全 文 ：第７卷第４期
２００９年７月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．４
Ｊｕｌｙ２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０４．０１１
收稿日期：２００８－１２－１７
基金项目：科技部科技型中小企业创新基金资助项目（０６Ｃ２６２１５１００４７６）
作者简介：赵晓飞（１９８３—），男，河南新乡人，硕士研究生，研究方向：微生物与生化药学；余 蓉（联系人），研究员，Ｅｍａｉｌ：ｙｕｒｏｎｇ＿ｓｃｕ＠１６３．ｃｏｍ
黏细菌抗凝溶栓双功能蛋白 ＭＦ１的纯化
及其酶学性质
赵晓飞１，余 蓉１，刘冰花２，皮桃英１，李 磊１，温馨蔚１
（１．四川大学 华西药学院，成都 ６１００４１；２．成都大学 医护学院，成都 ６１００１５）
摘 要：对黏细菌Ａｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．的抗凝溶栓双活性蛋白ＭＦ１进行纯化、鉴定并对其酶学性质进行初步研究。采
用丙酮分级沉淀法、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析和 ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０分子筛层析对发酵液进行纯化，用 ＳＤＳＰＡＧＥ
和等电点聚焦电泳对其进行鉴定，并用纤维蛋白平板法和水解酪蛋白法对其酶学性质进行检测。结果表明：经过
一系列的纯化步骤分离得到该蛋白相对分子质量为３２×１０４，等电点为８５，酶的比活力为３０７６１５７Ｕ／ｍｇ，活性
回收率为１３９％；溶栓活性的最适反应温度为３５℃，最适反应 ｐＨ为８０；抗凝时间大于１０ｍｉｎ，且酶活性十分稳
定，在３５℃下保温７２ｈ后仍有８９％活性。首次从黏细菌中分离得到具有较高抗凝和溶栓双活性的 ＭＦ１蛋白，且
稳定不易失活，具有开发成为创新溶栓药物的潜力。
关键词：黏细菌；抗凝；溶栓
中图分类号：Ｑ９３９１５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０４－００５０－０６
ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎＭＦ１ｗｉｔｈｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ
ａｎｄａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｆｒｏｍｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉａ
ＺＨＡＯＸｉａｏｆｅｉ１，ＹＵＲｏｎｇ１，ＬＩＵＢｉｎｇｈｕａ２，ＰＩＴａｏｙｉｎｇ１，ＬＩＬｅｉ１，ＷＥＮＸｉｎｗｅｉ１
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００４１，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＮｕｒｓｅ，ＣｈｅｎｇｄｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００１５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＰｒｏｔｅｉｎＭＦ１ｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｉｔｈｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＡｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄａｎｄ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ，ｔｈｅｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃａｎｄａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｗｅｒｅａｓｓａｙｅｄ．Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆ
ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｗａｓｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄｗｉｔｈａｃｅｔｏｎｅ，ｐｕｒｉ
ｆｉｅｄｂｙＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅａｎｄＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＳＤＳＰＡＧＥａｎｄｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ
ｆｏｃｕｓｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ａｎｄａｓｓａｙｅｄｂｙｔｈｅｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅａｎｄｔｈｅｃａｓｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｗａｓ３２×１０４，ＰＩｗａｓ８５．Ｔｈｅｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｒｅａｃｈｅｄ
３０７６１．５７Ｕ／ｍｇ．Ｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｒａｔｅｗａｓ１３９％，ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｔｅｍｐｅｒｔｕｒｅｏｆｔｈｅｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖ
ｉｔｙｗａｓ３５℃，ｐＨ＝８０，ａｎｄｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｒｅｍａｉｎｅｄ８９％ ａｆｔｅｒｋｅｅｐｉｎｇａｔ３５℃ ｆｏｒ７２ｈ．Ｔｈｅａｎｔｉｃｏａｇｕ
ｌａｎｔｔｉｍｅｗａｓｍｏｒｅｔｈａｎ１０ｍｉｎ．ＩｔｗａｓｔｈｅｆｉｒｓｔｒｅｐｏｒｔｏｆＭＦ１ｆｒｏｍｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｗｉｔｈｂｏｔｈｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ
ａｎｄａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉａ；ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ；ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ
血栓栓塞性疾病是当前危害人类健康，导致死 亡率最高的疾病之一。溶栓抗凝药物的发展对控
制血栓性病人的死亡率起到了十分重要的作用。
临床所使用的溶栓药物如链激酶、尿激酶以及纤溶
酶原激活剂（ｔＰＡ）葡激酶等都存在不同的问题［１］，
同时，抗凝溶栓药物需要分别给药，实际应用过程
中有许多不便之处，所以寻找具有溶栓和抗凝双活
性的药物已逐渐成为研究的热点。黏细菌作为高
等原核生物类群，具有复杂、多细胞行为［２］，在细胞
分化、发育和生物进化研究中占有重要地位，其次
生代谢产物具有种类繁多、结构新颖、作用水平层
次多、作用机制多样等优点，已成为第三大次生代
谢产物产生菌。
虽然微生物是溶栓药物的一个主要来源，如芽孢
杆菌［３］、黄青霉菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｈ９［４］、根
霉（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ１２）［５］以及海洋假单胞菌［６－７］
等，但在黏细菌中尚未有抗血栓物质被发现［８］。本研
究从黏细菌Ａｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．中分离得到天然来源的兼
有抗凝和溶栓双活性的蛋白，命名为ＭＦ １，对其进
行鉴定和酶学性质的初步研究，并研究它的抗凝活
性、溶栓作用机理。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 菌种与培养基
黏细菌菌种由本实验室分离并保藏，从四川成
都文家场的纯食草兔粪中分离得到。培养基为
ＶＹ／４培养基［９］。
１．１．２ 试剂与仪器
试剂：安琪酵母 湖北安琪酵母股份有限公司；
维生素Ｂ１２（ＢＲ）成都市科龙化工试剂厂；尿激酶、
纤维蛋白原、凝血酶标准品 中国医学科学院成都输
血研究所；其他试剂为国产分析纯。
仪器：Ｇ ７５１分光光度计 上海安捷伦公司；
ＨＤ ２核酸蛋白检测仪 上海沪西仪器厂；ＨＳ ４
