全 文 ：第 31 卷　第 4期
2009 年 7 月
北　京　林　业　大　学　学　报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol.31 , No.4
Jul., 2009
收稿日期:2008--11--05
http: www.bjfujournal.cn , http: journal.bjfu.edu.cn
基金项目:国家自然科学基金项目(30872004)、辽宁省科学技术基金项目(2007207005)。
第一作者:王伟。主要研究方向:杨树耐盐生理。电话:15940834713　Email:wangwei15dfg@163.com　地址:116600大连经济技术开发区辽
河西路 18号大连民族学院生物技术与资源利用国家民委--教育部重点实验室。
责任作者:姜国斌 , 博士 ,教授。主要研究方向:树木耐盐生理。电话:0411--87656278　Email:jgb@dlnu.edu.cn　地址:同上。
微透析法获取鹅掌柴嫩茎质外体汁液的研究
王　伟1 , 2　刘明国1 　尹伟伦3　姜国斌2
(1沈阳农业大学林学院　2 大连民族学院生物技术与资源利用国家民委--教育部重点实验室　3北京林业大学)
摘要:该文研究的重点是获取质外体汁液。假设微透析技术可以在植物上得到质外体汁液 , 并以盆栽鹅掌柴为材
料 ,在活体嫩茎插入微透析探针后的不同时间段内分别收集透析液 , 测定其中的离子浓度和苹果酸脱氢酶活性加
以验证。结果表明:在探针插入 120 min后 , 收集的透析液中 Na+ 、K+和 Ca2+浓度逐渐趋于平缓 ,并且苹果酸脱氢
酶的活性消失 ,从而证明 120 min后得到的微透析液 ,没有受到破损细胞液的污染 , 是纯净的鹅掌柴嫩茎质外体汁
液 ,从而为活体 、方便 、快捷地获取植物质外体汁液提供新的方法。
关键词:鹅掌柴;质外体;微透析;离子;苹果酸脱氢酶
中图分类号:S718.43　　文献标志码:A　　文章编号:1000--1522(2009)04--0041--04
WANG Wei
1, 2 ;LIU Ming-guo1 ;YIN Wei-lun3 ;JIANG Guo-bin2 .Extracting apoplastic succus in a
Schefflera octophylla tender stem by microdialysis.Journal of Beijing Forestry University (2009)31(4)
41-44 [Ch , 15 ref.]
1 Faculty of Forestry , Shenyang Agricultural University , 110161 , P.R.China;
2 Key Laboratory of Biotechnology &Bio-Resources Utilization , State Ethnic Affairs Commission and Ministry
of Education , Dalian Nationalities University , Liaoning Province , 116600 , P.R.China;
3 Beijing Forestry University ,100083 ,P.R.China.
This study assumed that apoplastic sap can be obtained by the method of microdialysis.We used
Schefflera octophylla cultured in pots as study materials.Dialysis fluid was collected during the different time
periods after probe of microdialysis was inserted into living tender stem , and the ion concentration and malate
dehydrogenase (MDH)activity of the dialysis fluid were determined.The results showed that Na+ , K+ and
Ca
2+
concentration of the dialysis fluid gradually tended to stability and MDH showed no activity 120 minutes
after the probe was inserted into living tender.The results proved that the dialysis fluid collected was not
polluted by intracellular fluid of damaged cells and was pure apoplast in S .octophylla tender stem.This
microdialysis technique provides a new method for obtaining apoplastic sap in vivo conveniently and quickly.
