全 文 ：《食品工业》2015 年第36卷第 8 期 122
工艺技术
龙须菜多酚类物质的双水相系统纯化及抗氧化研究
裘晨阳，吴祥庭*
温州大学生命与环境科学学院（温州 325027）
摘 要 采用PEG/MgSO4的双水相系统纯化龙须菜多酚，探究萃取机理及其抗氧化活性。以龙须菜为原料, 龙须
菜多酚萃取率为指标; 通过单因素和响应面法设计, 研究不同分子量PEG 和用量、MgSO4用量、温度、pH对龙须
菜多酚回收率的影响, 通过分析龙须菜多酚还原力和DPPH, 评价不同浓度龙须菜多酚的抗氧化活性, 并参照VC和
BHT抗氧化进行比较。再通过对其糖类和蛋白质分配系数的测定排除两者对与多酚回收率的影响。结果显示最佳
条件: PEG 6000浓度为25%, MgSO4浓度为10%、萃取温度32 ℃, pH 6, 得到龙须菜多酚萃取率为84.12%±0.47%。龙
须菜中总糖以及蛋白质对于该双水相系统的干扰较小, 龙须菜多酚有较强的还原能力和清除DPPH自由基能力, 龙
须菜多酚是一个潜在的天然安全和有效的抗氧化剂。
关键词 双水相体系; 龙须菜; 多酚; 响应面法; 抗氧化
Study on Extraction by Aqueous Two-phase System and Antioxidant Activity of
Polyphenols from Gracilaria lemaneiformis
Qiu Chen-yang, Wu Xiang-ting*
School of Life & Environmental Science, Wenzhou University (Wenzhou 325027)
Abstract Antioxidation capability and the extraction mechanism of the separation-purification of polyphenols from
Gracilaria lemaneiformis in aqueous two-phase systems was explored. Polyphenols from Gracilaria lemaneiformis was taken
as an index to optimize the conditions for the extraction of polyphenols from Gracilaria lemaneiformis. The effect of each
factor such as weight of PEG , the amount of PEG, the amount of MgSO4, temperature, pH had been studied with
single factor and response surface methodology. The antioxidant activity of different concentration polyphenols were assessed
through reducing power assay, scavenging effects on DPPH radicals and results were compared to one reference antioxidant
BHT and VC. Through the determination of the carbohydrate and protein distribution coeffi cient of the effect of exclusion and
polyphenol extraction rate, making the results more real and reliable. The result showed that the best conditions were as
followings: the amount of PEG 6000 was 25%, the amount of MgSO4 was 10%, the extracting temperature was 32 ℃, pH was
6 and the extraction fi eld was 83.12%±0.47%. The interference was smaller on aqueous two-phase system from the
carbohydrate and protein. The polyphenols from Gracilaria lemaneiformis had strong antioxidant activity, the polyphenols
