全 文 ：第 35 卷第 9 期
2015年 5月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.35,No.9
May,2015
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家自然科学基金青年项目(31100446)
收稿日期:2013鄄08鄄29; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄08鄄01
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: zhaochzh04@ 126.com
DOI: 10.5846 / stxb201308292172
李月蛟, 朱利英, 尹华军, 刘庆, 蒋先敏, 赵春章.连续三年夜间增温和施氮对云杉外生菌根及菌根真菌多样性的影响.生态学报,2015,35(9):
2967鄄2977.
Li Y J, Zhu L Y, Yin H J, Liu Q, Jiang X M, Zhao C Z.Effects of 3鄄year continuous night鄄time warming and nitrogen fertilization on ectomycorrhizae of
Picea asperata and the ectomycorrhizal fungal diversity.Acta Ecologica Sinica,2015,35(9):2967鄄2977.
连续三年夜间增温和施氮对云杉外生菌根及菌根真菌
多样性的影响
李月蛟1,2,3, 朱利英1,3, 尹华军1, 刘摇 庆1, 蒋先敏4, 赵春章1,*
1 中国科学院成都生物研究所, 中国科学院山地生态恢复与生物资源利用重点实验室, 生态恢复与生物多样性保育四川省重点实验室, 成都
610041
2 四川大学生命科学学院, 成都摇 610044
3 中国科学院大学, 北京摇 100049
4 四川省阿坝州川西林业局,摇 阿坝州 623102
摘要:以西南亚高山针叶林建群种粗枝云杉(Picea asperata)为研究对象,采用红外加热模拟增温结合外施氮肥(NH4NO3 25 g N
m-2 a-1)的方法,研究连续 3a夜间增温和施肥对云杉幼苗外生菌根侵染率、土壤外生菌根真菌生物量及其群落多样性的影响。
结果表明:夜间增温对云杉外生菌根侵染率的影响具有季节性及根级差异。 夜间增温对春季(2011 年 5 月)云杉 1 级根,夏季
(2011年 7月)和秋季(2010年 10月)云杉 2级根侵染率影响显著。 除 2011年 7月 1级根外,施氮对云杉 1、2级根侵染率无显
著影响。 夜间增温对土壤中外生菌根真菌的生物量和群落多样性无显著影响,施氮及增温与施氮联合处理使土壤中外生菌根
真菌生物量显著降低,但却提高了外生菌根真菌群落的多样性。 这说明云杉幼苗外生菌根侵染率对温度较敏感,土壤外生菌根
真菌生物量及其群落多样性对施氮较敏感。 这为进一步研究该区域亚高山针叶林地下过程对全球气候变化的响应机制提供了
科学依据。
关键词:云杉; 外生菌根; 侵染率; 群落多样性
Effects of 3鄄year continuous night鄄time warming and nitrogen fertilization on
ectomycorrhizae of Picea asperata and the ectomycorrhizal fungal diversity
LI Yuejiao1,2,3, ZHU Liying1,3, YIN Huajun1, LIU Qing1, JIANG Xianmin4, ZHAO Chunzhang1,*
1 Key Laboratory of Mountain Ecological Restoration and Bioresource Utilization & Ecological Restoration Biodiversity Conservation Key Laboratory of Sichuan
Province, Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Science, Chengdu 610041, China
2 College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610044, China
3 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
4 West Sichuan Forestry Bureau of Aba Tibetan and the Qiang People Autonomous Prefecture, Aba Prefecture, Sichuan 623102, China
Abstract: Global climate changes have become hot topics in ecological research filed in last decade. Picea asperata, the
constructive species of the Southwest subalpine coniferous forest which is well known for its sensitivity to climate changes in
China, is a typical ectomycorrhizal species. Ectomycorrhizal fungi play an important role in the forest system by enhancing
the ability of host trees which form ectomycorrhizal symbionts with them to uptake nutrient and water, promoting seedling
establishment and improving nutrient cycling in the forest by the mycorrhizal networks belowground. Many scientists have
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already studied the effects of warming and nitrogen deposition on Picea asperata忆s physiology and phenological phenomenon.
