员构建。
１􀆰 １􀆰 ２　 引物
本研究课题设计的引物（表 １）均交由上海生工
生物工程公司代为合成。
１􀆰 １􀆰 ３　 工具酶和试剂
所用 ＤＮＡ 限制性内切酶 ＥｃｏＲＩ、 ＢａｍＨＩ、
ＳｍａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ 和 ＫｐｎＩ，Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶，反转录
试剂盒均购自 Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ 公司；Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶、
ｐＭＤ１８ Ｔ ｓｉｍｐｌｅ ｖｅｃｔｏｒ、ｐｆｕ 高保真 ＤＮＡ 聚合酶
均为宝生生物工程有限公司产品；小量质粒快速
提取试剂盒、小量 ＤＮＡ 片段纯化回收试剂盒和
小量 ＤＮＡ 片段胶回收试剂盒为北京博大泰克生
物基因技术有限责任公司产品；Ｌ 阿拉伯糖购自
上海生工生物工程公司；酵母提取物和胰蛋白胨
为 Ｏｘｏｉｄ 公司产品；其他试剂药品均为国产分
析纯。
表 １　 本研究中所用引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ
引物 ５′➝３′ 限制酶切位点
ｆｕｍＢ１ ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＴＴＣＧＣＧＣＡＣＴＧＴＴＴＧＴＴＧＡＣＧ ＥｃｏＲＩ
ｆｕｍＢ２ ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＣＣＡＴＴＴＴＣＧＡＡＴＡＡＣ ＥｃｏＲＩ
ＲｆｕｍＢ１ ＣＡＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＡＣＣＴＣＧＧ
ＲｆｕｍＢ２ ＧＣＧＴＣＧＴＧＡＡＡＧＧＣＴＴＧＣＴＧ
ｆｕｍＣＲ ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＴＴＡＧＧＣＴＴＧＴＴＧＴＣ ＢａｍＨＩ
ｆｕｍＣＬ ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣ ＢａｍＨＩ
ＲｆｕｍＣＲ ＴＴＣＣＧＴＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＣ
ＲｆｕｍＣＬ ＣＣＧＴＣＧＧＡＡＡＧＡＣＡＴＣＧ
ｍａｅＢ１ ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＴＧＡＡＡＧＧＡＡＣＡＡＣＣＡＡＡＴ ＥｃｏＲＩ
ｍａｅＢ２ ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＣＧＣＡＧＴＡＡＧＴ ＥｃｏＲＩ
ＲｍａｅＢ１ ＡＣＣＧＴＡＴＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣ
ＲｍａｅＢ２ ＧＧＣＡＡＣＧＣＣＴＧＧＴＧＡＧＴ
ＳｆｃＡ１ ＧＣＴＡＣＧＧＣＧＡＴＧＴＴＧＴＣＣ
ＳｆｃＡ２ ＧＡＣＣＣＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡ
ＰＮ２５ ＧＣＴＧＡＣＴＣＧＧＡＡＴＣＡＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＴＧＴＴＣＣＴＣＣＴＴＧＡＡＴＣＴＡＴ
ｍｄｈ ＡＴＧＡＴＴＣＣＧＡＧＴＣＡＧＣＣＧＴ
ｐＵＣ１ ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＧＣＴＴＴＣＡＧＧ ＨｉｎｄＩＩＩ
ｐＵＣ２ ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＴＡＡＧＧＧＴＴＧＧＣＣＴＴＧＡＣＧ ＫｐｎＩ
１􀆰 １􀆰 ４　 培养基
ＬＢ培养基（ｇ ／ Ｌ）：胰蛋白胨 １０，酵母浸出物 ５，
ＮａＣｌ １０。 配制固体培养基时加入 １５ ｇ ／ Ｌ琼脂粉。
Ｍ９ 培养基 （ ｇ ／ Ｌ）： Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２ Ｏ １５􀆰 １２，
ＫＨ２ＰＯ４ ３􀆰 ０，ＮａＣｌ ０􀆰 ５，ＮＨ４Ｃｌ １􀆰 ０。 使用时需按体
积分数 ０􀆰 １％的量补加 Ｍｇ２＋（１ ｍｏｌ ／ Ｌ）和微量元素，
并添加适量葡萄糖溶液作为 Ｃ源。