from Gracilaria lemaneiformis was a potential product of natural safe and effective antioxidant.
Keywords aqueous two-phase system; Gracilaria lemaneiformis; polyphenol; response surface analysis; antioxidant activity
龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）属于红 藻门（Rhodophta）杉藻目（Gigartinales）江篱属
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工艺技术
*通讯作者；基金项目：浙江省科技项目（2013C32107）
（Gracialaria）的一种大型经济红藻[1]。原产于我国
山东省和辽宁省，近年来在福建、浙江洞头等沿海养
殖成功并大量种植[2]，多酚类物质是一族在结构中含
有酚的植物次生代谢产物，红藻中多酚类化合物是一
种重要的生物活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抑
菌、降压等生物活性[3-4]，而对龙须菜的多酚萃取则没
有报道。双水相萃取根据组分在两水相间分配选择性
实现分离，因其条件温和，易于操作和放大而应用广
泛。利用常见的龙须菜研究多酚在聚乙二醇/MgSO4双
水相体系中的分配行为，可获得最佳多酚萃取率的工
艺条件，再对该双水相体系对龙须菜中总糖以及蛋白
质的回收率做了探究，较好的排除了两者对于多酚回
收率及抗氧化的干扰；通过单因素试验和响应面法，
探讨了聚乙二醇种类及用量、MgSO4用量、温度、pH
等对双水相系统及龙须菜多酚回收率的影响，对于通
过该双水相体系所得多酚，再研究其抗氧化活性，旨
在对龙须菜多酚抗氧化因子的研究，为龙须菜多酚的
规模化提取和应用打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料、仪器与设备
龙须菜：市售；二苯基苦味酰基苯肼（DPPH·）与
BHT：美国Sigma公司；不同分子量的聚乙二醇（PEG
2000，PEG 4000，PEG 6000）及其他试剂购于国药集
团（均为分析纯）。
Scientz-10N冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份
有限公司；HH-S型数显水浴锅：郑州长城科技工贸
有限公司；紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限
公司。
1.2 方法
1.2.1 标准曲线的绘制
精密称取没食子酸50 mg，用甲醇定容在50 mL的容
量瓶中，制成1 mg/mL的没食子酸标准溶液。取质量浓
度为1 mg/mL的没食子酸溶液0.005，0.01，0.015，0.02，
0.025和0.04 mL在10 mL的试管内，然后加入0.1 mL福
林酚试剂，等2~3 min后加2% Na2CO3 2 mL，后用蒸馏
水定容5 mL，在25 ℃反应30 min后，在760 nm测吸光
度[5]，以没食子酸的质量浓度X（mg/L）对吸光度Y进
行线性回归，得标准曲线，回归方程为：Y=0.116 4X+
0.036 2，R2=0.999 4。
1.2.2 龙须菜浸提液的制备
将龙须菜洗净，置于干燥机中干燥，粉碎得龙须
菜粉末。称取20 g龙须菜粉末，定容至1 000 mL。将其
倒入敞口烧杯中，于50 ℃下加热5 h，再浓缩至100
mL。待其冷却至室温后，过滤取清液，即为所需的
龙须菜浸提液。此多酚粗提物用无水乙醚和三氯甲
烷分别进行萃取，取水层旋转蒸发仪浓缩后，即为
龙须菜多酚。多酚含量采用AOAC的标准分析方法测
定[6]。
1.2.3 双水相系统的构建
于具塞试管中分别加入4 mL一定浓度的PEG与
1 mL的龙须菜萃取液，1 mL的蒸馏水得双水相系统，
调整pH，混匀后置于一定温度下静置20 min。待其充
分萃取并有明显分层后，将上下层分别取出，记录上
下层的体积并测出各自的多酚含量。回收率公式：
Y=RK/(RK+1) （1）
式中：K=Ct/Cb；R=Vt/Vb；Ct，Cb分别为上、下相
龙须菜多酚质量浓度，mg/mL；Vt，Vb分别为上、下
相体积，mL。
1.2.4 双水相中PEG分子量的确定
以pH 6，温度为40 ℃为基准，分别将质量分数
为10%的MgSO4溶液，质量分数为24%的不同分子量
的PEG （PEG 2000，PEG 4000，PEG 6000）构建成
双水相系统，测定不同情况下的龙须菜多酚的回收率
Y，进而选出最佳回收率情况下的PEG分子量。
1.2.5 响应面优化试验的设计
根据1.2.4的试验结果，首先选取所用PEG的分