But how ectomycorrhizal symbionts and ectomycorrhizal fungal community associated with Picea asperata respond to warming
and nitrogen deposition in this area is lack of research. To simulate the effects of warming and nitrogen deposition, we
conducted an experiment with the infrared radiator and NH4NO3 25 g N m
-2 a-1 fertilizing. And we evaluated the effects of 3鄄
year continuous night鄄time warming and nitrogen fertilization on the ectomycorrhizal colonization rate of Picea asperata
seedlings, soil ectomycorrhizal fungal biomass and the diversity of soil ectomycorrhizal fungal community. The experimental
results clearly showed that the effects of night鄄time warming on the ectomycorrhizal colonization rate were varied seasonally
in different root orders. In spring (May, 2011) night鄄time warming significantly affected the ectomycorrhizal colonization of
first鄄order roots, however, in summer ( July, 2011) and autumn (Oct, 2010) the ectomycorrhizal colonization rate of
second鄄order roots were changed significantly. Nitrogen fertilization didn忆 t dramatically affect the ectomycorrhizal
colonization rate of first鄄order and second鄄order roots except for the colonization rate of first鄄order roots in July 2011. There
were no significant effects of night鄄time warming on soil ectomycorrhizal fungal biomass and the diversity of ectomycorrhizal
fungal community. But we found that nitrogen fertilization and the interaction of the two treatments affected them
significantly: the soil ectomycorrhizal fungal biomass was decreased while the diversity of ectomycorrhizal fungal community
was increased. These results indicated that the ectomycorrhizal colonization rate of Picea asperata seedlings was sensitive to
warming, however, the soil ectomycorrhizal fungal biomass and the diversity of ectomycorrhizal fungal community was
sensitive to nitrogen fertilization. The primary effect of night鄄time warming was to increase the ectomycorrhizal colonization
rate, but there was negligible or insignificant effect on diversity of soil ectomycorrhizal fungal community. On the contrary,
nitrogen fertilization directly and significantly affected the diversity of soil ectomycorrhizal fungal community rather than the
ectomycorrhizal colonization rate of Picea asperata seedlings. The different response of different ectomycorrhizal fungus to the