微量元素（ｍｍｏｌ ／ Ｌ）：ＦｅＣｌ３·６Ｈ２Ｏ ８􀆰 ８８，ＣｏＣｌ２·
６Ｈ２Ｏ １􀆰 ２６，ＣｕＣｌ２·２Ｈ２Ｏ ０􀆰 ８８，ＺｎＣｌ２ ２􀆰 ２０，Ｎａ２ＭｏＯ４·
２Ｈ２Ｏ １􀆰 ２４，Ｈ３ＢＯ３ １􀆰 ２１，ＭｎＣｌ２·４Ｈ２Ｏ ２􀆰 ５。
抗生素：氨苄青霉素，终质量浓度 １００ μｇ ／ ｍＬ；
庆大霉素，终质量浓度 ３０ μｇ ／ ｍＬ；卡那霉素，终质量
浓度 ３０ μｇ ／ ｍＬ。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 目标基因的敲除
利用 Ｒｅｄ同源重组结合 Ｘｅｒ ／ ｄｉｆ 重组技术依次
敲除富马酸酶基因 ｆｕｍＢ 和 ｆｕｍＣ，苹果酸酶基因
ｓｆｃＡ和 ｍａｅＢ。 参照文献［９］的基因敲除方法，依次
构建制备在 ｄｉｆ Ｇｍ ｄｉｆ片段左右带有目标基因上
下游各 ２００ ｂｐ 左右同源臂的突变盒。 将已经导入
质粒 ｐＫＤ４６的大肠杆菌目标菌株在含氨苄青霉素
的 ＬＢ培养基中培养，加入 Ｌ 阿拉伯糖诱导使其产
生 Ｒｅｄ 重组酶，制备感受态细胞，将同源重组片段
与感受态细胞按适当比例充分混合，电击转化并后
培养 １ ｈ，涂布氨苄青霉素和庆大霉素的双抗平板，
３０ ℃培养，挑选阳性转化子。 以验证引物对其进行
４１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
验证。 将验证结果正确的菌株 ３０ ℃下进行传代，使
细胞内 Ｘｅｒ重组酶系统发挥作用自动识别 ｄｉｆ位点，
切除 ｄｉｆ位点间的抗性基因，完成目的基因的敲除。
１􀆰 ２􀆰 ２　 发酵及产物检测
摇瓶发酵：重组菌经平板活化，挑取单菌落接
入 ＬＢ培养基中，３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 培养 １０ ～ １２ ｈ，离
心收集菌体，加入适量 Ｍ９重悬，转接 Ｍ９培养基，葡
萄糖初始质量浓度 ５ ｇ ／ Ｌ，３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 培养 １２
ｈ。 补加葡萄糖溶液至糖质量浓度到 ３０ ｇ ／ Ｌ，以 ５０
ｇ ／ Ｌ的量加入 ＣａＣＯ３，塞上硅胶塞，转入厌氧发酵，
３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ发酵 ３６ ｈ。
１５ Ｌ罐发酵：重组菌的活化和转接与摇瓶发酵
一致，Ｍ９中培养 １２ ｈ后，作为发酵罐的种子液。 发
酵罐装液量为 ６ Ｌ，接种量为 ５％，发酵温度 ３７ ℃，
初始葡萄糖质量浓度 ５ ｇ ／ Ｌ，通气量 ３ Ｌ ／ ｍｉｎ，搅拌
转速 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ，好氧培养使菌体生长，适时调节搅
拌转速（２００～５００ ｒ ／ ｍｉｎ）使得溶解氧体积分数大于
３０％，以 ＮＨ３Ｈ２Ｏ控制 ｐＨ为 ７。 有氧培养至菌体浓
度达到最大，停止通气，搅拌速率降为 １００ ｒ ／ ｍｉｎ，进
入厌氧转化阶段。 按 ６ ｇ ／ Ｌ 加入 ＮａＨＣＯ３，并以 ２􀆰 ４
ｍｏｌ ／ Ｌ Ｋ２ＣＯ３和 １􀆰 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ ＫＯＨ 溶液代替 ＮＨ３Ｈ２Ｏ
控制 ｐＨ为 ７，３７ ℃恒温厌氧发酵 ３０ ｈ。
（ａ） ｓｆｃＡ敲除：１—Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｂ００１３； ２———Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｂ００１３ １０５０；（ｂ） ｆｕｍＢ敲除：１—Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｂ００１３ １０５０；
２—Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｂ００１３ １０５０（ΔｆｕｍＢ′：：ｄｉｆＧｍ）； ３—Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｂ００１３ １０５０（ΔｆｕｍＢ′：：ｄｉｆ）；（ｃ） ｆｕｍＣ敲除：