子量，从而确定所构建的双水相系统。再利用Box-
Behnken响应面法对于结果进行优化。通过查阅相关
文献资料以及对于试验结果的预期，确定以PEG 6000
溶液浓度（X1），MgSO4溶液（X2），温度（X3），
pH（X4），在三水平四因素上进行优化研究，以龙须
菜的多酚萃取率为最终指标，构建数学模型且得到优
化条件，因素水平见表1。
表1 Box-Behnken响应面设计试验因素水平
水平
因素
X1 PEG 6000浓度/%
X2 MgSO4浓度/%
X3 温度/℃ X4 pH
-1 20 9 30 5
0 24 10 40 6
1 28 11 50 7
1.2.6 双水相上下层总糖与蛋白质的测定
总糖成份测定：分别取上下相液体，用DNS法测
定糖类浓度[7]，再根据所构建双水相系统的上下相的
体积以及两者测出的浓度，计算龙须菜上下层总糖
的比值。
蛋白质成份测定：分别取上下相液体，用考马斯
亮蓝法测定蛋白质浓度[8]，再根据所构建双水相系统
的上下相的体积以及两者测出的浓度，计算龙须菜上
下层蛋白质的比值。
1.2.7 抗氧化能力的评价
龙须菜多酚的还原能力[9]：在10 mL离心管内加
入2.5 mL不同质量浓度龙须菜多酚溶液（0.5，1.0，
1.5，2.5，3.5和4.5 mg/mL）与2.5 mL 0.2 mol/L磷酸钠
缓冲液（pH 6.6）和2.5 mL 1%铁氰化钾混合，50 ℃水
浴保温20 min后加入2.5 mL 10 g/100 mL三氯乙酸，加
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盖混匀，将混和物在3 000 r/min条件下离心10 min，
移取5.0 mL上清液于试管中，再加5.0 mL去离子水和
1 mL 0.1%三氯化铁摇匀混合，静置10 min后用分光光
度计在波长700 nm处测吸光度，其吸光度的大小即反
映了其还原能力的强弱，用VC和BHT作比较。每种浓
度均做三次平行试验。
龙须菜多酚对DPPH清除力的测定[10]，分别取质
量浓度为0.03，0.06，0.09，0.12，0.15和0.18 mg/mL
的龙须菜多酚溶液2.0 mL，加入2.0 mL用无水乙醇配
制的0.8 mmol/L DPPH溶液，用力振摇混匀后在黑暗环
境中静置30 min，用UV-722型分光光度计于波长517
nm处测定其吸光度，用VC和BHT作比较。计算DPPH
清除率。
DPPH清除率=（1-(Ax-Ax0)/A0）×100% （2）
式中：Ax-加入样品溶液后的吸光度；Ax0-样品溶
液本底（样品+无水乙醇）的吸光度；A0-空白对照液
（DPPH溶液+相应溶剂）的吸光度，以样品溶剂+无
水乙醇调零。
2 结果与分析
2.1 不同分子量的PEG选择
通过相图的构建，分别选择质量分数为10%的
MgSO4溶液，质量分数为24%的不同分子量的PEG
（PEG 2000，PEG 4000，PEG 6000）构建成双水相系
统，令其在pH为7，温度为40 ℃的情况下萃取龙须菜
中的多酚，在根据双水相系统中上下相的体积以及所
测的浓度分别计算K，R以及Y，结果如表2所示。查
阅相关资料可得随着PEG分子量的增大，其所含极性
基团数逐渐变少，进而使得其亲水性以及极性减小，
而双水相系统中的MgSO4溶液富含大量极性分子，使
其越易分层。另外，合适分子量的PEG的极性与龙须
菜多酚的性类似，有利于龙须菜中多酚的萃取。由表
2所示结果可得分子量为6 000 Da的PEG的R，Y值最
大。因此可以得知分子量为6 000 Da的PEG为最适，
可被用于之后的响应面法试验。
表2 不同分子量PEG对龙须菜多酚萃取的影响
PEG分子量/Da 体积比R 分配系数K 多酚回收率Y/%
2 000 1.174 1.61 65.41
4 000 1.128 2.05 69.81
6 000 1.222 2.30 73.76
2.2 利用响应面法萃取多酚的回收率，模型的拟合以
及效果评价
采用Box-benhnken响应面设计萃取龙须菜多
酚，萃取率结果见表3，通过SAS 9.1软件对试验龙
须菜多酚萃取进行分析，由表4和表5可知，模型项
p=0.009 0，校正决定系数R2=0.829 1，说明二次响应
面回归模型高度显著，回归方程拟合程度良好，模
型可靠。通过SAS软件得到响应变量Y和变量之间的
四元二次多项式表示如下：Y=83.200 0+2.873 3X1-
0.570 8X2- 2.935 0X3+1.527 5X4-3.871 3X12-0.007 5X1X2-
8.862 5X22+2.262 5X1X3-4.605 0X2X3-2.746 3X32+
1.670 0X1X4+0.865 0X2X4-3.212 5X3X4-8.292 5X42。
表4中“Pr＞|t|”值反映影响的显著性及变量之间