恒温水浴锅 太仓市科教器材厂；ＰＨＳ ３Ｃ精密 ｐＨ
计 上海雷磁仪器厂。
１．２ 方法
１．２．１ 蛋白的分离方法
丙酮的分级沉淀：将冰丙酮加入发酵液中进行
分级沉淀，收集饱和度 ４０％ ～６０％组分，４０００
ｒ／ｍｉｎ离心，挥发干丙酮。
ＤＥＡＥ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析：用
００６７ｍｏｌ／Ｌ的磷酸盐缓冲液（ｐＨ８９６）平衡，将离
心后的丙酮沉淀溶解液上样，上样后静置３０ｍｉｎ。
再用００６７ｍｏｌ／Ｌ的磷酸盐缓冲液（ｐＨ８９６）洗涤，再
用含有０２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的００６７ｍｏｌ／Ｌ的磷酸盐缓冲
液（ｐＨ８９６）进行洗脱。收集各峰，并检测活性。
ＳｅｐｈａｄｅｘＧ ５０分子筛层析：使用的层析柱规
格为Φ１ｃｍ×７０ｃｍ。用００６７ｍｏｌ／Ｌ的磷酸盐缓冲
液（ｐＨ８９６）平衡层析柱，然后将 ＤＥＡＥ的活性收
集峰上样。使用同样上述缓冲液进行洗脱，流速
１５ｍＬ／ｍｉｎ，收集洗脱峰，并检测活性。
１．２．２ 蛋白含量测定方法
以牛血清白蛋白标准品做标准曲线，用 Ｂｒａｄ
ｆｏｒｄ法［１０］检测蛋白含量。
１．２．３ 溶栓活性检测方法
纤维蛋白平板法［１１］检测纤溶酶活力：将５０μＬ
４００ＮＩＨ单位的凝血酶加入到２５ｍＬ重组纤维蛋白
原溶液（４ｍｇ／ｍＬ）中，迅速混匀，倾入完全融化且已
降至５０℃左右的２５ｍＬ琼脂糖溶液（１０ｇ／Ｌ）中，室
温放置０５ｈ以上，凝固后打孔使用。孔中分别滴加
１０、１００、１０００、５０００和２００００Ｕ／ｍＬ的尿激酶标准
品各３０μＬ。平皿加盖，３７℃温育１５ｈ。测量溶栓
圈相互垂直的两直径１和２，以直径的乘积的对数
ｌｇ１２为纵坐标，以尿激酶标准品的单位活性的对
数ｌｇ（Ｕ／ｍＬ）为横坐标做标准曲线，求出对应的单
位酶活性。
水解酪蛋白法［１２］检测纤溶酶活力：１ｍＬ蛋白酶
液加１ｍＬ酪蛋白溶液（１０ｇ／Ｌ）保温精确反应 １０
ｍｉｎ，立刻加入０４ｍｏｌ／Ｌ三氯乙酸终止反应。１ｍＬ
上清液加５ｍＬ费林 酚甲试剂和１ｍＬ费林 酚乙
试剂４０℃显色２０ｍｉｎ，然后用分光光度计检测Ａ５００。
用酪氨酸做标准曲线，以每分钟水解酪蛋白成
为酪氨酸的毫克数来计算活力。
１．２．４ 抗凝活性检测方法
４００μＬ，４ｍｇ／ｍＬ的重组纤维蛋白原溶液（用５０
ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，０１５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，ｐＨ７４配制）
中加入５０μＬ待测蛋白液，充分混匀。用微量加样
器向混合液中加标准凝血酶（４００ＮＩＨ单位），每次５
μＬ，时间间隔１ｍｉｎ，在１ｍｉｎ内溶液出现凝集，即说
明滴定达到终点。
１．２．５ ＳＤＳ ＰＡＧＥ法鉴定蛋白［１３］
采用分离胶质量浓度为１２０ｇ／Ｌ，浓缩胶质量浓
度为５０ｇ／Ｌ。
１．２．６ 等电点聚焦电泳方法［１３］
等电点聚焦电泳（ＩＦＥ）用溶液配制方法：配制
分离胶质量浓度为 ７５ｇ／Ｌ，浓缩胶质量浓度为 ３０
１５ 第４期 赵晓飞等：黏细菌抗凝溶栓双功能蛋白ＭＦ１的纯化及其酶学性质
ｇ／Ｌ。电泳时，先６０Ｖ预聚焦１５ｍｉｎ，加样后恒流８
ｍＡ，电压升至５５０Ｖ停止电泳。再恒压５８０Ｖ至电流
为零或指示品中的标记性成分不再泳动或时间足
够长且电流保持不变时终止电泳，处理胶板。
凝胶成像系统分析，根据系列等电点标准蛋白
及试样相对位置确定纤溶酶等电点。
１．２．７ 温度、ｐＨ对酶活性及稳定性的影响
参照文献［１４］，在不同温度和ｐＨ下，用水解酪
蛋白法检测酶活力变化，并在不同温度和 ｐＨ中放
置１ｈ，看温度对酶稳定性的影响。
１．２．８ 加热纤维蛋白平板法考察溶栓作用机理［１５］
首先将制备好的纤维蛋白平板在８５℃加热３０
ｍｉｎ，冷却至室温后，加入待测试样，在３７℃保温
１５ｈ，然后测定试样尿激酶的活性，并与这些试样在
常规纤维蛋白平板上的活性作为对照。
２ 结果与讨论
２．１ ＭＦ １蛋白的分离纯化
经过各步分离纯化后，比活力和活性回收率如
表１所示。活性检测方法采用纤维蛋白平板法。
表１ 分离纯化过程中各部分收率
Ｔａｂｌｅ１ Ｙｉｅｌｄｏｆｅａｃｈｓｔｅｐｏｆｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
步骤 总蛋白量／ｍｇ 酶活力／Ｕ
比活力／
（Ｕ·ｍｇ－１）
纯化倍数 回收率／％
发酵液（１００ｍＬ） ５７８７ ２８６×１０５ ４９４３８７ １０ １００
丙酮分级沉淀 １６５７ １４７×１０５ ８８７１６９ １８ ５１４
ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ ２３７ ６６７×１０４ １８７５０３２ ３８ ２３３
ＳｅｐｈａｄｅｘＧ ５０ ０１３ ３９８×１０４ ３０７６１５７ ６２ １３９
由于细菌发酵液中成分复杂，需要选择１种对
多种蛋白初步分离的方式。蛋白的初步分离一般
采用硫酸铵沉淀法或有机溶剂沉淀法，本文选择丙
酮分级沉淀法，因为该方法对蛋白有较高的稳定
性，经过实验测定，冰丙酮不会对蛋白活性造成影
响，而且丙酮沉淀之后还可以省去除盐步骤。经过
离子交换层析（图１）和分子筛（图２）两步层析，得
到单一蛋白ＭＦ １，其比活力为３０７６１５７Ｕ／ｍｇ，活
性回收率为１３９％。
图１ ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析图谱
Ｆｉｇ．１ ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｆＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ
２．２ ＭＦ １蛋白的鉴定
经过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ ５０分子筛层析洗脱的活性
蛋白ＭＦ １经过ＳＤＳ ＰＡＧＥ与标准蛋白的对比分
析得出其相对分子质量为３２×１０４（图３）。等电点
图２ ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０层析图谱
Ｆｉｇ．２ ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｆＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５
聚焦电泳经过凝胶成像系统分析，其等电点为８５。
Ｍ—标准蛋白；１—丙酮分级沉淀试样；
２—ＤＥＡＥ层析试样；３—Ｇ５０层析试样
图３ 纤溶活性蛋白的ＳＤＳＰＡＧＥ图谱
Ｆｉｇ．３ ＳＤＳＰＡＧＥｏｆｅａｃｈｓｔｅｐｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
２５ 生 物 加 工 过 程 第７卷
２．３ ＭＦ １蛋白酶学性质的研究
２．３．１ ＭＦ １作用的最适温度和最适ｐＨ
水解酪蛋白法分别测定蛋白液在不同温度下
的酶活力（图 ４），该酶在３５℃时，酶活性最高，且
２５～５５℃，酶活性变化不大，具有较宽的适用温度。
图４ 温度对酶活性的影响
Ｆｉｇ．４ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎａｃｔｉｖｉｔｙ
在最适温度３５℃下，检测 ｐＨ３０～１１０时酶
的活力大小（图５）。ｐＨ为８０时酶活性最高，其最
适反应 ｐＨ为８０。ｐＨ６０～９０活性没有明显的
变化，表明ＭＦ １较为适合人体弱碱性的ｐＨ范围。
图５ ｐＨ对酶活性的影响
Ｆｉｇ．５ ＥｆｅｃｔｓｏｆｐＨｏｎｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ
２．３．２ ＭＦ １蛋白的热稳定性研究
将ＭＦ １蛋白溶液分别在不同温度下保温
６０ｍｉｎ，在０、１０、２０、４０和６０ｍｉｎ时分别对溶液进行活
力检测，以０ｍｉｎ时的酶活力为１００％，计算出酶活性
的损失（图６）。由图６可以看出，蛋白溶液在３５℃下
保温６０ｍｉｎ，活性仍保留９０％以上；在５５℃和６５℃
时，２０ｍｉｎ以后活性有明显的下降；在７５℃保温１０
ｍｉｎ，酶活立刻降低，低于原来活力的１０％。
将ＭＦ １蛋白溶液保温于３５℃中７２ｈ，并检测
酶活力损失（图７）。由图７可知，在７２ｈ后，酶活仍保
留了８９％，ＭＦ １蛋白具有很高的稳定性。
在对酶蛋白的热稳定性研究中，大多数只考察
图６ 温度对酶稳定性的影响
Ｆｉｇ．６ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｓｔａｂｉｌｉｔｙ
０—温育０ｈ纤溶酶；１—温育１ｈ纤溶酶；２—温育４ｈ纤溶酶；
３—温育８ｈ纤溶酶；４—温育２４ｈ纤溶酶；
５—温育４８ｈ纤溶酶；６—温育７２ｈ纤溶酶
图７ ３５℃下７２ｈ纤溶酶活性变化
Ｆｉｇ．７ Ｃｈａｎｇｅｓｏｆｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｔ３５℃ ｆｏｒ７２ｈ
蛋白在１０～６０ｍｉｎ的活性保留，而 ＭＦ １蛋白在
３５℃最适温度下７２ｈ仍有活性保留。目前临床使
用的溶栓药物，大多数都半衰期较短［１６］，必须短时
间内大量给药。实验表明 ＭＦ １蛋白的溶栓活性
