全 文 ：!"#$柠檬酸盐双水相体系纯化!$淀粉酶及模型构建
郅文波，顾 铭，宋江楠，欧阳藩!
（中国科学院 过程工程研究所 生化工程国家重点实验室，北京 !"""#"）
摘 要：探索了采用 $%&’柠檬酸盐双水相体系纯化!’淀粉酶的可行性和工艺条件，实验考察了$%&分子量，结线
长度、()、上清加入量和 *+,-浓度对!’淀粉酶的分配的不同影响。双水相分离体系复杂，影响因素多，为进行分
析、预测和优化，采用了响应面方法，以 $%& . ./"浓度、柠檬酸盐浓度和 *+,-浓度为自变量进行了!’淀粉酶分配系 数、总蛋白分配系数、纯化因子和!’淀粉酶收率的优化，确定了特定的系统组成区域，通过实验验证了该区域内纯 化因子大于 0，收率约 1"2，并且具有较低的系统粘度。 关键词：双水相体系；!’淀粉酶；纯化；优化 中图分类号：34#!/ 文献标识码：5 文章编号：!670 8 .67#（0""9）"! 8 ""97 8 "6 !%&’(’)*+’,- *-. /,.01’-2 ,(!’*/31*40 5’+6 *7%0,%4 +5,’86*40 434+0/4 :); <=>’?@，&A BC>D，EF*& GC+>D’>+>，FAH5*& I+> （EJ+J= K=L M+?@N+J@NL @O PC@QR=SCQ+- %>DC>==NC>D，;>TJCJUJ= @O$N@Q=TT %>DC>==NC>D，,5E，P=CVC>D !"""#"，,RC>+）
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;03 5,&.4：!’+SL-+T=；+XU=@UT JW@’(R+T= TLTJ=ST；@(JCSC]+JC@>；(UNCOCQ+JC@>
双水相体系已经被广泛的应用于生物大分子，
如蛋白质、核酸和抗生素等的提取和纯化过程
中［!，0］。与其它常用的纯化方法相比，双水相体系具
有很多优势［.］：如含水量高（7"2 _ #"2，质量分
数），分辨率高，产物回收率高，易放大，原料便宜而
且可以循环使用等。但是生物大分子在双水相体系
中分配的确切机制尚还不清楚。
!’淀粉酶（!，9’!’[’D-UQ+> D-UQ+>@RLYN@-+T=T；%,
.Z0Z!Z!）是一种重要的工业用酶，它被广泛应用于
酿酒、纺织、洗涤剂、淀粉加工等工业领域［9］。来源
于枯草芽孢杆菌的!’淀粉酶具有许多优点，如热稳
定性好、活性高等。该酶的分子量约为 9# ‘[+，等电
点约为 /，酶活的最适 ()范围为 /Z. _ 6Z9。
!’淀粉酶在双水相体系中的分配［/］以及分离纯
化［6，7］已经被广泛的研究过，双水相体系可以有效地
用于!’淀粉酶的纯化和精制。所采用的双水相体系
! 收稿日期：0""9’"!’"9
作者简介：郅文波（!176’），男，博士，研究方向：生化工程专业。
联系人：欧阳藩，%’S+C-：@UL+>DO+>0""0aL+R@@b Q@S，3=-："7//’066!6!/1
第 0卷第 !期
0""9年 0月
生 物 加 工 过 程
,RC>=T= G@UN>+- @O PC@(N@Q=TT %>DC>==NC>D
I=?b 0""9
·97·
万方数据
有 !"#$高聚物体系［%］，但价格昂贵；常用的 !"#$盐
双水相体系具有两相差异大、易分相、价格低廉等优
点，但 !"#$硫酸铵体系［&］’(调整不方便，!"#$磷酸
盐体系［)］会造成对环境的污染。这些体系虽然可以
有效地用于!$淀粉酶的纯化，但以上种种缺点，其大 规模应用受到限制［%］。 柠檬酸盐属于生物可降解的原料，具有低环境 毒性的特点［*］，同时在双水相操作中也可以方便调 整体系 ’(值，改善纯化效果。因此本文研究了利 用 !"#$柠檬酸盐双水相体系从发酵液上清中纯化