global climate change and long鄄term experiments simulated natural climate change will be considered in the following
studies. The findings of our research provide the scientific basis for further studying the response mechanism of below鄄ground
of southwest subalpine coniferous forest to global climate changes in this region.
Key Words: Picea asperata; ectomycorrhizal fungi; colonization rate; community diversity
菌根(Mycorrhiza)是植物根系与土壤中菌根真菌形成的互惠共生体,大约 90%陆地植物能形成菌根[1],
宿主植物将约 20%的净初级生产力传递给菌根共生体[2]。 菌根真菌作为土壤微生物的重要成员,在生态系
统中扮演重要的角色[3]。 它们增加了宿主植物对 N、P 等营养物质的吸收能力,对病原菌的抵抗能力和对诸
如重金属、干旱等恶劣环境的耐受能力[4鄄6];同时作为生态系统中的分解者,也在一定程度上促进了生态系统
中 C、N、P 等养分循环[7]。 菌根真菌群落多样性对于维持植物多样性、生态系统的稳定及发展具有重要的作
用[8]。 外生菌根(Ectomycorrhizae,ECM)是森林生态系统的重要组成部分,温带森林中外生菌根真菌生物量
约占土壤微生物总生物量的 30%[9]。
外生菌根真菌是影响植物对全球变化响应的重要因素[10]。 随着全球气候变化的加剧,外生菌根真菌对
气候变化的响应成为了当下研究热点之一。 目前,对气候变化下菌根的研究主要集中在外生菌根共生体中的
侵染状况及外生菌根真菌群落多样性等方面,多采用增温、施氮、人为增加 CO2浓度等方式对自然界气候变化
进行实验模拟[2, 8, 11鄄12]。 然而,由于菌根共生体的复杂性、研究地点的特异性、研究手段的多样性和研究期限
的不同等原因,气候变暖、大气 N 沉降等气候变化对外生菌根及菌根真菌群落影响的研究结果并不一
致[13鄄17]。 例如,Rillig等人[18]研究发现增温对总的外生菌根侵染率无显著影响;而 Kasai等[19]研究却表明,增
温处理使白天平均气温超过 30益时,外生菌根侵染率显著下降;同时,Swaty 等[20]研究证明温度更高的煤矿
土壤中外生菌根侵染率更高。 18a温室增温研究结果发现北极优势灌丛物种矮桦(Betula nana)外生菌根真
菌多样性增加[13],但开顶式气室(Open鄄top chamber)装置增温 5—7a并没有使北极柳(Salix arctica)外生菌根
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真菌群落的群落组成、丰富度、均匀度发生显著变化[14]。 此外,全球气候变暖引起的昼夜温度变化不同,夜间
最低温增幅大于白天最高温增幅[21鄄22],已有的昼夜增温的对比研究表明,夜间增温能提高根系的干质量和根
冠比[23],显著改变土壤中菌根真菌在土壤微生物群落中所占比例[24]。 但是,有关夜间增温对植物外生菌根
侵染率及菌根真菌多样性产生的影响研究并不多见。 有关氮沉降的模拟实验也因施用氮肥的浓度和时间的
不同而对外生菌根产生不同的影响,例如,外生菌根侵染率不变[1, 15]或显著降低[25],外生菌根真菌物种数量
不变[18]或物种丰富度显著降低[16]等。 总之,气候变化对不同生态系统及不同植物物种外生菌根侵染率及菌
根真菌群落多样性的影响研究尽管已有很多,但并没有得出较一致的结论,而未来很多区域气候变暖必将伴
随着严重氮沉降,二者联合作用对外生菌根的影响则会更加复杂,很难从已有的单独增温或单独施氮的研究
结果中推测出来。
西南亚高山针叶林,主要分布于对全球气候变化十分敏感的青藏高原东南部的川西、滇西北和藏东南一
带[26],是我国长江上游的的重要“生态屏障(Ecological barrier)冶,对水土保持、水源涵养起着巨大的作
用[27鄄28]。 云杉(Picea asperata)作为川西亚高山针叶林优势树种[29],是典型的外生菌根共生森林树种[30]。 云
杉的生长、发育和对气候变化的响应与其共生的外生菌根真菌密切相关。 研究对气候变化敏感的川西亚高山
针叶林中外生菌根侵染率及菌根真菌多样性对气候变暖、氮沉降的响应具有十分重要的意义。 本研究基于前
期所作研究[4, 31鄄33]通过红外线辐射加热器( infrared radiators)夜间增温和人工施氮的方法模拟气候变暖和氮
沉降,研究夜间增温、施氮及两者的联合效应对云杉外生菌根侵染率及土壤中外生菌根真菌多样性的影响,旨
在为进一步研究全球变化背景下外生菌根真菌对川西亚高山森林中植物群落的发展和演替提供基础资料,以
预测全球变化背景下云杉的进化和适应及亚高山森林生态系统的响应,对亚高山森林生态系统可持续发展具