在３５℃下稳定性很高，具有很好的应用研究前景。
２．４ ＭＦ １蛋白的活性作用机理研究
２．４．１ 溶栓作用机理研究
目前降解纤维蛋白主要有２种方式：一类是将
纤溶酶原激活为纤溶酶，从而降解构成血栓骨架的
纤维蛋白；另一类是直接降解血块中的纤维蛋白。
市售的纤维蛋白中都含有少量的纤溶酶原，在加热
的纤维蛋白平板上纤溶酶原被全部破坏其结果分
别见图８和图９。由图８、图９可知，尿激酶在加热
平板上失去溶栓活性，不能在加热的纤维蛋白平板
上产生透明圈，而 ＭＦ １蛋白仍然有纤溶活性，且
透明圈的大小不变。所以 ＭＦ １蛋白的作用机理
与尿激酶的作用机理不同，是直接降解纤维蛋白，
３５ 第４期 赵晓飞等：黏细菌抗凝溶栓双功能蛋白ＭＦ１的纯化及其酶学性质
并没有激活纤溶酶原的作用。理想的溶栓药物需
要对纤维蛋白有较高的特异性，且不激活血液中的
纤溶酶原［１０］。ＭＦ １蛋白就具有这一特点，能够有
效避免溶解血栓过程中出现的副反应。
Ａ—水；Ｂ—尿激酶；Ｃ—活性蛋白
图８ 正常纤维蛋白平板
Ｆｉｇ．８ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｎｎｏｒｍａｌｐｌａｔｅ
Ａ—水；Ｂ—尿激酶；Ｃ—活性蛋白
图９ 加热纤维蛋白平板
Ｆｉｇ．９ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｎｈｅａｔｅｄｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅ
２．４．２ 抗凝活性研究
血液凝固过程主要包括３个阶段：凝血酶原激
活物的形成；凝血酶原激活变成凝血酶；纤维蛋白
原转化为凝胶状的纤维蛋白。抗凝活性的测定是
对酶在纤维蛋白凝固过程中所起的延迟作用进行
考察，纤维蛋白凝固时间越长，则抗凝活性越大。
ＭＦ １蛋白在测定过程中１０ｍｉｎ内没有出现纤维蛋
白凝固现象，已表现出了很高的抗凝活力。抗凝作
用机理有水解纤维蛋白原、抑制凝血酶作用以及抗
血小板凝集等等，由于对ＭＦ １蛋白的抗凝机理并
不明确，采用直接针对凝血酶 纤维蛋白原的测定方
法无法进行其抗凝活力的定量测定。
３ 结 论
在实验室前期对于黏细菌 Ａｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．抗菌
活性研究的基础上，对该株黏细菌的次生代谢产物
做了进一步的分析，首次从黏细菌中得到了这种抗
凝溶栓双活性物质 ＭＦ １蛋白。该蛋白不仅具有
抗凝溶栓双活性，且活性稳定；最适温度和最适 ｐＨ
范围较广，接近于人体的温度和ｐＨ；溶栓机理明确，
直接作用于纤维蛋白。ＭＦ １蛋白的发现不仅拓
宽了微生物产纤溶酶的菌种范围，而且天然来源的
抗凝溶栓双活性物质更是给血栓病的治疗提供了
新的选择，为进一步研究和开发新型血栓药物提供
了重要的理论依据。
参考文献：
［１］ 徐恒启，陈克利．国内抗凝血、抗血栓多糖的药理研究进展
［Ｊ］．生物学杂志，２００５，２２（１）：１４１６．
ＸｕＨｅｎｇｑｉ，ＣｈｅｎＫｅｌｉ．Ｒｅｃｅｎｔｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄ
ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｎＣｈｉｎａ［Ｊ］．Ｊ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，２２（１）：１４１６．
［２］ ＨｏｌｔＪＧ，ＫｒｉｅｇＮＲ，ＳｎｅａｔｈＰＨ，ｅｔａｌ．Ｂｅｒｇｅｙ’ｓｍａｎｕａｌｏｆｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ［Ｍ］．９ｔｈ ｅｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｗｉｌｉａｍｓ＆
Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９４：５１５５２５．
［３］ 余蓉，祁晖，张涛，等．１株诱变的枯草杆菌溶栓酶体内外溶栓
性质初探［Ｊ］．四川大学学报：医学版，２００５，３６（１）：９３９６．
ＹｕＲｏｎｇ，ＱｉＨｕｉ，ＺｈａｎｇＴａｏ，ｅｔａｌ．Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｉｅｓｏｎｉｎ
ｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｆｒｏｍ
ａｎｉｎｄｕｃｅｄＢａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｓｔｒａｉｎ［Ｊ］．ＪＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖ：Ｍｅｄｉｃａｌ
ＳｃｉｅｎｃｅｓＥｄｉｔｉｏｎ，２００５，３６（１）：９３９６．
［４］ ＦｕｊｉｔａＭ，ＮｏｍｕｒａＫ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｓｔｒｏｎｇ
ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅ（Ｎａｔｏｋｉｎａｓｅ）ｉｎｔｈｅｖｅｇｅｔａｂｌｅｃｈｅｅｓｅｎａｔｏ，ａ
ｐｏｐｕｌａｒｓｏｙｂｅａｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｆｏｏｄｉｎＪａｐａｎ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ
ＲｅｓＣｏｍｍｕｎ，１９９３，１９７（３）：１３４０１３４７．
［５］ ＬｉｕＸＬ，ＤｕＬＸ，ＬｕＦＰ，ｅｔａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆａｎｏｖｅｌｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｆｒｏｍＲｈｉｚｏｐｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ１２［Ｊ］．Ａｐｐｌ
ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈ，２００５，６７：２０９２１４．
［６］ 赵洪，何执中．溶栓药物研究进展［Ｊ］．中国生化药物杂志，
２００３，２４（１）：５１５３．
ＺｈａｏＨｏｎｇ，ＨｅＺｈｉｚｈｏｎｇ．Ｔｈｅａｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃａｇｅｎｔｓｒｅ
ｓｅａｒｃｈ［Ｊ］．ＣｈｉｎＪＢｉｏｃｈｅｍＰｈａｒｍ，２００３，２４（１）：５１５３．
［７］ 刘晨光，王鹏，刘成圣，等．海洋假单胞菌纤溶酶的体外溶栓试
验研究［Ｊ］．中国生化药物杂志，２００２，２３（１）：３４３５．
ＬｉｕＣｈｅｎｇｕａｎｇ，ＷａｎｇＰｅｎｇ，ＬｉｕＣｈｅｎｇｓｈｅｎｇ，ｅｔａｌ．Ｓｔｕｄｙｏｎ
ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃｅｆｅｃｔｏｆａｎｏｖｅｌｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｆｒｏｍＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｉｎｖｉｔｒｏ［Ｊ］．ＣｈｉｎＪＢｉｏｃｈｅｍＰｈａｒｍ，２００２，２３（１）：３４３５．
［８］ ＫｌａｕｓＧｅｒｔｈ，ＳｉｌｋｅＰｒａｄｅｌａ，ＯｌｅｎａＰｅｒｌｏｖａ，ｅｔａｌ．Ｍｙｘｏｂａｃｔｅ
ｒｉａ：ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔｐｒｏｄｕｃｅｒｓｏｆｎｏｖｅｌｎａｔｕｒａｌｐｒｏｄｕｃｔｓｗｉｔｈｖａｒｉｏｕｓｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ：ｐａｓｔａｎｄｆｕｔｕｒｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌａｓｐｅｃｔｓｗｉｔｈ
４５ 生 物 加 工 过 程 第７卷
ｔｈｅｆｏｃｕｓｏｎｔｈｅｇｅｎｕｓＳｏｒａｎｇｉｕｍ［Ｊ］．ＪＢｉｏｔｅｃｈ，２００３，１０６：
２３３２５３．
［９］ 刘冰花，李晓红，余蓉，等．囊球黏细菌Ａｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．的生长
特性及其抗菌活性物质初探［Ｊ］．华西药学杂志，２００７，２２
（４）：３８５３８７
ＬｉｕＢｉｎｇｈｕａ，ＬｉＸｉａｏｈｏｎｇ，ＹｕＲｏｎｇ，ｅｔａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ
ｇｒｏｗｔｈａｎｄａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＡｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．［Ｊ］．ＷｅｓｔＣｈｉｎａＪ
ＰｈａｒｍＳｃｉ，２００７，２２（４）：３８５３８７．
［１０］张龙翔，张庭芳，李令媛．生化实验方法和技术［Ｍ］．２版．北