Key words　Schefflera octophylla;apoplast;microdialysis;ion;malate dehydrogenase (MDH)
　　植物质外体是许多重要的生理生化过程和反应
的动态空间 ,由于质外体不能从植物组织上分离下
来 ,所以在植物质外体的研究方法上存在诸多问题 ,
尤其是活体植物质外体汁液成分的动态分析较难实
现。目前普遍采用的离心法 、灌注法等提取质外体
汁液的方法存在不少缺点 ,如提取液易受到污染 ,质
外体组分会发生变化 ,无法对局部质外体进行定位
研究以及测定结果不能反映质外体内组分的动态变
化等[ 1] 。虽然在盐胁迫下植物质外体的离子和 pH
的研究中 ,荧光比例成像法 、离子选择微电极法和植
物转基因指示法等能够在活体植物上测定 pH 和部
分离子 , 具有较高的时间分辨率 , 可实现动态观
测[ 2-5] ,但是这些研究操作难度较大 ,其测定范围也
受到诸多限制 。然而 ,近年来在动物 、人体细胞外液
的取样和分析上得到广泛应用的微透析技术为植物
质外体汁液成分的活体 、实时 、在线的动态分析提供
了可能。
微透析的主要原理是将一种具有半透膜的探针
DOI :10.13332/j.1000-1522.2009.04.016
植入生物体内 ,开动微量注射泵 ,使灌流液流经探针
(通常膜外浓度高于膜内浓度)可透过膜的小分子物
质通过扩散进入透析管 ,灌流液和组织液中的待测
物质达到一个动态平衡 ,收集透析液便可结合高效
液相色谱(HPLC)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、高效
毛细管电泳仪(HPCE)和质谱(MS)等高灵敏度检测
仪器测定透析液中组织细胞外液的待测物的动态变
化 ,基本的微透析系统示意图见文献[ 6] 。虽然 ,微
透析技术已在挪威云杉(Picea abies)的茎形成层 、苹
果(Malus sp.)果实[ 7-8] 、豌豆(Pisum sativum)和李子
(Prunus sp.)果实[ 9]的研究中得到应用 ,但是上述研
究均未提出如何采用微透析技术获取植物质外体汁
液 ,而这一问题却是微透析技术应用于植物质外体
研究时所必须解决的问题 。
因此 ,笔者受微透析技术在动物(包括人体)上
得到细胞间液[ 10] 这一研究结果的启发 ,假设微透析
技术可以在植物上得到质外体汁液 ,并以盆栽鹅掌
柴(Schefflera octophylla)为材料 ,在活体嫩茎插入微
透析探针后的不同时间段内分别收集透析液 ,测定
其中的离子浓度和苹果酸脱氢酶活性加以验证 ,寻
求植物质外体研究的新方法。
1　方法与材料
1.1　试验材料
以盆栽鹅掌柴幼苗为材料 ,在其长出3 ～ 4个侧
枝时选择生长一致的 3盆植株 ,对嫩茎中上部进行
微透析试验。
1.2　微透析取样方法
微透析设备包括 1个微量注射泵 、3支注射器 、
3个微透析探针 、3个进液管和 3个出液管 ,这些设
备均购自美国 BAS 公司。进液管和出液管用来连
接探针的进出口 ,管内灌流液为 Millipore-Q 超纯
水 ,微透析探针截留分子量分别为 30和 100 kD。先
连接好电源 、微量注射泵 、注射器 、进液管 、探针和出
液管 ,开动微量注射泵 ,调整泵的灌流速度为 1 μL
min;当出液管头开始出水时 ,为防止微透析探针的
损坏 ,先将硬的导引管成 30°～ 45°角插入植物嫩茎
中部 ,然后再植入探针 ,同时将出液管末端放到离心
管中收集透析液并开始计时。为防止灌流液流失 ,在
插入探针后立即采用牙托水(取少量自凝粉 ,用胶头
吸管吸适量义齿基托树脂液剂搅拌 ,至黏糊状即可)
密封。本研究包括两方面试验:①选用截留分子量为
30 kD的探针 ,分别在探针插入后 0 ～ 30 min 、30 ～
60 min 、60 ～ 90 min 、90 ～ 120 min 、120 ～ 150 min 、
150 ～ 180 min和180 ～ 210min 7个不同的时间段收集
透析液 。各段分别收集在不同的离心管中 ,每段分
次收集0.1 mL ,用来进行Na+ 、K+和Ca2+浓度测定 。
②选用截留量为 100 kD的探针 ,分别在探针插入后
0 ～ 60 min 、60 ～ 120 min 、120 ～ 180 min 、180 ～ 240 min
和 240 ～ 300 min 5个时间段收集透析液 。各段分别
收集在不同的离心管中 ,在收集时离心管应放在盛
有冰块的盒子中 ,各收集 0.06 mL , 用来测定苹果酸
脱氢酶的活性 。以上试验重复 3次 。
1.3　Na+ 、K+ 、Ca2+浓度和回收率的测定