１—Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｂ００１３ １０５０； ２—Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０１０（ΔｆｕｍＣ′：：ｄｉｆＧｍ）； ３—Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０１０（ΔｆｕｍＣ′：：ｄｉｆ）；
（ｄ） ｍａｅＢ敲除：１—Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｂ００１３ １０５０； ２— Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０２０（ΔｍａｅＢ′：：ｄｉｆＧｍ）； ３—Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０２０（ΔｍａｅＢ′：：ｄｉｆ）；Ｍ—λＤＮＡ ／ ＰｓｔＩ ｍａｒｋｅｒ
图 ２　 基因敲除验证
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ
产物检测：葡萄糖浓度使用生物传感分析仪
（山东省科学院生物研究所）检测；有机酸产量由高
效液相色谱测定仪，泵为 Ｄｉｏｎｅｘ Ｐ６８０，紫外检测器
为 Ｄｉｏｎｅｘ ＵＶＤ１７０Ｕ，色谱柱为反向 Ｃ１８ 色谱柱
Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ １００ ５ Ｃ１８，液相检测条件参照文献［１１］。
１􀆰 ２􀆰 ３　 黄曲霉总 ＲＮＡ的提取及 ｃＤＮＡ的制备
黄曲霉总 ＲＮＡ 的提取方法参照文献［１２］，处
理过后的总 ＲＮＡ 按照反转录试剂盒的说明进行反
转录 ＰＣＲ，得到 ｃＤＮＡ，用于苹果酸脱氢酶基因 ｍｄｈ
的 ＰＣＲ扩增。
１􀆰 ２􀆰 ４　 黄曲霉苹果酸脱氢酶基因 ｍｄｈ 在重组菌中
的表达
以质粒 ｐＮｐｈｅＡ（含有组成型启动子 ＰＮ２５）和黄
曲霉 ｃＤＮＡ为模版，通过重叠 ＰＣＲ扩增得到带有启
动子 ＰＮ２５的 ｍｄｈ 基因，连接不同拷贝数载体质粒
（ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２和 ｐＴＨ１８），构建重组质粒ｐＵＣ１９
ｐＮｍｄｈ、ｐＢＲ３２２ ｐＮｍｄｈ和 ｐＴＨ１８ ｐＮｍｄｈ，并导入
重组菌中进行表达。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 基因敲除重组菌的构建结果
图 ２为基因 ｓｆｃＡ、ｆｕｍＢ、ｆｕｍＣ和 ｍａｅＢ 敲除验证
结果。 扩增 ｓｆｃＡ基因时，先后使用 ２ 对不同的上下
游引物进行 ＰＣＲ，但未得到任何扩增产物，推测 ｓｆｃＡ
基因已被敲除，再设计引物 ｓｆｃＡ１ 和 ｓｆｃＡ２，将目的
基因包括其上下游各 ３００ ｂｐ左右一起扩增，但 ＰＣＲ
结果只有约 ２００ ｂｐ，之后以野生菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｂ００１３ 染
色体为模板，ＰＣＲ结果与预期（２３７９ ｂｐ）相符合，验
证结果见图 ２（ａ）。 由图 ２（ａ）可知：ｓｆｃＡ基因已被敲
除，原因可能是在前期菌株改造过程中，某个突变
５１　 第 ３期 吴亚斌等：产 Ｌ 苹果酸重组大肠杆菌的构建
盒的同源臂与该基因有较高同源性，导致基因同时
被敲除。
基因 ｆｕｍＢ、 ｆｕｍＣ 和 ｍａｅＢ 的敲除验证见图 ２
（ｃ） ～图 ２（ｄ），使用相同引物对出发菌株和基因敲
除菌株进行 ＰＣＲ，扩增产物的大小有明显差异，证
明目标基因片段已从染色体上删除。 对 ３株基因敲
除重组菌分别命名为 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０１０、Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０２０ 和
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０３０。 对于 ｆｕｍＡ基因，考虑到其主要在有氧
条件下作用［１３］，为保证菌体在有氧条件下的正常生
长，本研究未对其进行敲除。
２􀆰 ２　 重组菌的生理特性与发酵实验结果
利用 Ｒｅｄ同源重组系统结合 Ｘｅｒ ／ ｄｉｆ 重组酶系
统，成功构建 １ 株富马酸酶基因（ ｆｕｍＢ 和 ｆｕｍＣ）和
苹果酸酶基因 （ ｓｆｃＡ 和 ｍａｅＢ） 重叠缺失突变株
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０３０，将该重组菌分别于 ＬＢ 和 Ｍ９ 培养基中