京：高等教育出版社，２００５．
［１１］任启生，陈?，宋新荣，等．重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体
基因的克隆、表达与生物活性鉴定［Ｊ］．生物技术，２００４，１４（５）：
６８．
ＲｅｎＱｉｓｈｅｎｇ，ＣｈｅｎＭａｎ，ＳｏｎｇＸｉｎｒｏｎｇ，ｅｔａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｉｓｓｕｅｔｙｐｅｐｌａｓ
ｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒｍｕｔａｎｔ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００４，１４（５）：６８．
［１２］中华人民共和国药典委员会．中国药典［Ｍ］．２部．北京：化
学工业出版社，２０００．
［１３］郭尧君．蛋白质电泳实验技术［Ｍ］．北京：科学出版社，１９９９．
［１４］郝淑凤，韩斯琴，曾青，等．一种具有纤溶活性的蛋白酶的分离
纯化及性质［Ｊ］．沈阳药科大学学报，２００２，１９（６）：４５１４５４．
ＨａｏＳｈｕｆｅｎｇ，ＨａｎＳｉｑｉｎ，ＺｅｎｇＱｉｎｇ，ｅｔａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒ
ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｆｒｏｍＢａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＪｉｎ２１
［Ｊ］．ＪＳｈｅｎｙａｎｇＰｈａｒｍＵｎｉｖ，２００２，１９（６）：４５１４５４．
［１５］牛术敏，郭晓军，李术娜，等．枯草芽孢杆菌 ＢＳ ２６菌株纤溶
酶的性质分析及活性组分的分离纯化［Ｊ］．微生物学报，
２００８，４８（１０）：１３８７１３９２．
ＮｉｕＳｈｕｍｉｎ，ＧｕｏＸｉａｏｊｕｎ，ＬｉＳｈｕｎａ，ｅｔａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒ
ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｆｒｏｍＢａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＢＳ２６［Ｊ］．
ＡｃｔａＭｉｃｒｏｂＳｉｎｉｃａ，２００８，４８（１０）：１３８７１３９２．
［１６］张彬，孙晓江．溶栓药物的基础和临床研究的新进展［Ｊ］．中
国临床神经科学，２００８，１６（１）：１０８１１１．
ＺｈａｎｇＢｉｎ，ＳｕｎＸｉａｏｊｉａｎｇ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅｂａｓｉｃａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌ
ｓｔｕｄｙｏｆｎｅｗｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃｄｒｕｇｓ［Ｊ］．ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＮｅｕｒｏｓｃｉ，２００８，
１６（１）：
櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
１０８１１１．
国外动态
垃圾变乙醇 生物燃料新做法
和传统生物燃料用谷物制作不同，壳牌公司和加拿大罗根能源公司合作研发新技术的最大亮点在于原
料全部采用麦秆、玉米秆、玉米棒子等农业废料。研究人员使用一种生物酶，将麦秆等材料转变为糖，然后
再从发酵物中提取出酒精 。乙醇和汽油的混合物就能成功驱动汽车。他们已经在加拿大成功建立了一个
生物燃料加油站。壳牌公司称，这种混合燃料可以减少汽车行驶过程中９０％的碳排放。壳牌预计，虽然目
前生物燃料只占全球运输燃料结构的１％，但在几十年以后，这个数字将会高达１０％。
林德公司开发成功丙三醇制氢新技术
林德公司成功开发丙三醇制氢工艺，其子公司Ｈｙｄｒｏｍｏｔｉｖｅ计划于今年中期在德国洛伊纳化工基地建设
一套示范装置，预计２０１０年中期投产。届时，生产的富氢气体将送入现有制氢装置进行提纯和液化。这种
“绿色”液化Ｈ２最初将作为燃料用于德国中心城市柏林和汉堡。丙三醇是生物柴油生产过程中的副产品，
氢含量较高。通过将丙三醇转化为 Ｈ２，生物质的潜在效益被充分利用。该技术的开发扩大了廉价 Ｈ２的
来源。
（朱宏阳）
５５ 第４期 赵晓飞等：黏细菌抗凝溶栓双功能蛋白ＭＦ１的纯化及其酶学性质