有重要价值。
1摇 材料与方法
1.1摇 研究区域概况
研究区域位于四川省阿坝州中国科学院成都生物研究所茂县山地生态系统定位研究站,海拔 1820 m,地
理位置为 31毅41忆N,103毅53忆E,地处青藏高原东缘和横断山系北段岷江上游地区生态环境十分脆弱的高山峡谷
地带。 属暖温带亚高山季风气候,冬季寒冷干燥、夏季湿润多雨。 年平均温度 8.9益,年积温 2690.8益,年降雨
量 919.5 mm,年蒸发量 795.8 mm,年均日照时数为 1139.8 h[32鄄34]。 该区土壤 pH 5.8—6.0,主要是淋溶褐土和
棕壤土(0—30 cm)。 地形相对高差最高达 3000 m以上,植被主要为人工林和次生灌丛,海拔从低到高依次为
耐旱次生灌丛、针阔混交林和次生灌丛、亚高山针叶林和残留的常绿阔叶灌丛、高山灌丛草甸。
1.2摇 试验材料与设计
供试植物为株高、基径和生长状况一致的 4 年生云杉幼苗,由米亚罗 301 林场苗圃提供,并于 2008 年 3
月移栽入试验样地。 供试土壤为茂县生态站附近的针叶林表层土,过筛混匀后用客土法替换试验样地上层
50 cm原位土壤。 供试土壤基本理化性质为 pH 5.55;全氮 4.54 g / kg;有机碳 78.04 g / kg;C / N 17.19;容重 0.89
g / cm3 [31, 33]。
试验采用裂区设计[35],在增温中嵌套施氮处理。 设 5对 2 m伊2 m的试验小区。 每对小区中,一个为增温
小区,另一个为对照小区。 再将每个小区分为 2 个 1 m伊2 m 的副区,一个进行施肥,另一个为对照。 增温小
区中于采用 165 cm伊15 cm的红外线辐射加热器(Kalglo Electronics Inc., Bethlehem, PA, USA)悬挂于距地面
1.5 m处,从当日 19:00到次日 07:00进行夜间 12 h 连续增温。 为模拟红外线辐射加热器的遮阴影响,在对
照小区中采用与红外线辐射加热器同等大小的虚拟加热器悬挂于距地面 1.5 m 处。 施氮处理则根据已有的
相似研究[4, 13鄄14],每周用手提式喷壶向每个施氮副区土壤表面均匀喷洒 10L 溶解有 2.8 g NH4NO3的溶液(即
25 g N m-2 a-1)。 同时,对照副区内喷施等量的水。 为了避免氮肥污染,施氮副区与对照副区间用隔水塑料挡
板和砖墙间隔。 增温和施氮试验始于 2008年 3月,具体参照陈智等[32, 34]。 试验设计 4 个处理,1)W0N0:不
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增温+不施氮;2)W0N1:不增温+施氮;3)W1N0:增温+不施氮;4)W1N1:增温+施氮。 试验中,以保持各处理
小区内条件基本一致,定期清除样地内新生杂草,并不定期的对增温小区进行水分供给。
实验通过温度自动监测装置对各小区内 2010年 9月—2011年 8月地面 20cm处空气温度、空气湿度及 5
cm深土壤温度进行监测,具体实验方法参照前期研究[4, 32鄄34];2008 年 5 月—12 月表层 0—10cm 土壤含水量
数据的获得参见 Zhao 等[4, 33]。 增温条件下地面 20cm 处平均气温和 5cm 深土壤平均温度比对照提高了
2郾 13益和 2.61益,增温小区内空气相对湿度比对照小区显著(P<0.01)降低了 13.36%,增温对土壤含水量无显
著影响(图 1)。
图 1摇 5 cm土壤温度、空气温度、空气湿度和土壤含水量月动态变化
Fig.1摇 Monthly dynamic changes of soil temperature at 5 cm depth, air temperature, air humidity and soil water content
1.3摇 试验方法
1.3.1摇 根样采集
2010年 10月 15日、2011年 5月 15日、7月 15日分别在 4个不同处理的副区中随机选择 3株云杉,小心
挖取其根系,并挑选出含有完整 5级根序的根样。 自来水漂洗,去除根系粘附的土壤后,将根样放入装有 FAA
固定液的塑料瓶中,贴上标签,带回实验室保存在 4益冰箱中,并于 1周内进行外生菌根侵染率测定。
1.3.2摇 土样采集
2011年 5月 15日分别在 4个不同处理的副区中进行“S冶型随机取样,去除表面植被后用土钻(高 15 cm,
内径 7 cm)钻取云杉根系周围 0—15 cm表层土,每个副区中 4次重复取样混合为 1个土样,过 2 mm筛,人工
去除可见的植物细根后装入密封袋中,保存在装有冰袋的冰盒里带回实验室。 将土样分成两份,1 份保存于
4益冰箱中用于土壤含水量测定和土壤微生物总 DNA提取;1 份-80益冰箱中冷冻保存,1 周内进行土壤微生
物磷脂脂肪酸(PLFAs)的提取分析。
1.3.3摇 侵染率测定
外生菌根真菌侵染率的测定采用统计计算法[36]。 从 FAA 固定液中随机取出根样,用超纯水漂洗干净。
根据 Pregitzer[37]的根序分级法,剪取根样尖端包含完整 2级根序的 1 cm长根段,每个处理随机选取 15段,在
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体式显微镜下观察、统计每 1 cm根段上 1级根、2级根的总数和形成外生菌根的 1、2级根数量,计算每一级根