!$淀粉酶，并用响应面方法对纯化过程进行了建模 和分析。 ! 材料和方法 +,+ !$淀粉酶制备
+,+,+ 菌 株
重组枯草芽孢杆菌 -.$+，重组质粒 ’/-++0 含 有来自 !"#$%%&’ "()%*%$+&,-"#$,.’ 的!$淀粉酶基因和 卡那霉素抗性标记。于 1 %0 2甘油保存。 +,+,3 发酵培养基 %0 456酵母粉，7,** 456 893 (!:;·+3(3 :，; 456 <(3!:;，&,3; 456 <3 (!:;·%(3 :，+,+;& 456 8(; =>， + 456 ?4@:;·A(3 :，0,0&3& 456 =9=>3·3(3 :，+ B656 微量金属溶液，用前加入 +;3,& B456卡那霉素。微 量金属溶液（+ 000 倍浓缩液）含有：?C@:;·;(3 :， A,& 456；=D=>3·7(3 :，; 456；89?D:;·3(3 :，3 456； EC@:;·A(3:，3 456；.>=>%·7(3:，+ 456；=F=>3·3(3 :， +,+3& 456；(% -:;，0,& 456 9CG (=>（%AH，/ 5 0）， )7 B656。 +,+,% 摇瓶试验条件 + 6摇瓶，装液量 &0 B6，3&0 I5BJC摇床培养，培 养温度 %A 2。 +,+,; 发酵液上清收集 ; 2 * 000 4离心 +& BJC，收集发酵液上清。 +,3 双水相体系相图绘制 根据 .>KLIMNNDC［%］的方法绘制相图：将已知浓度 的柠檬酸溶液逐滴加入 !"#的浓溶液中，直到出现 浑浊。记下此时的体系组成并向 !"#溶液中加入 + 4水，摇匀待溶液变清后重复上述操作。将所记录 的体系组成以 !"#浓度为纵坐标，柠檬酸盐浓度为 横坐标作图即得到双结点曲线。 +,% 双水相体系配制 制备 !"# + 000的储液（质量分数为 )0H）并于 ; 2 保存。!"# ;00 直接以液体形式使用。!"# % %&0 和 !"# ) 000直接以固体形式使用。以特定比例的柠 檬酸和柠檬酸三钠混合得到具有所需 ’(的混合柠檬 酸盐。室温下在 +& B6尖底带盖离心管中将适当比 例的柠檬酸盐和 !"#混合，加入 % B6发酵液上清和 300"6 3,& BD>56的 =9=>3溶液，按需要加入89=>，用去 离子水调节总重量为 +0 4。摇动试管至所有固体物 溶解，于旋涡混合器上振荡 + BJC。然后在 )00 4下水 平离心 % BJC以加速系统分相。 +,; 响应面设计和分析 响应面方法的设计，建模和分析通过 @.@软件 （O),0）进行。 +,& 分霄方法 +,&,+ !$淀粉酶酶活测定
按照 #-)3A&$)A国家标准进行。在 ’( 7,0、70 2， 每 P酶促液化 + 4可溶性淀粉的!$淀粉酶量为 +个
酶活单位。
+,&,3 总蛋白浓度测定
采用 -I9GQDIG 法测定总蛋白浓度［+0］。为消除
!"#和柠檬酸盐的干扰，以相同体系组成但不含任
何蛋白的样品作为空白。
" 结果与讨论
3,+ 成相盐对!$淀粉酶稳定性的影响 来源于枯草芽孢杆菌的!$淀粉酶的酶活和稳定
性依赖于 =93 R的存在［;］。但是，双水相体系中 =93 R
的稳定存在会受到常用成相盐的干扰，如磷酸盐与
=93 R形成沉淀而柠檬酸盐则螯合 =93 R。因此在双
水相操作过程如何有效地保持!$淀粉酶的活性。要 进行实验研究。试验在室温的柠檬酸盐体系中加入 不同浓度 =9=>3，考察其对!$淀粉酶活性维持的影
响，结果如图 + 所示。成相盐的质量分数设为