培养，测定 ６００ ｎｍ 处吸光值 Ａ６００，以 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｂ００１３
１０５０为对照菌株，绘制生长曲线，结果见图 ３。 由图
３ 可知：所构建的重组菌的生长状况对比于出发菌
株没有太大差别，表明敲除 ｆｕｍＢ、ｆｕｍＣ 和 ｍａｅＢ 基
因并不会对菌体的好氧生长产生影响。
图 ３　 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｂ００１３ １０５０及其突变株 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０３０的生长特性比较
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ａｅｒｏｂｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｗｔｅｅｎ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｂ００１３⁃１０５０ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｕｔａｎｔ ２０３０
ｉｎ ＬＢ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ Ｍ９ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ５ ｇ ／ Ｌ ｇｌｕｃｏｓｅ
　 　 对重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０１０、２０２０和 ２０３０进行摇瓶发酵试
验，以出发菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｂ００１３ １０５０作为对照，发酵结果见
表 ２。 由表 ２可知：敲除基因 ｆｕｍＢ的重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０１０
厌氧发酵的主要产物是丙酮酸和琥珀酸，和出发菌相比
较，琥珀酸的产量下降，葡萄糖 琥珀酸转化率由出发菌
的 ３８􀆰 ９％下降为 ２６％。 而继续敲除 ｆｕｍＣ基因的重组菌
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０２０的琥珀酸产量却只有微弱的下降，并未到达
预期中完全消除琥珀酸积累的目的。
表 ２　 基因敲除重组菌摇瓶发酵结果
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ ｓｈａｋｅ ｆｌａｓｋ
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ菌株 ρ（葡萄糖） ／（ｇ·Ｌ－１）
丙酮酸 琥珀酸 苹果酸
ρ ／ （ｇ·Ｌ－１） 产率 ／ ％ ρ ／ （ｇ·Ｌ－１） 产率 ／ ％ ρ ／ （ｇ·Ｌ－１） 产率 ／ ％
Ｂ００１３ １０５０ １７ ５􀆰 ３２ ３１􀆰 ３ ６􀆰 ６１ ３８􀆰 ９ — —
２０１０ １４ ６􀆰 ０７ ４３􀆰 ４ ３􀆰 ６４ ２６􀆰 ０ — —
２０２０ １４ ６􀆰 ２８ ４４􀆰 ８ ３􀆰 ４８ ２４􀆰 ８ — —
２０３０ １０ ３􀆰 ０４ ３０􀆰 ４ ２􀆰 ３６ ２３􀆰 ６ １􀆰 ７６ １７􀆰 ６
　 　 与之前 ２株重组菌相比，继续敲除苹果酸酶基
因的重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０３０发酵产物中，琥珀酸的转化
率变化不大，而丙酮酸的转化率下降，最终生成苹
果酸 １􀆰 ７６ ｇ ／ Ｌ，葡萄糖 苹果酸转化率为 １７􀆰 ６％。
重组菌 ２０３０ 在 １５ Ｌ 罐中发酵，考察其产酸能
力，发酵结果如图 ４ 所示。 由图 ４ 可知：厌氧发酵
３０ ｈ，耗糖 ２４ ｇ ／ Ｌ，最终产 Ｌ 苹果酸 １２􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ，葡萄
糖 苹果酸转化率为 ５２􀆰 １％， 生产强度 ０􀆰 ４２
ｇ ／ （Ｌ·ｈ）。 丙酮酸转化率下降到 １９􀆰 ３％。 发酵液中
还检测到琥珀酸和少量的乳酸。
６１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
图 ４　 重组大肠杆菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０３０在