的菌根侵染率。 菌根侵染率=(各级根形成菌根数量 /各级根镜检总数)伊100%[20, 36]。
1.3.4摇 外生菌根真菌生物量测定
PLFA的提取和测定参考 Frostegard[38]方法。 8g鲜土经提取、层析、甲酯化后,溶于正己烷的磷酯用 N2吹
干,-20益保存。 样品用 100 滋L 2.5 mg / 100 ml 甲酯化 C 19:0 溶液溶解,并于 Agilent 6890 气相色谱仪进行
PLFAs 的鉴定和量化。 其中色谱柱为 Agilent 19091B鄄102E(25 m伊 0.33 滋m伊 0.20mm),载气为 H2。 进样量为
2 滋L,分流比 100颐1。 进样口温度 250益,检测器温度 300益。 二阶升温程序如下:起始温度 170益,以 5益 / min
升至 260益,再以 40益 / min 升至 310益。 气相色谱全过程由MIDI软件(MIDI Microbial ID, Inc., Newark, DE,
USA)自动控制,其中 Sherlock 6.0 (MIDI Inc.)用于磷脂脂肪酸鉴定。 用峰面积和内标曲线法定量测定磷脂脂
肪酸,PLFAs含量用 nmol / g表示。 其中,土壤中外生菌根真菌生物量用其特异性 PLFA 18:2棕6,9 的含量来
表示[8鄄9, 27]。
1.3.5摇 土壤外生菌根真菌群落结构分析
土壤外生菌根真菌群落结构分析采用 PCR鄄DGGE 法。 用试剂盒(MOBIO Ultraclean Soil DNA Isolation
Kit:12088鄄50)按说明提取土样中的总 DNA。 提取的 DNA 采用菌根真菌特异性引物对 ITS1F(5忆鄄CTT GGT
CAT TTA GAG GAA GTA A鄄3忆)和 ITS4B(5忆鄄CAG GAG ACT TGT ACA CGG TCC AG鄄3忆) [39]进行 PCR扩增,扩
增产物片段长约 700bp。 PCR反应体系(50滋L)为:10伊 buffer(不含 Mg2+)5滋L,25 mmol / L MgCl2 5滋L, dNTP
Mix(各 2 mmol / L) 5滋L, 10 滋mol / L引物各 1滋L,DNA模板 1滋L,Taq酶 0.5 滋L,dd H2O 31.5 滋L。 运行的 PCR
程序为:94益预变性 3 min,94益变性 1 min,50益退火 1 min,72益延伸 2 min,共计 35 个循环,72益延伸 10
min。 PCR产物在基因突变检测仪(Bio鄄Rad, Dcode, USA)中进行变性梯度凝胶电泳。 将 PCR产物与上样缓
冲液 5颐1混合后的样品 30滋L 加入变性梯度为 20%—50% 、浓度为 8%的聚丙烯酰胺凝胶点样孔中,120V 恒
压、60益恒温电泳 12h。 电泳完成后,将凝胶浸泡于 EB 中染色 30min。 染色的凝胶用凝胶成像分析仪(Bio鄄
Rad, ChemiDoc XRS, USA)进行分析,并观察每个样品的电泳条带进行拍照。
1.4摇 数据分析
采用 SPSS 17.0对所有数据进行统计分析。 选用两因素方差分析(Two鄄way ANOVA)检验增温、施氮及其
交互作用对外生菌根真菌侵染率、生物量的影响。 不同处理(W0N0、W0N1、W1N0、W1N1)间所测指标多重比
较采用 Duncan法进行检验, 1、2级根侵染率的差异显著性采用 t检验。 用 Quantity One 4.6.2 软件分析外生
菌根真菌的 DGGE 图谱,并使用 Microsoft Excel 03 插件 Biotools 进行多样性分析。 所有图均采用 Microsoft
Excel绘制。
2摇 结果与分析
2.1摇 侵染率
夜间增温对云杉 2011年 5月 1级根、2010年 10月和 2011 年 7 月云杉 2 级根外生菌根侵染率产生显著
影响(P<0.05),与对照相比,增温处理分别使 2010 年 10 月和 2011 年 5 月云杉 1 级根外生菌根侵染率增加
26.83%和 18.64%,2级根 3个月份外生菌根侵染率分别增加 1.98 倍、1.38 倍和 1.26 倍。 但是在温度最高的
2011年 7月,单独增温使云杉 1级根外生菌根侵染率降低了 9.06%。 2010 年 10 月和 2011 年 5 月,施氮对云
杉 1、2级根外生菌根侵染率均无显著影响(P>0.05)。 2011 年 7 月,施氮对云杉 1 级根外生菌根侵染率影响
显著(P<0.01),外生菌根侵染率增加 15.69%。 在增温与施氮的联合处理下,云杉 1、2级根在不同季节的侵染
率均增加,但仅在 2010年 10月 1级根侵染率出现显著的交互作用(P<0.01)(表 1)。
云杉外生菌根侵染率具有显著(P<0.001)的季节变化。 总体上(图 2),不同根级侵染率的季节变化不
同,但在生长季中期(2011 年 7 月)均达到了最大值。 2010 年 10 月 1 级根的侵染率最低,2011 年 7 月最高;
2011 年 7月 2级根的侵染率最大,最小值却出现在 2011年 5月。 如图 2所示,除 2010年 10月,1级根的侵染