30H，在柠檬酸盐体系中，不加入 =9=>3!$淀粉酶迅 速失活。随着加入 =9=>3浓度的增加，!$淀粉酶失活
速率下降。当加入 =9=>3至终质量分数为 0,&7H时，
!$淀粉酶的失活速率远低于在磷酸盐体系中的失活 速率，经过 7,3 P，!$淀粉酶仍保留有 )0H活性；而在
磷酸盐体系中该时间仅为 +,) P，且由于与 =93 R形成
沉淀，无法采用此方法维持!$淀粉酶的活性，因此选 择柠檬酸盐体系进行研究。 ·;)· 生物加工过程 第 3卷第 +期 万方数据 —!—!"#（质量分数，下同）磷酸盐；—"—!"# 柠檬酸 盐；—#—!"#柠檬酸盐$ "%&&#’(’)!；—$—!"#柠檬酸盐$ "%!!#’(’)!；—%— !"#柠檬酸盐 $"%*+#’(’)! 图 & 成相盐种类和 ’(’)!加入量对!,淀粉酶酶活的影响 -./%& 011234 51 67(82,159:.;/ 8()4 4<62 (;= ’(’)! 35;32;49(4.5; 5; 472 84(>.).4< 51!,(:<)(82 —&—?0@ A""；—"—?0@ & """；—#—?0@ B B*"； —$—?0@ C """
图 ! 不同分子量的 ?0@,柠檬酸盐
双水相体系的相图（6D E +%"）
-./%! ?7(82 =.(/9(:8 159 ?0@,3.49(42 8<842:8 F.47 =.11292;4
?0@ :5)23G)(9 F2./74 (4 6D +%"
!%! 聚合物分子量和结线长度对!,淀粉酶分配的
影响
试验在室温和 6D E +%"的条件下进行，由于柠
檬酸盐中柠檬酸钠和柠檬酸的比例随着 6D的改变
而发生变化，因此有必要确定在 6D E +%"条件下不
同分子量的 ?0@,柠檬酸盐双水相体系的相图。结
果如图 !所示。图中的 A条双结点曲线对应于 A种
?0@分子量。在曲线右上方，双水相体系分相；在曲
线左下方，体系不分相。图中线段 HI为 ?0@ A"",
柠檬酸盐双水相体系的一条结线的示意图，H、I两
点坐标分别对应于双水相体系上下相组成。?0@,
柠檬酸盐体系的双结点曲线随着 ?0@分子量的增
加变得更加不对称而且靠近原点。同时由于两相间
的差异逐渐增大，分相所需的 ?0@和柠檬酸盐的浓
度也随之降低。
对于图 ! 中 A 种不同分子量 ?0@,柠檬酸盐双
水相体系，选择了 B种浓度，即对应 B条长度不等结
线，进行!,淀粉酶分配和纯化的试验，结果如表 &所
示。相比为上相和下相体积之比，!(和 ! 4分别是!,
淀粉酶和总蛋白的分配系数，即目标蛋白上相浓度
和下相浓度的比值，此时，收率为上相中目标蛋白的
量与加入总目标蛋白量的质量分数。目标蛋白（!,
淀粉酶）收率和总蛋白收率的比值即代表纯化因子。
! 4和 !(均随 ?0@分子量的增加而减少，?0@分
子量的增加，相同浓度的 ?0@具有更少的羟基，因
而导致 ?0@富集的上相的疏水性增加。但!,淀粉
酶的分配系数比总蛋白变化更大，因而在 ?0@
& """,柠檬酸盐体系中可以获得一定的选择性。
表 & ?0@分子量和结线长度对!,淀粉酶和总蛋白分配的影响
J(>)2 & 011234 51 ?0@ :5)23G)(9 F2./74 (;= 4.2 ).;2 )2;/47 5; 472
6(94.4.5; (;= 6G9.1.3(4.5; 51!,(:<)(82 (;= 454() 69542.;
?0@
分子量
质量分数K#
（?0@，柠檬酸盐）
相比 !( ! 4
收率
K#
纯化
因子
A"" &L%*，!B%* "%LB &A%AB B%"" LB &%!