１５ Ｌ发酵罐中发酵产酸情况
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥ􀆰 ｃｏｌｉ ２０３０
ｉｎ ａ １５⁃Ｌ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ
２􀆰 ３　 苹果酸脱氢酶基因 ｍｄｈ 表达量对 Ｌ 苹果酸
产率的影响
　 　 苹果酸脱氢酶（ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＭＤＨ，ＥＣ
１􀆰 １􀆰 １􀆰 ３７）是笔者所构建的 Ｌ 苹果酸合成途径中的
一个关键酶，通过强化 ＭＤＨ 的表达，可引导代谢流
更多地走向 Ｌ 苹果酸合成途径，提高目的产物的转
化率。 Ｐｅｌｅｇ等［１４］发现在黄曲霉中 Ｌ 苹果酸的合
成主要来自于草酰乙酸，苹果酸脱氢酶在 Ｌ 苹果酸
生产中起到了重要作用。 本文此前构建的合成途
径也是由草酰乙酸生成 Ｌ 苹果酸，因此克隆了来源
于黄曲霉的苹果酸脱氢酶基因 ｍｄｈ，连接至不同拷
贝数载体，并在重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０３０ 中进行表达，考
察其表达量对 Ｌ 苹果酸产率的影响。
绘制含不同拷贝数质粒的重组菌在 Ｍ９ 培养基
中的生长曲线，结果见图 ５。 由图 ５ 可知：在相同的
培养条件下，携带高拷贝质粒的重组菌所能达到的
菌体浓度明显小于携带中低拷贝数质粒的重组菌，
这是因为更多的能量被用于蛋白质合成而影响了
菌体的生长。 其余 ２ 个重组菌的生长状况相似，对
比于重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０３０，最终的菌体浓度也没有太
大差别。 这表明苹果酸脱氢酶的表达量应控制在
中低水平，过高则会影响菌体的生长。
以菌株 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０３０作为对照，对含不同拷贝数
质粒的重组菌进行摇瓶发酵试验，发酵结果见表 ３。
由表 ３可知：厌氧发酵 ３６ ｈ后，相较于对照菌，Ｌ 苹
果酸的产量和转化率都有不同程度的提高，并且随
着拷贝数的降低，Ｌ 苹果酸的转化率也逐渐升高。
上述结果表明，想要获得较好的强化作用，需要将
苹果酸脱氢酶的表达量控制在较低的水平，而不是
越高越好。
图 ５　 携带不同拷贝数质粒的重组菌生长曲线
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ
ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｉｔｈ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ
表 ３　 含有不同拷贝数质粒的重组菌产 Ｌ 苹果酸
能力的比较
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｌ⁃ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｗｔｅｅｎ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ菌株 ρ（葡萄糖） ／（ｇ·Ｌ－１）
苹果酸
ρ ／ （ｇ·Ｌ－１） 产率 ／ ％
２０３０ １１ １􀆰 ８ １６􀆰 ４
２０３０（ｐＵＣ１９ ｐＮｍｄｈ） １３ ２􀆰 ３７ １８􀆰 ２
２０３０（ｐＢＲ３２２ ｐＮｍｄｈ） １２ ２􀆰 ５ ２０􀆰 ８
２０３０（ｐＴＨ１８ ｐＮｍｄｈ） １２ ２􀆰 ５９ ２１􀆰 ６
　 注：该结果为 ３次实验的平均值。
２􀆰 ４　 重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０４０的构建及其发酵实验结果
为了实现苹果酸脱氢酶基因的稳定遗传并控
制其表达量在较低水平，将 ｍｄｈ 基因整合表达于重
组菌中。 根据之前的基因敲除方法，将同源重组突
变盒 ｍａｅＢ′：：ｄｉｆＧｍ 连接至 ｐＭＤ１８ Ｔ ｍａｅＢ′：：
ｐＮｍｄｈ，构建突变盒 ｍａｅＢ′：：ｄｉｆＧｍ ｐＮｍｄｈ，使用该
突变盒在敲除 ｍａｅＢ 基因的同时，将基因 ｍｄｈ 整合
于重组大肠杆菌染色体上。 基因整合的验证结果
见图 ６。 由图 ６ 可知，ｍｄｈ 已整合于重组菌染色体
上，将该菌命名为 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０４０。