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率均显著大于 2级根(P<0.05),但在不同时间差异程度不同。 此外,不同处理对 1 级根侵染率的季节变化趋
势影响并不相同,夜间增温及增温与施氮联合处理使生长季初期(2011 年 5 月)1 级根侵染率增幅明显但是
生长季中期增幅减弱甚至有降低趋势,而施氮处理对 1级根侵染率的季节动态并没有显著影响。
表 1摇 增温与施氮对外生菌根真菌侵染的影响(平均值依标准误,n= 15)
Table 1摇 Effects of warming and nitrogen fertilization on ectomycorrhizal fungal infection (means 依 SE, n= 15)
根级
Root orders
时间
Time
处理 Treatments
W0N0 W1N0 W0N1 W1N1 W N W伊N
1级根 2010鄄10 28.54依8.29 b 55.37依6.70 a 42.44依3.46 ab 32.61依5.76 b NS NS **
First鄄order root 2011鄄05 61.12依7.61 b 79.76依4.61 ab 66.82依8.47 ab 83.14依3.73 a * NS NS
2011鄄07 82.87依7.62 ab 73.81依9.75 b 98.56依0.99 a 94.29依5.71 a NS ** NS
2级根 2010鄄10 9.61依3.76 b 28.61依4.28 a 11.78依3.51 b 21.64依6.89 ab ** NS NS
Second鄄order root 2011鄄05 2.81依1.92 a 6.70依3.05 a 7.65依3.00 a 6.00依3.32 a NS NS NS
2011鄄07 16.62依5.23 b 37.60依11.33 ab 32.57依10.31 ab 58.91依9.56 a * NS NS
摇 摇 同一行中不同字母表示处理间差异显著(P< 0.05);最后三列表示两因素的显著影响及其交互作用;W0N0,不增温+不施氮;W1N0: 增温+
不施氮;W0N1: 不增温+施氮;W1N1: 增温+施氮;W: 增温效应;N: 施氮效应;W伊N: 增温与施氮交互效应;NS: 没有显著差异;*P< 0.05;
**P< 0.01
图 2摇 侵染率的季节性变化及根级差异
Fig.2摇 The seasonal changes of colonization and the differences in colonization between first鄄order root and second鄄order root
图中不同字母表示季节差异显著(P< 0.05); NS、*、**、***表示根级间不同程度的差异:NS,差异不显著;*P< 0.05;**P< 0.01;*
**P< 0.001
2.2摇 外生菌根真菌生物量
用土壤中特异性磷脂脂肪酸 18:2棕6,9 的含量计算外生菌根真菌的生物量。 单独夜间增温对土壤中外
生菌根真菌生物量无显著影响,施氮显著降低了外生菌根真菌生物量。 增温和施氮表现出显著的交互作用
(P<0.05),使外生菌根真菌生物量降低,如图 3所示,但是在增温条件下,不施氮小区外生菌根真菌生物量是
施氮小区的的 2.07倍。
2.3摇 外生菌根真菌群落多样性
DGGE电泳图谱和泳道 /条带识别图(图 4)表明,不同处理样品的带谱差异比较明显。 对照处理和单独
增温处理中条带较少,分别为 14和 15条;而单独施氮处理和增温施氮联合处理条带分别为 19 和 20 条。 表
明对照处理和单独增温处理中外生菌根真菌物种数量较少。 4 个样品中具有相同条带(25 和 30),但条带强
度不一样,说明 4个样品中存在相似的真菌类型,但数量不同。
2792 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇
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摇 图 3摇 增温和施氮对土壤中外生菌根真菌生物量(18:2棕6,9)的
影响
Fig.3摇 Effects of warming and nitrogen fertilization on
ectomycorrhizal fungal biomass in the soil
图中不同字母表示处理间差异显著 ( P < 0. 05); *P < 0. 05;
***P< 0.001
非加权成对算术平均法聚类分析的结果如图 5。
夜间增温、施氮和增温与施氮联合处理聚为一大族群,3
个处理与对照之间具有差异。 夜间增温和增温与施氮
联合处理样品中外生菌根真菌菌群结构相似性最高,但
仅达到 59%。
多样性指数计算结果(表 2)显示,施氮及增温施氮
联合处理均增加了土壤中外生菌根真菌群落多样性。
另一方面,单独施氮处理样品中外生菌根真菌群落均匀
度指数最高为 0.976,Simpson忆s Dominance 指数最小为
0.057;对照处理中 Simpson忆 s Dominance 指数最大为
0郾 091,但均匀度指数 ( 0. 951) 高于单独增温处理
(0郾 945)。 说明单独施氮处理样品中外生菌根真菌群
落的复杂程度高,物种最多但分布最均匀,且优势物种