!"%"，!A%& "%CC AL%&* !%*! LC &%A
!&%"，!*%" &%"! AA%*! !%!M LC &%A
& """ &+%"，&C%" &%"! &L%M* &%"M L* &%C
&M%*，&C%* &%&C !L%+B &%"M LM &%C
&C%*，&L%* &%"M AC%CM &%B! LC &%M
B B*" &&%"，&A%" "%LC "%+C "%BC A" &%*
&!%*，&A%* "%C* "%*! "%B* B& &%B
&A%"，&*%* "%L& "%A* "%!* !L &%+
C """ &"%*，&!%" &%!* "%!! "%!! !! &%"
&!%"，&!%* "%L+ "%&" "%&B L "%C
&B%*，&B%* &%"* "%"+ "%&! + "%+
低分子量（?0@ A""和 ?0@ & """）的双水相体系
结线长度对淀粉酶的分配的影响不大。而高分子量
（?0@ B B*"和 ?0@ C """）则随着结线长度的增加，!,
淀粉酶和总蛋白都更多的分配于下相。可能与大分
!""A年 !月 郅文波等：?0@,柠檬酸盐双水相体系纯化!,淀粉酶及模型构建 ·AL·
万方数据
子量的 !"# 浓度增加造成的空间排阻作用有关。
为降低系统粘度和节约原料，优先选择结线长度短
的 !"# $%%%&柠檬酸盐双水相体系进行研究。 ’() *+对!&淀粉酶分配的影响（图 )） 实验在 !"#$ %%%&柠檬酸盐双水相体系中进
行，*+控制在 ,(’、-(%、-(-和 .(’。*+调节是通过
盐相中柠檬酸钠和柠檬酸的比例来实现。在 *+
.(/条件下，成相盐完全由柠檬酸钠组成。随着 *+
的从 .(/降低到 ,(’，相同组成的结线长度也随之降
低，在 *+ ,(’时体系不分相。
—!—短结线；—"—中等结线；—#—长结线
图 ) *+对!&淀粉酶和总蛋白分配系数和!&淀粉酶纯化因子的影响
012() "33456 73 *+ 78 *9:616178 57433151486; 73!&9<=>9;4（!9），6769> *:76418（!6）98?!&9<=>9;4 *@:131596178 39567: 18 !"# $%%%&516:964 ;=;64<; !&淀粉酶的分配系数随着 *+ 的升高而增加， *+为 -(-达到最大值；总蛋白的分配系数随 *+的 升高而持续增加，但幅度很小。*+变化改变了两相 间的电位差和蛋白质的带电状态，从而改变蛋白质 的分配。由于!&淀粉酶的等电点为 ,，因而随着 *+ 的增加，!&淀粉酶所带负电荷量也增加，导致!&淀粉 酶更多地分配于上相［’］。但 *+进一步增加，总!& 淀粉酶收率的下降，可能是!&淀粉酶在高 *+条件 下酶活降低，导致以酶活测定的!&淀粉酶分配系数 下降。由于!&淀粉酶和总蛋白分配的相互作用，在 *+ -(% 条件下纯化因子最高。 ’(/ 发酵液上清加入量对!&淀粉酶分配的影响 通过向不同结线长度的 !"#$ %%%&柠檬酸盐体
系中加入不同量的发酵液上清研究了对!&淀粉酶纯
化因子的影响，结果如图 /所示。图中的最大上清
加入量组（$%%A组）为直接向发酵液上清中加入成 相组分构成双水相体系。双水相体系的操作容量随 着结线长度增加而增加。短结线和中等结线组当上 清加入量超过最大值的 .,A后，纯化倍数下降，说 明体系已被蛋白饱和。而长结线组在达到最大上清 加入量后也未出现饱和。说明双水相体系的操作容 量较大。但为了实现更好的分离以及降低体系粘 度，优先选择具有短结线长度的 !"#$ %%%&柠檬酸
盐体系和 ,%A B .,A最大上清加入量进行研究。
’(, 中性盐 C9D>的加入对!&淀粉酶分配的影响
实验考察了低!&淀粉酶分配系数的 !"# ) ),%&
柠檬酸盐和 !"# E %%%&柠檬酸盐体系中，在 C9D>存