对 7个不同时间段内收集的鹅掌柴嫩茎透析液
用超纯水分别稀释 10倍后 ,采用原子吸收分光光度
计(日立 Z--2000)石墨法分别测定 Na+ 、K+和 Ca2+
浓度 ,并将测定的浓度用体外相对回收率进行修正。
本试验用体外相对回收率来修正测量值。将微
透析探针插入已知浓度的离子标准液(用购自国家
标准物质中心的离子国标液配制)中 , 管内灌流液
为Millipore--Q超纯水 ,在1μL min灌流速度下取样 ,
每次取样之前须平衡稳定 30 min ,得到的透析液弃
之不用;对其后再取样 100 min 得到的透析液进行
检测 。本试验重复 3次。测定浓度与标准液浓度之
比就是体外相对回收率 。本试验得到的体外相对回
收率为 8%。
1.4　苹果酸脱氢酶活性的测定
利用苹果酸脱氢酶测定试剂盒(购自中国南京
建成生物 工程研 究所)和紫 外分 光光度 计
(Lambda25 ,USA)对透析液中苹果酸脱氢酶(MDH)
活性进行测定 ,每个时间段的透析液取出后马上进
行测定。
1)准备工作:取两只 0.5 cm光径石英比色皿 ,
用蒸馏水冲洗干净;一只加入蒸馏水于 340 nm处调
零 , 另一只作测定用。
2)在测定管中加入混合试剂 1 mL , 37℃预温 3
min , 取出试管加入样本 50μL , 同时立即计时(按秒
表), 随即混匀;混匀后将试管内的反应液倒入 0.5
cm光径石英比色皿中 , 于 340 nm处(蒸馏水调零)
测定 20 s时的吸光度值(OD1), 在 1 min 20 s时再
次测定吸光度值(OD2)。空白管测定步骤和测定管
一样 ,只将加入的样本改为蒸馏水 。
MDH活力 =(OD1 -OD2)-(OD′1 -OD′2)
6.2 ×0.5 Vv k
式中:OD′1 为 20 s时空白管的吸光度值;OD′2 为 1
min 20 s时空白管的吸光度值;V 为反应液总体积;
v 为取样量;k 为样本测试前稀释系数;6.2为底物
的微摩尔消光系数;0.5为比色皿的比色光径。
2　结果与分析
2.1　透析液中 Na+ 、K+和 Ca2+浓度的变化
一般来说 ,采用微透析技术取样时 ,在微透析探
针插入植物嫩茎之前 ,要先插入一个相对于植物组
42 北　京　林　业　大　学　学　报 第 31卷　
织更为坚硬的针状物 ,以避免探针的损坏 ,所以 ,尽
管植物细胞有细胞壁 ,其取样部位的组织也都不可
避免地会有一些细胞被损坏。这些被损坏的细胞的
细胞液就会与质外体汁液一起 ,透过微透析膜成为
微透析液的一部分 ,从而造成由细胞液带来的污染 。
如何除去透析液中的细胞液污染 ,得到适于分析的
纯净的质外体汁液 ,成为微透析技术应用在植物质
外体研究中的重要课题。由于通常植物细胞液中的
离子含量高于质外体[ 11] ,所以将探针插入植物嫩茎
后 ,因受破损细胞的细胞液污染 ,刚开始收集的透析
液中离子的含量相对较高;随着灌流的进行 ,细胞液
逐渐被透析出来 ,离子含量应逐渐降低而趋于平稳 。
因此 ,本研究对鹅掌柴的活体嫩茎进行微透析 ,收集
探针插入后不同时间段内的透析液 ,分别测定透析
液中Na+ 、K+和 Ca2+含量的变化趋势(见图 1 ～ 3),
用以证实笔者提出的假设 ———微透析技术可以在植
物上得到质外体汁液 。从图 1 ～ 3中可以看出 ,在前
120 min内Na+ 、K+和 Ca2+浓度明显高于 120 min以
后 ,并且有逐渐下降的趋势;在前 60 min内收集的
透析液中Na+ 、K+和Ca2+的浓度达到最大值;在120
min以后 Na+ 、K +和 Ca2+浓度逐渐趋于稳定 。在微
透析探针插入后刚开始收集时 ,因连接管内含有水 ,
所以在前 30 min内收集的微透析液被稀释 , Na+ 、
K
+和 Ca2+浓度比较低。
图 1　探针插入后不同时间段收集的透析液中Na+的含量
FIGURE 1　Na+ content of dialysi s solution collected
at different time after probe insertion
注:A 、B 、C 、D、E 、F、G 分别表示 0～ 30 min 、30～ 60 min、60～ 90
min 、90～ 120 min 、120 ～ 150 min 、150～ 180 min和 180～ 210 min。
图 2～ 3同此。
在动物 、人体上的微透析试验中 ,其透析液成分
随时间变化的趋势与本试验结果相似[ 12--14] 。如韩慧
婉等[ 12] 对鼠脑微透析液痕量氨基酸的激光诱导荧
光检测中发现 ,探针插入后 0 ～ 1 h内透析液中氨基
酸含量明显高于 1 ～ 2 h内的;开始30 min内最为明
显 ,90 min后逐渐趋于平稳。