的主导作用最小,而对照处理中外生菌根真菌群落结构
摇 图 4摇 土壤中外生菌根真菌群落 DGGE 电泳图谱(A)和泳道 /条
带识别图(B)
Fig. 4 摇 DGGE fingerprint of soil ectomycorrhizal fungal
community (A) and Lane compare (B)
相对较简单。
3摇 讨论
3.1摇 夜间增温和施氮对云杉外生菌根真菌侵染率的
影响
Pregitzer[37]提出根系分级理论,并认为只有 1—3
级根受真菌侵染,郭大立等[40]对 23 个温带树种的研究
也发现外生菌根真菌对 4 级及以上根系侵染率为 0。
本研究通过观察完整的 5级根系侵染率发现:4 种处理
中 1、2级根均有外生菌根侵染,而仅在夜间增温、增温
与施氮联合处理中观察到极少数 3级根受侵染。 因此,
本研究仅针对 1、2 级根进行侵染率的分析。 云杉幼苗
外生菌根真菌侵染率具有显著的根级差异,1 级根侵染
率显著高于 2级根,这与不同根级的结构特征相关。 1
级根具有完整的初生皮层结构,2 级根同时发育有初生
和次生结构[40]。 而外生菌根形成的特征之一是真菌菌
丝侵入根初生皮层细胞间隙内形成“哈蒂氏网(Harting
net)冶 [41],因此 1 级根侵染率高于 2 级根。 此外,外生
菌根侵染率呈现季节性差异,1、2 级根夏季侵染率最
高。 因为与植物共生的外生菌根真菌的生长依赖于根
系的生理代谢活动,而根系随着温度的变化呈现季节性
生长[42]。 适宜的温度对外生菌根真菌的生长极为重
要[41],夏季气温适宜,植物生长旺盛,对水分和养分的需求最大,根系生长最快,较多的光合产物分配给根系,
供给外生菌根真菌的碳水化合物较春秋季多,外生菌根真菌侵染率最高[20]。
增温对外生菌根真菌侵染率的影响取决于外生菌根真菌和植物对特定温度的适应性[10]。 本研究发现,
除 2011年 7月 1级根外,夜间增温使外生菌根真菌侵染率增加。 这与 Swaty 等[14]的研究结果一致:温度高的
3792摇 9期 摇 摇 摇 李月蛟摇 等:连续三年夜间增温和施氮对云杉外生菌根及菌根真菌多样性的影响 摇
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表 2摇 土壤中外生菌根真菌群落多样性指数
Table 2 摇 The diversity indices of soil ectomycorrhizal fungal community
处理
Treatments
Shannon鄄Wiener指数
Shannon鄄Wiener index
Simpson多样性
Simpson忆s Diversity
(1 / Dominance)
Simpson优势度
Simpson忆s Dominance Margalef 指数Margalef忆s index
均匀度
Evenness
丰富度
Richness
W0N0 2.510 10.954 0.091 1.593 0.951 14
W1N0 2.559 11.267 0.089 1.702 0.945 15
W0N1 2.923 17.420 0.057 2.127 0.976 20
W1N1 2.862 16.001 0.062 2.167 0.972 19
图 5摇 土壤中外生菌根真菌群落 UPMGA聚类分析图
摇 Fig.5摇 Cluster analysis of soil ectomycorrhizal fungal community
by the unweighted pairwise grouping method with mathematical
averages (UPMGA)
煤矿土壤样地中石松外生菌根真菌的侵染率显著高于
温度较低的沙质土壤。 已有研究认为侵染率的增加和
植物地下部分 C分配量的增加相关[12, 43]。 Rillig 等[44]
用红外线加热装置进行增温的研究也发现,增温小区内
丛枝菌根真菌的侵染率显著增加,并认为增温使植物光
合速率增加,更多的光合产物分配给菌根真菌,因此促
使菌根真菌侵染率增加。 本样地的前期研究结果显示,
夜间增温使云杉细根生物量增加[7];此外,还发现夜间
增温使云杉中 N 含量降低[45],根、茎中的 N 含量下降
显著,云杉趋向于将更多的 C 分配给与其共生的外生
菌根真菌以获得更多生长所需的 N,因此外生菌根侵染
率增加[46]。 然而,2011年 7 月夜间增温对 1 级根侵染
率没有显著影响。 对 5cm深土壤温度进一步分析发现,2011 年 7 月增温样地中温度为 20.27益,而对照样地
中也达到了 17.90益,均比 2010年 10月(15.02益)和 2011年 5月(16.13益)增温样地中温度高。 很有可能是
因为 7月对照样地中土壤温度已达到了外生菌根真菌形成的最适温度(如点柄乳牛肝菌(Suillus granulatus)
在土壤中形成菌根的最适温度为 16益 [47] ),夜间增温所引起的增温幅度已经不能引起云杉外生菌根侵染率
的变化,因此夜间增温对侵染率影响不显著。
此外,两因素方差分析结果表明不同季节夜间增温对侵染率的具体影响具有根级差异:春季(2011 年 5
月)夜间增温对云杉 1级根侵染率影响显著,夏季(2011 年 7 月)和秋季(2010 年 10 月)夜间增温却对云杉 2