在下!&淀粉酶的分配，结果如图 /。随着 C9D>浓度
的增加，!&淀粉酶和总蛋白的分配系数增加，!&淀粉
酶分配系数的增加更为显著。
—!—短结线；—"—中等结线；—#—长结线
图 / 发酵液加入量对!&淀粉酶纯化的影响
012(/ "33456 73 ;@*4:896986 9??16178 F7>@<4 78!&9<=>9;4
*@:131596178
在 !"# ) ),%&柠檬酸盐体系中，当 C9D>浓度为
/A时，选择性最高，纯化倍数为 $(G，在 !"# E %%%& 柠檬酸盐体系中与 !"# ) ),%&柠檬酸盐体系中也类 同，但需要 C9D>浓度更高，为 EA（见图 ,）。 氯化钠的加入一方面会增加两相间的疏水性差 异，导致疏水性强的蛋白质更多分配与上相，另一方 面当盐浓度超过$ B , <7>HI后，由于盐析作用，蛋白
·,%· 生物加工过程 第 ’卷第 $期 万方数据 质也倾向于分配到上相，而且对于不同的蛋白质分 配系数增加程度不同，因而可以用来改善分离效果。 —!—!"；—"—!#；—#—纯化因子 图 ! "#$%质量分数对!&淀粉酶和总蛋白分配的影响
’()*! +,,-./ 0, "#$% #11(/(02 02 3#4/(/(02 #21 354(,(.#/(02 0,!& #67%#8- #21 /0/#% 340/-(2 9*: 响应面方法的建模与优化 双水相分离体系的能否建立及分离效果的决定 因素很多且敏感，因此采用正交法进行较大范围的 非连续跳动搜索优化难于得出最优化条件，因此，为 了进一步优化实验条件以及明确体系组成对纯化结 果的影响，在上述实验结果的基础上，采用响应面方 法对 ;+< = =!>&柠檬酸盐双水相体系纯化!&淀粉酶 进行建模分析。 响应面方法是一套有效的统计学试验方法，包 括实验设计、建模、因子效应评估及寻求最佳操作条 件 =个方面。与其它实验设计方法相比，响应面方 法可以建立目标值与多个操作参数之间的连续的相 应曲面，具有直观、高效、可靠等优点［??］。 在高分子量 ;+<（;+< = =!>和 ;+< @ >>>）&柠檬 酸盐体系中通过加入 "#$%改变体系的离子强度和
疏水性差异，可以进一步的提高!&淀粉酶的分离效
果。因此本文选择对 ;+< = =!>&柠檬酸盐双水相体
系纯化!&淀粉酶进行模型构建和分析。
本文采用中心组合设计方法进行试验设计，该
设计是响应面方法中应用最多的一种设计方法，具
有正交性、一致精度和可旋转性的优点。它包括 =
个部分：9$因子设计，中心点处 2>重复试验和 9$ 轴
点试验，其中 $代表变量的个数。选择 ;+< = =!>， 柠檬酸盐和 "#$%浓度作为进行试验设计 =个变量。
在 =个变量的情况下，中心组合设计的实验点位于
立方体的 @个顶点和距中心点 A!的 :个轴点以及
中心点处的 : 个重复［??］。中心点根据上述的单因
素试验结果进行选择，同时需要考虑体系成相的要
求。根据试验结果计算出 !#，! /，纯化因子和收率
的数值并列于表 9，相应的回归模型的参数列于表
=。采用方差分析（B"CDB）通过 %&检验确定显著性
因子。回归模型也通过 %&检验确定回归的显著性
和确定系数（&9）模型的回归分析结果显示了这些
模型的显著性以及在模型和实验数据之前存在着良
好的相关性。
表 9 中心组合设计的试验结果
E#F%- 9 G-85%/8 0, -H3-4(6-2/8 (2 /I- .-2/4#% .06308(/- 1-8()2
试验号 纯化因子 %2 !# %2 ! / 收率JK
? ?*@L >*=: M >*L= !:
9 ?*@> =*9= >*NL O!
= 9*>= ?*!@ M >*>9 LN
N ?*:@ N*!L ?*>= O@
! ?*OO ?*N@ M >*N! @=
: ?*L> 9*O9 >*9N O!
L ?*!@ =*?9 >*!= O!