另外 ,在动物 、人体上的微透析试验中 ,为了防
止微透析液混有破碎细胞的细胞内成分 ,以及取样
对象对取样环境新异刺激的反应等因素影响检测结
果 ,对于透析液初始采样时间有一定的要求 。
图 2　探针插入后不同时间段收集的透析液中K +的含量
FIGURE 2　K + content of dialysis solution collected
at different time after probe insertion
图 3　探针插入后不同时间段收集的透析液中 Ca2+的含量
FIGURE 3　Ca2+ content of dialysis solution collected
at different time after probe insertion
Kannerup等[ 13] 在有关猪肝热缺血时新陈代谢的微
透析研究中指出 ,探针插入以后需要 1 h 的冲洗阶
段 ,用来冲洗透析探针以及恢复肝组织因为探针插
入而造成的细胞破坏 。Tsukada等[ 14] 在猴大脑微透
析分析的研究中指出 ,为了除去破碎组织外溢的多
巴胺 ,探针插入2 h以后再收集透析液进行测量 。
以上试验结果与分析表明:动植物微透析成分
分析的变化趋势是相近的 ,都是在开始的一段时间
内数值较高 ,变化比较明显 ,以后逐渐趋于稳定 。这
也与本文对植物微透析的阐述一样 ,当探针刚插入
植物嫩茎时 ,可能会对植物细胞造成一些破坏 ,此时
收集的透析液可能会混有破碎细胞的细胞内成分 ,
使透析液受到污染 。因此 ,随着微透析时间的推移 ,
细胞液成分逐渐减少 ,此后再收集的透析液就是植
物的质外体汁液。在本研究中 , Na+ 、K+和 Ca2+浓
度测定结果间接证明 , 120 min 以后收集的微透析
液 ,就是鹅掌柴嫩茎的质外体汁液 。
2.2　透析液中苹果酸脱氢酶活性的变化
为了进一步证实笔者提出的假设 ,本文对透析
液中苹果酸脱氢酶活性进行分析测定 。苹果酸脱氢
酶是细胞内特有的酶 ,质外体汁液中没有[ 15] ,所以
可作为细胞液的标志性酶。如果透析液中苹果酸脱
氢酶的活性高 ,则可以认为透析液中细胞液污染重;
如果透析液中苹果酸脱氢酶的活性低 ,则可以认为
透析液中细胞液污染轻;如果透析液中苹果酸脱氢
43第 4期 王　伟等:微透析法获取鹅掌柴嫩茎质外体汁液的研究
酶的活性消失 ,则说明所获得的透析液中不含苹果
酸脱氢酶 ,是纯净的质外体汁液。
如图 4所示 ,在探针插入后 ,刚开始 60min内收
集的透析液中苹果酸脱氢酶的活性很高;随着透析
的进行 ,活性逐渐降低;在 120 min后活性消失 。从
而表明探针插入 120 min后得到的透析液是纯净的
质外体汁液 ,也就是说 ,笔者的假设 ———微透析技术
可以在植物上得到质外体汁液 ,得到了直接证明。
图 4　探针插入后不同时间段收集的透析液中
苹果酸脱氢酶的活性变化
FIGURE 4　MDH activity of dialysis solution collected
at different time after probe insertion
注:A 、B 、C 、D、E分别表示 0～ 60min 、60～ 120 min 、
120～ 180 min 、180～ 240 min 、240～ 300 min。
3　结论与讨论
微透析技术在植物研究中有着十分诱人的应用
前景 ,但是尚未作为一个成熟的技术应用到植物质
外体的研究中。微透析技术在植物质外体研究的应
用中可能产生一些问题 ,其中最为重要的问题就是
透析液是否受到细胞液的污染和微透析液是否是质
外体汁液 。
本研究对微透析探针插入鹅掌柴嫩茎后不同时
间段收集的透析液中 Na+ 、K +和 Ca2+浓度和苹果酸
脱氢酶活性分析的测定结果表明 ,在透析速率为
1 μL min ,微透析探针插入鹅掌柴嫩茎 120 min 后得
到的透析液中 , Na+ 、K+和Ca2+浓度趋于稳定 ,苹果
酸脱氢酶活性消失。这就间接和直接地证明了应用
微透析技术可以在鹅掌柴嫩茎上得到质外体汁液 ,
即微透析技术可以在植物上得到质外体汁液这一假
设 ,既得到间接证明 ,也得到直接证明。该方法结合
灵敏的分析检测仪器将能够方便 、快捷 、动态地对植
物质外体汁液进行研究 。但是 ,不同植物和同一植
物的不同品种中 ,由于细胞结构上的差异 ,微透析探
针插入后对组织和细胞造成的破坏不同 。因此 ,为
了获得纯净的质外体汁液 ,在实验开始前 ,均应区别
不同情况 ,确定微透析的初始取样时间 。
参 考 文 献
[ 1 ] 王震宇 ,陶洪斌 ,唐玉林 ,等.植物质外体的研究方法[ J] .植
物生理学通讯 ,1999 , 35(5):394-397.