级根侵染率产生显著和极显著的影响。 产生这种变化的原因与根系生物量的季节性变化[48鄄49]及 1 级根的生
长发育优先于 2级根相关[50]。 增温条件下,春季细根生物量增加量与夏季相比显著提高[48鄄49],春季 1 级根侵
染率显著增加。 随着根系生长规律的变化,春季 1级根在夏、秋季逐渐发育为 2级根。 因此,增温条件下 2 级
根的侵染率在夏季和秋季显著地增加。
氮是外生菌根真菌和宿主植物生长不可或缺的营养元素之一。 氮的含量,特别是土壤中有效氮的含量对
外生菌根的形成起重要作用[41]。 孙玥等[25]通过对落叶松人工林样地连续 3a施用 10 g N m-2 a-1硝酸铵的实
验发现,落叶松 1级根侵染率显著降低,并认为土壤 N有效性的增加降低了落叶松根系对外生菌根真菌的依
赖性,根系供应给菌根真菌的碳水化合物减少,因此侵染率降低。 与上述研究结果不同,本实验施用 NH4NO3
25 g N m-2 a-1使云杉幼苗侵染率有略微增加的趋势,但是经方差检验并没有显著影响。 与本研究类似,Van
Dijk等[1]在 7个月施用 4.8 g N m-2 a-1后不同松树树种的侵染率没有显著变化。 连续 2a 硫酸铵施用量为
50—60 g N m-2 a-1的实验也表明,挪威云杉菌根侵染率无显著变化,并发现一些外生菌根真菌物种子实体产
量增加[15]。 K覽r佴n等推测其原因可能是:短期施氮改变了土壤中外生菌根真菌群落结构,改变了土壤中不同
外生菌根真菌物种的种间竞争力以及对根系的侵染能力,但土壤中群落结构的显著变化尚未引起侵染率的显
4792 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇
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著变化[15]。
3.2摇 夜间增温、施氮对土壤中外生菌根真菌群落的影响
磷脂脂肪酸和 PCR鄄DGGE是常用的土壤微生物群落分析方法。 磷脂脂肪酸法通常用于定量分析土壤微
生物群落的组成[51],并且大量研究表明[8鄄9, 27],土壤中特异性磷脂脂肪酸 18:2棕6,9 的含量可作为土壤中外
生菌根真菌生物量的指标;而 PCR鄄DGGE 常用于分析土壤微生物群落组成差异性[52]。 本文结合两种方法,
对云杉根围土壤中外生菌根真菌群落进行了研究。 研究结果显示,夜间增温对土壤中外生菌根真菌生物量、
多样性、均匀度和优势度均无显著影响;这与 Fujimura 等人[14]的研究结果相似。 但是,Deslippe 等[13]的增温
实验却发现北极矮桦林下外生菌根真菌多样性显著增加。 推测产生这种差异的原因可能是:(1)增温的时间
及方式不同:OTC 5—7a 增温及本研究中 3 年红外辐射夜间增温对多样性没有显著变化,而温室增温 18a 多
样性显著增加;(2)研究的宿主植物不同,不同植物对增温的响应不同[14]:增温使北极柳地下部分 C 分配量
增加,同样本样地中夜间增温使云杉更多的生物量分配给细根[7],二者均没有引起外生菌根多样性的显著变
化;增温降低了北极矮桦地下部分的 C 分配量,但改变了外生菌根真菌群落的组成及多样性,增强了外生菌
根真菌群落对土壤有机质的分解。 此外,聚类分析结果显示夜间增温使土壤中外生菌根真菌群落与对照相似
性低,说明外生菌根真菌群落中物种组成发生了一定的变化,只是尚未引起多样性的显著变化。
大量研究表明[17, 53鄄54],施氮降低了土壤中真菌生物量。 本研究得到相同的结果,施氮、夜间增温与施氮
的联合处理使外生菌根真菌生物量降低,且达到极显著水平。 同样,Nilsson和 Wallander[8]发现施氮使挪威云
杉林下土壤中外生菌根真菌菌丝生物量降低。 外生菌根真菌生物量的降低被认为是外生菌根真菌对环境中
高无机 N含量的适应[55]。 对 DGGE图谱分析结果显示,施氮、夜间增温与施氮的联合处理使土壤中外生菌根
真菌群落的物种丰富度、多样性和均匀度大于对照,而优势度小于对照,这可能是施氮减少了可形成丰富菌丝
的外生菌根真菌物种的数量,但却使具有短菌丝或不具外延菌丝的外生菌根真菌物种丰富度增加[8],这使土
壤中总的菌根真菌生物量降低而群落多样性却增高。 已有研究也认为[8,16,55],施氮限制了原土壤外生菌根真
菌群落中占优势的惧 N外生菌根真菌的生存,提高了亚优势种群喜 N外生菌根真菌的生存竞争力,亚优势种
群物种数目增加从而导致多样性增加。 因此,施氮主要改变土壤中外生菌根真菌群落结构,改变了群落的优
势格局。 但是,施氮对土壤中外生菌根真菌群落结构影响的机理尚需在物种水平上进行深入研究。
总之,连续 3a夜间增温和施氮对云杉外生菌根及菌根真菌群落多样性产生不同程度的影响:比较而言,
夜间增温主要增加外生菌根的侵染率,而对土壤中外生菌根真菌群落多样性影响不明显;施氮、增温与施氮联
合处理则直接对土壤中外生菌根真菌生物量及群落多样性产生较大的影响。 本实验仅在群落整体水平上进
行了 3a夜间增温和施氮对云杉外生菌根及菌根真菌多样性影响的研究,尚需在物种水平上进行外生菌根真
菌对长期夜间增温和施氮响应的研究,以深入探究以外生菌根为核心的地下生态过程对全球变化的响应
机制。
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