@ ?*9= N*N9 ?*N@ OO
O ?*O@ 9*=! >*=O @N
?> ?*=O N*9O >*L> OO
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?9 ?*N? N*N@ ?*9! O@
?= ?*@N M >*9@ M ?*?! N>
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?: ?*O@ N*?N >*9> O@
?L ?*O? =*OL >*9: O@
?@ ?*OL =*O> >*9> O@
?O ?*O= =*O> >*9N O@
9> 9*>> =*OO >*9> O@
表 = 模型参数和统计学意义
E#F%- = ;#4#6-/-48 0, 601-% #21 8/#/(8/(.#% /-8/ 4-85%/8
参数# 纯化因子 %2 !# %2 ! / 收率
常数 ?*O:! N*>?N >*99>? >*O!>@
’? M >*?=L? >*N>>> >*??!? >*>@@L?
’9 M >*?9:@ >*:N>= >*N9!! >*>!9?!
’= M >*?>NL ?*9?9 >*!9OO >*?O=9
’?9 M >*??!> M >*??@@ M
’?= M M >*=O>> M >*>L:9! M >*>@@@?
’?? M >*>@@>N M >*9@O: >*??N? M >*>=@?9
’99 M >*>O?!L M >*?OON >*??ON M
’== M >*>L9?= M >*L9:9 M >*?==N M >*?=@?
% D#%5- 9>*:!NL :9*9=>> ?NN*LNON !>*O@@L
(4 P % >*>>>? >*>>>? >*>>>? >*>>>?
&9 >*O9=N >*OL=9 >*OO>: >*O!O9
# ’?：;+< 浓度；’9：柠檬酸盐浓度；’=："#$% 浓度；’??：;+<浓 度平方；’99：柠檬酸盐浓度平方；’==："#$%浓度平方；’?9：;+<
浓度 Q柠檬酸盐浓度；’?=：;+<浓度 Q "#$%浓度。 9>>N年 9月 郅文波等：;+<&柠檬酸盐双水相体系纯化!&淀粉酶及模型构建 ·!?· 万方数据 !"# 模型验证 综合考虑!$淀粉酶的收率和纯化因子作图 %，
图 %的灰色区域具有较高的纯化倍数和收率，同时
&’(浓度较低，粘度较低，从中选择两个点对上述模
型进行验证。结果如表 )所示。模型预测值与试验
值吻合良好，说明模型可以有效地用于双水相体系
的设计和选择。
! 结 论
本文研究了利用双水相方法从发酵液上清中分
离纯化!$淀粉酶的可行性，双水相方法可以有效地 用于!$淀粉酶的分离，通过研究各种因素对纯化过
程的影响，在单步操作过程可以实现接近 !倍的纯
化，除去部分杂蛋白。由于!$淀粉酶的表达量较高， 占上清总蛋白的 )*+左右。进一步提高纯化倍数 较为困难。采用了响应面方法进行分析、预测和优 化，从而使纯化倍数进一步提高到 !"*，收率也提高 到 ,*+左右。采用响应面方法可以有效地对系统 选择和设计进行指导，便于进行深入的研究工作。 图 % -+./01质量分数下!$淀粉酶纯化倍数和收率的覆盖图
234"% 56781/9 :1;<= ;>!$/?91/=7 :@83>3A/<3;B >/A<;8= /BC 9371C= /< -+ ./01 A;BA7B<8/<3;B 表 ) 试验数据和模型预测值的对比 D/E17 ) 0;?:/83=;B ;> 7F:783?7B1 87=@1<= G3<H ?;C71 :87C3A<7C 6/1@7=<brI "A #$
J
" # $模型预测的纯化倍数和收率 !"**（K,"K+） !"**（K,"!+） 实验结果 !"*!（K)"%+） !"*!（K-"*+） !"*L（KK"!+） !"*L（K#")+） !"*L（K,"-+） !"*L（K#"L+） I：MM+ &’( L L-*，M)+柠檬酸盐，-+ ./01；J：M*"-+ &’( L L-*，M-+柠檬酸盐，-+ ./01；"A每组平行进行 L次试验，分别表示 为"，#和$。
参考文献：
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［L］ I1E78<<=;B &IQ &/8<3<3;B ;> A711 :/8<3A17= /BC ?/A8;?;17A@17=［U］Q .7G
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·-!· 生物加工过程 第 !卷第 M期
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