图 ７为 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０４０在 １５ Ｌ罐中厌氧发酵结果。
由图 ７可知：厌氧发酵 ３０ ｈ，耗糖 ２３􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ，最终产
Ｌ 苹果酸 １４ ｇ ／ Ｌ，葡萄糖 苹果酸转化率为 ６０􀆰 ３％，
生产强度 ０􀆰 ４７ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）。
对于利用大肠杆菌直接发酵生产 Ｌ 苹果酸，国
内外学者已有一定的研究，Ｚｈａｎｇ 等［１５］以产琥珀酸
重组大肠杆菌 ＫＪ０７３ 为出发菌，继续敲除富马酸酶
ｆｕｍＡＣ和 ｆｕｍＢ，延胡索酸还原酶 ｆｒｄＢＣ，苹果酸酶
ｓｆｃＡ和 ｍａｅＢ，得到菌株 ＸＺ６５８，在 ３ Ｌ 罐中，经两段
７１　 第 ３期 吴亚斌等：产 Ｌ 苹果酸重组大肠杆菌的构建
１—Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｂ００１３ １０５０； ２—Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０２０（ΔｍａｅＢ′：：ｄｉｆＧｍ ｐＮｍｄｈ）；
３—Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０２０（ΔｍａｅＢ′：：ｄｉｆ ｐＮｍｄｈ）； Ｍ—λＤＮＡ ／ ＰｓｔＩ ｍａｒｋｅｒ
图 ６　 ｍｄｈ基因整合表达的验证
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｍａｄｈ ｉｎｔｅｇｒａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
图 ７　 重组大肠杆菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ２０４０在
１５ Ｌ发酵罐中发酵产酸情况
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥ􀆰 ｃｏｌｉ ２０４０
ｉｎ ａ １５⁃Ｌ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ
式发酵 ７２ ｈ，耗糖 ３２􀆰 ８ ｇ ／ Ｌ，最终产苹果酸 ３４ ｇ ／ Ｌ，
葡萄糖 苹果酸转化率为 １０３􀆰 ８％，生产强度 ０􀆰 ４７
ｇ ／ （Ｌ·ｈ），其他的杂酸只有少量的琥珀酸、乳酸和乙
酸（１ ｇ ／ Ｌ左右），是目前产 Ｌ 苹果酸大肠杆菌中转
化率最高的 １株。 但由于 ｆｕｍＡ基因的缺失，重组菌
的生长受到影响，导致发酵周期的延长（有氧培养
１６ ｈ，发酵周期 ７２ ｈ）。 本文菌株拥有较好的生长性
能，可为后期的厌氧转化提供较高的初始菌体浓
度，并缩短整个发酵周期，在此基础上继续对菌株
进行改造，提高苹果酸的产量及转化率，则可获得
性能更为优良的菌株。
３　 结　 论
基于重组大肠杆菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｂ００１３ １０５０ 的琥珀
酸生成途径，利用 Ｒｅｄ同源重组结合 Ｘｅｒ ／ ｄｉｆ重组系
统敲除富马酸酶基因 ｆｕｍＢ 和 ｆｕｍＣ，苹果酸酶基因
ｓｆｃＡ和 ｍａｅＢ，成功构建 Ｌ 苹果酸合成途径，经 １５ Ｌ
罐发酵产 Ｌ 苹果酸 １２􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ，葡萄糖 苹果酸转化
率为 ５２􀆰 １％，主要杂酸为丙酮酸及琥珀酸；之后引
入来源于黄曲霉的苹果酸脱氢酶，强化该途径，使
Ｌ 苹果酸产量提高到 １４ ｇ ／ Ｌ，葡萄糖 苹果酸转化
率提高到 ６０􀆰 ３％，同时降低了丙酮酸及琥珀酸的转
化率。
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ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ［ Ｊ ］ ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ
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（责任编辑　 荀志金）
８１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