[ 2 ] BURKHAND S.The apoplast and its significance for plant mineral
nutrition[ J] .New Phytologis , 2001 , 149:167--192.
[ 3 ] KARL H M , ANDRE L.Light-induced pH and K + changes in the
apoplast of intact leaves[ J] .Plant , 2000 , 212:9-15.
[ 4 ] KARL HM , ANDRE L.Determination of apoplastic Na + in intact
leaves of cotton by in vivo f luorescence ratio-imaging[ J] .Functional
Plant Biology , 2002 , 29:1 491--1 499.
[ 5 ] GAO D J , KNIGHT M R , TREWAYAS A J , et al.Self-reporting
arabidopsis expressing pH and [ Ca2+ ] indicators unveil ion
dynamics in the cytoplasm and in the apoplast under abiotic stress
[ J] .Plant Physiology , 2004 , 134:898--908.
[ 6 ] 龚宽平 , 熊少祥.质谱与微透析应用进展[ J] .质谱学报 ,
2003 , 24(3):42-50.
[ 7 ] EKLUND L.Hormone levels in the cambial region of Picea abies
during the onset of cambial activity[ J] .Physiol Plant , 1991 , 82:
385--388.
[ 8 ] EKLUND L.Movement and possible metabolism of ethylene in
dormant Picea abies[ J] .Plant Growth Regulation , 1993 , 12:37--
41.
[ 9 ] MA H M , WANG Z H , ZENG Y , et al.Spectroscopic
measurements of physiological elements inmicrodialysis samples from
rat brain , flowering plum fruit and pea [ J ] .Chinese Chemical
letters , 1999, 10:243--246.
[ 10] AO X P , STENKEN J A.No delayed temporal response to sample
concentration changes during enhanced microdialysis sampling using
cyclodextrins and antibody-immobilized microspheres[ J] .Analyst ,
2006 , 131:62-67.
[ 11] 刘新海 ,朱建军,柏新富 ,等.脱水胁迫对连翘和冬青卫矛叶
片细胞质外体和微环境的影响[ J] .西北植物学报 , 2007, 27
(1):55--61.
[ 12] 韩慧婉 ,舒鸿钧 ,刘国诠.微透析技术及其应用[ J] .化学通
报 , 2000(12):52-56.
[ 13] KANNERUP A S , FUNCH-JENSEN P , GR NBAEK H , et al.
Metabolic changes in the pig liver during warm ischemia and
reperfusion measured by microdialysi s[ J] .J Gastrointest Surg ,
2008 , 12:319-326.
[ 14] TSUKADA H , HARADA N , NISHIYAMA S , et al.Ketamine
decreased striatal [ 11 C] raclopride binding with no alterations in
static dopamine concentrations in the striatal ext racellular fluid in the
monkey brain: Multiparametric PET studies combined with
microdialysi s analysis[ J] .Synaps , 2000 , 37:95-103.
[ 15] TERRY M E, BONNER BA.An examination of centrifugation as a
method of extracting an extracellular solution from peas , and its use
for study of indoleacetic acid-induced growth[ J] .Plant Physiol ,
1980 , 66:321-325.
(责任编辑　冯秀兰)
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