的相互作用关系，自变量一次项X2的“Pr＞|t|”值小
于0.01，说明MgSO4浓度对龙须菜多酚萃取率的影响
明显显著，而二次项X22，X42项“Pr＞|t|”值同样均小
于0.01，说明MgSO4浓度和pH这两个因素各自的叠加
作用强，对试验结果影响明显显著。X1，X2，X3，X4
的“Pr＞|t|”分别是X2＜X4＜X3＜X1，可见影响程度
MgSO4浓度最大，随后依次为pH、萃取温度和PEG
6000浓度。同时分析发现，这四个因素对试验的
影响是非线性的。X2X3的“Pr＞|t|”＜0.05，说明X2X3
交互作用对响应值有一定影响，与方差分析结果
一致。
表3 Box Behnken试验设计及响应值
试验号
因素
Y总多酚回收/%
X1 X2 X3 X4
1 -1 -1 0 0 70.53±0.67
2 -1 1 0 0 63.45±0.61
3 1 -1 0 0 81.08±0.58
4 1 1 0 0 73.97±0.45
5 0 0 -1 -1 73.49±0.59
6 0 0 -1 1 82.60±0.48
7 0 0 1 -1 71.73±0.77
8 0 0 1 1 68.00±0.58
9 -1 0 0 -1 71.84±0.72
10 -1 0 0 1 69.16±0.53
11 1 0 0 -1 67.63±0.60
12 1 0 0 1 71.47±0.59
13 0 -1 -1 0 67.46±0.48
14 0 -1 1 0 69.73±0.65
15 0 1 -1 0 80.56±0.53
16 0 1 1 0 64.41±0.49
17 -1 0 -1 0 75.48±0.58
18 -1 0 1 0 68.47±0.87
19 1 0 -1 0 78.69±0.43
20 1 0 1 0 64.73±0.68
21 0 -1 0 -1 63.37±0.72
22 0 -1 0 1 67.46±0.57
23 0 1 0 -1 61.42±0.46
24 0 1 0 1 83.68±0.95
25 0 0 0 0 68.97±0.81
26 0 0 0 0 70.85±0.62
27 0 0 0 0 69.13±0.43
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表4 响应面分析优化后模型的系数检验
误差来源 自由度 系数估计 标准误差 t值 Pr > |t|
常量 14 -1 389.271 7 336.283 0 -4.13 0.001 4
X1 1 7.583 3 8.361 0 0.91 0.382 3
X2 1 189.954 2 40.846 4 4.65 0.000 6
X3 1 7.078 5 3.076 7 2.3 0.040 2
X4 1 95.217 5 33.443 8 2.85 0.014 7
X1X1 1 -0.242 0 0.112 2 -2.16 0.052 0
X1X2 1 -0.001 9 0.518 2 0 0.997 2
X2X2 1 -8.862 5 1.795 1 -4.94 0.000 3
X1X3 1 0.056 6 0.051 8 1.09 0.296 5
X2X3 1 -0.460 5 0.207 3 -2.22 0.046 3
X3X3 1 -0.027 5 0.018 0 -1.53 0.152 0
X1X4 1 0.417 5 0.518 2 0.81 0.436 1
X2X4 1 0.865 0 2.072 8 0.42 0.683 8
X3X4 1 -0.321 3 0.207 3 -1.55 0.147 1
X4X4 1 -8.292 5 1.795 1 -4.62 0.000 6
表5 模型回归方程方差分析
来源 自由度 平方和 均方差 F值 Pr>F
模型 14 1 000.276 0 71.491 7 4.16 0.009 0
残存 12 206.225 9 17.185 5
总离差 26 1 206.501 9
相关R2 0.829 1
图1 三维响应面变量
根据回归作响应面图，两个变量固定在其各自的
零级，即中心值处，在另外两个连续变量下得到了
龙须菜多酚的萃取率，分析所得预测值被限制在最
小的椭圆内。由图1（A）分析，当X3=0，X4=0时，
X1增大，萃取率伴随PEG浓度在20~24.83范围内不断
增大，MgSO4浓度在9~10.17范围内萃取率增大，直
到到达最大值后，PEG浓度继续增加，萃取率反而减
小。当X2=0，X4=0，如图1（B）所示，随着PEG浓度
和温度的增加，龙须菜多酚萃取率先增后减，在PEG
浓度为24.83%，温度为32.46 ℃时，萃取率最大。图
1（C）显示，在X2=0，X3=0时，龙须菜多酚萃取率与
PEG浓度以及pH之间的关系。PEG浓度约为24.83%，
pH为6.27时，萃取率最大。在图1（D）中，PEG浓
度和pH为中心值水平，随着MgSO4浓度增加，龙须菜
多酚萃取率在温度的不断延长下先增后减，在MgSO4
浓度为10.18%，温度为32.46 ℃时，萃取率最大。
如图1（E）所示，X1，X3同时为0时，MgSO4浓度为
10.18%，pH为6.27时，萃取率最大。图1（F）显示
在X1=0，X2=0时，温度为32.46 ℃时，pH为6.27时，
萃取率最大。得到萃取龙须菜多酚的最佳条件为PEG
6000浓度为24.834 7%，MgSO4浓度为10.176 5%，萃
取温度32.467 3 ℃，pH 6.268 2，龙须菜多酚萃取率的
预测值为84.760 0%。
2.3 模型的优化与验证
依据回归模型确定最佳工艺参数为：PEG 6000
浓度为24.834 7%，MgSO4浓度为10.176 5%，萃取温
度32.467 3 ℃，pH 6.268 2，龙须菜多酚萃取率的预
测值为84.760 0%；依据实际情况，选择PEG 6000
浓度为25%，MgSO4浓度为10%，萃取温度32 ℃，
pH 6进行三次验证试验，得到龙须菜多酚萃取率为
84.12%±0.47%与预测值接近。
2.4 双水相上下层成份的比较
从表6得知，双水相上层集中了较多的多酚（84%），
较少的总糖（24%）和蛋白质（31%），主要是因为双水
相上层含较多的PEG网状体系，使得多酚较好地融入
其中，而下层含较多的MgSO4而盐层，糖类和蛋白质
融入较多，这样取含多酚较多而含较少总糖和蛋白质
的双水相上层再进行萃取多酚，有利于更好的纯化。
表6 双水相成份测定（n=3）
双水相 多酚/% 总糖/% 蛋白质/%
上层 84±2 24±3 31±2
下层 16±2 76±3 69±2
2.5 龙须菜多酚抗氧化活性
2.5.1 龙须菜多酚还原能力
由图2可知，低质量浓度（小于3.5 mg/mL）龙须
菜多酚的还原能力比VC和BHT都要小，龙须菜多酚
的还原能力随着浓度的增大而增大，高质量浓度（大
于3.5 mg/mL）龙须菜多酚的还原能力与VC相当，比
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BHT还原能力要大，可见，龙须菜多酚有较大的还原
能力。
图2 不同质量浓度的龙须菜多酚与VC的还原能力
比较
2.5.2 龙须菜多酚对DPPH清除力的测定
龙须菜多酚，VC和BHT对DPPH清除效果如图3
所示，在试验浓度范围以内，不同浓度的龙须菜多
酚对DPPH清除率随浓度的提高而增大。在低质量浓
度（小于0.1 mg/mL）时，龙须菜多酚比VC和BHT对
DPPH清除率要小，而高质量浓度（大于0.1 mg/mL）
时，龙须菜多酚与VC对DPPH清除率相当，比BHT对
DPPH清除率要大，试验结果龙须菜多酚具有一定的
抗氧化能力，可待进一步开发成天然抗氧化剂。
图3 不同质量浓度的龙须菜多酚、VC和BHT对
DPPH的清除效果
3 结论
利用响应面法得该双水相系统获得最大龙须菜多
酚回收率的条件为选择PEG 6000浓度为25%，MgSO4
浓度为10%，萃取温度32 ℃，pH 6，得到龙须菜多
酚萃取率为84.12%±0.47%。龙须菜中总糖以及蛋白
质对于该双水相系统的干扰较小，因此所获得的多酚
回收率可信度较高。试验结果表明，龙须菜多酚的还
原能力与其浓度成正相关性，在低于3.5 mg/mL时还
原力比VC和BHT较弱，高于3.5 mg/mL时还原力与VC
相当，比BHT还原能力要强；龙须菜多酚对DPPH清
除率随浓度的提高而增大，在低于0.1 mg/mL时VC和
BHT对DPPH清除率要小，高于0.1 mg/mL时龙须菜多
酚与VC对DPPH清除率相当，比BHT对DPPH清除率要
强，龙须菜多酚具有一定的抗氧化能力，可待进一步
开发成天然抗氧化剂。
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信 息
据外媒报道，不少人或会认为饮酒时一次性喝太多会
比每日少量饮酒更伤身，但英国一项实验发现，这2种方式
饮酒其实同样伤害身体。若想减少对身体损害，最重要还
是控制饮酒的分量。
同为传染病医生的英国孪生兄弟克里斯及亚历山大，尝
试2种截然不同的饮酒方式，以测量两者对身体有何分别。
实验期间为1个月。克里斯每天饮30 mL纯酒精饮品，亚历山
大则每周六一次性喝210 mL，每周2人饮酒的分量相同。
结果显示，2种饮酒方式同样影响身体。克里斯和亚历
山大饮酒后，体内的细胞激素及介白素数量都上升，这些
物质会导致炎症，以至癌症及心脏病等。
然而，2种饮酒方式仍有分别，一次饮大量者血液内的
细菌性内毒素分量较高，因此较伤肠胃。
来源：中国新闻网 2015-05-19
每日少量饮酒不伤身？研究称少喝多喝都对健康无益